干細(xì)胞移植治療阿爾茨海默病的研究進(jìn)展

衣紅杰，王蕾，孟慶松，王海峰

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)，濟(jì)南 250014；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科，濟(jì)南 250001)

阿爾茨海默病(Alzheimer′s disease，AD)是一種以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和行為損害為特征的神經(jīng)退行性疾病，其起病隱襲、進(jìn)展緩慢，臨床表現(xiàn)為記憶功能障礙、失語(yǔ)、失用、失認(rèn)、視空間能力損害、抽象思維和計(jì)算力損害、人格和行為異常等。AD病理復(fù)雜，其發(fā)病機(jī)制主要有膽堿能假說(shuō)、Tau蛋白學(xué)說(shuō)、淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)學(xué)說(shuō)等，但隨著研究深入，學(xué)者還提出了多種假設(shè)：線粒體功能障礙[1]、小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞等介導(dǎo)的免疫損傷[2-4]、載脂蛋白Eε4等位基因的變異[5]等引起的病理改變。其主要病理特征為淀粉樣斑塊和神經(jīng)原纖維纏結(jié)；此外，還可見神經(jīng)束絲、纖細(xì)的軸突、伴發(fā)的星形膠質(zhì)細(xì)胞增生和小膠質(zhì)細(xì)胞活化[6]。這些病理過(guò)程的發(fā)展結(jié)果包括神經(jīng)變性、突觸丟失和神經(jīng)元肉眼可見的萎縮。因此，臨床抗AD藥物或抗體的研發(fā)主要集中在抗氧化、清除腦中的β淀粉樣蛋白(amyloid β-protein，Aβ)沉積以及調(diào)節(jié)Tau蛋白的磷酸化三個(gè)方面[7-9]。目前，普遍使用的治療藥物為膽堿酯酶抑制劑、N-甲基-D-天冬氨酸受體選擇性拮抗劑，此外還有石杉?jí)A甲和奧拉西坦等，但不管何種藥物，均是通過(guò)消除或阻止淀粉樣蛋白沉積和過(guò)度磷酸化的Tau蛋白來(lái)緩解AD患者癥狀，而不能修復(fù)其退化的神經(jīng)元，同時(shí)還存在不可避免的不良反應(yīng)。雖然近年針對(duì)AD的病理了解更深入，但仍未研發(fā)出針對(duì)此病的具體靶點(diǎn)藥物，不能逆轉(zhuǎn)病程發(fā)展，因此干細(xì)胞移植治療應(yīng)運(yùn)而生?，F(xiàn)就干細(xì)胞移植治療AD的研究進(jìn)展予以綜述。

1 干細(xì)胞移植簡(jiǎn)述

20世紀(jì)80年代，Lindvall等[10]首次將干細(xì)胞移植應(yīng)用到帕金森病中，并取得了良好的治療效果；隨后學(xué)者逐漸將該技術(shù)應(yīng)用于其他變性病中，如AD、肌萎縮側(cè)索硬化癥和亨廷頓病[11]。干細(xì)胞具有無(wú)限或長(zhǎng)期的自我更新能力，且可以朝某一方向分化，在體內(nèi)外均可被誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元，其為從根本上治療AD提供了新的可能[2]。按不同的發(fā)育階段分類，干細(xì)胞可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和成體干細(xì)胞。目前，研究較廣泛的干細(xì)胞主要有間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)、神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs)、ESCs和誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，IPSCs)。干細(xì)胞種類多樣，來(lái)源廣泛，易于分離，可操作性高，選擇合適的干細(xì)胞類型，可部分或完全避免免疫排斥反應(yīng)帶來(lái)的移植后并發(fā)癥，降低移植風(fēng)險(xiǎn)。

2 干細(xì)胞移植在治療AD中的應(yīng)用

2.1MSCs MSCs是從骨髓、臍帶、脂肪組織、外周血、羊水、肌肉、肺等器官和組織中分離出來(lái)的多能細(xì)胞[12-13]，沒(méi)有嚴(yán)重的倫理或技術(shù)問(wèn)題。MSCs是一組專能干細(xì)胞的總稱，具有易于分離和獲取、高度增殖性、可分化多種類細(xì)胞，以及調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的特點(diǎn)[2,14]，臨床常將其作為干細(xì)胞移植治療的首選干細(xì)胞類型。目前，以骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)和臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(umbilical cord mesenchymal stem cells，UCMSCs)等研究最為普遍。

2.1.1BMSCs 已有研究表明，神經(jīng)炎癥是導(dǎo)致AD認(rèn)知障礙的主要原因之一[15]。小膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的主要免疫細(xì)胞之一，在神經(jīng)炎癥中起重要作用?，F(xiàn)在大量關(guān)于干細(xì)胞移植治療AD的研究均將小膠質(zhì)細(xì)胞作為靶點(diǎn)。小膠質(zhì)細(xì)胞具有促炎和抗炎作用，促炎因子會(huì)加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷，但抗炎因子會(huì)幫助改善神經(jīng)功能[16-17]。AD患者腦內(nèi)可見活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞是Aβ斑塊的一種有效激活劑，可通過(guò)慢性促炎反應(yīng)作用于Aβ斑塊，加快Aβ沉積。而Aβ又可以激活小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生細(xì)胞因子和神經(jīng)毒素，導(dǎo)致神經(jīng)元損傷和突觸丟失，促進(jìn)神經(jīng)變性[18]，由此形成惡性循環(huán)。小膠質(zhì)細(xì)胞可以通過(guò)轉(zhuǎn)換表型使其抗炎作用占主導(dǎo)地位，而這種轉(zhuǎn)換需通過(guò)干細(xì)胞移植實(shí)現(xiàn)。將BMSCs移植入淀粉樣前體蛋白的小鼠海馬實(shí)驗(yàn)顯示，BMSCs能夠通過(guò)激活小膠質(zhì)細(xì)胞、緩解Aβ斑塊形成減少沉積和Tau蛋白的磷酸化，抑制神經(jīng)毒性，且通過(guò)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，改善小鼠的認(rèn)知功能[19-23]。同時(shí)BMSCs在移植后產(chǎn)生了多種神經(jīng)保護(hù)劑，包括神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)因子、趨化因子和細(xì)胞因子，對(duì)神經(jīng)起重要的保護(hù)作用[24]。

2.1.2UCMSCs 臍帶是一種省時(shí)省力、非侵入性的干細(xì)胞來(lái)源，臍帶血中原始細(xì)胞較多，易于收集，與其他來(lái)源的MSCs相比，UMSCs自我更新及分化能力更強(qiáng)，致瘤性和免疫原性更低，且規(guī)避了倫理問(wèn)題。

星形膠質(zhì)細(xì)胞是大腦中的主要免疫細(xì)胞，在大腦的一系列神經(jīng)發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，包括建立和維持突觸、細(xì)胞外神經(jīng)遞質(zhì)水平，以及維持血腦屏障正常功能[25-27]。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子修飾的UCMSCs移植到AD大鼠模型中可以增強(qiáng)星形膠質(zhì)細(xì)胞的激活，減少Aβ的表達(dá)，并改善空間學(xué)習(xí)和記憶能力[28]。有研究顯示，移植神經(jīng)元樣UCMSCs顯著增加了突觸蛋白-1的表達(dá)，突觸蛋白-1是突觸功能成熟和神經(jīng)遞質(zhì)釋放的重要蛋白，由此改善突觸傳遞，加強(qiáng)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放[29]。有臨床試驗(yàn)顯示：將UCMSCs移植到AD患者雙側(cè)海馬和一側(cè)楔前葉，受試者沒(méi)有出現(xiàn)不良反應(yīng)，后期也沒(méi)有腫瘤形成及其他異常，但Aβ檢測(cè)顯示負(fù)荷并沒(méi)有改善，這一結(jié)果與上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中UCMSCs能夠緩解Aβ斑塊形成的作用相悖[30]。以上研究表明，UMSCs的移植效果可能與檢測(cè)方法、腦內(nèi)微環(huán)境甚至物種發(fā)展有關(guān)，即低級(jí)物種接受高級(jí)物種干細(xì)胞移植效果更好。

MSCs主要通過(guò)重建神經(jīng)微環(huán)境，減少損害正常神經(jīng)結(jié)構(gòu)的因素(如減少Aβ的堆積)來(lái)支持神經(jīng)生長(zhǎng)、促進(jìn)神經(jīng)元的恢復(fù)，從而達(dá)到緩解和治療AD的目的[4,31-32]。MSCs主要以靜脈應(yīng)用透過(guò)血腦屏障到達(dá)損傷部位[20，33]。在使用干細(xì)胞移植治療腦損傷的臨床前研究中，已經(jīng)試驗(yàn)了幾種不同的給藥途徑，包括腦室注射、腹腔注射、靜脈注射、鞘內(nèi)注射、鼻腔注射和大腦皮質(zhì)實(shí)質(zhì)內(nèi)注射。一項(xiàng)研究對(duì)靜脈移植和實(shí)質(zhì)內(nèi)移植MSCs治療腦缺氧損傷的差異進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn)，靜脈注射較實(shí)質(zhì)內(nèi)注射具有更好的效果[34]。

上述研究結(jié)果表明，使用MSCs并了解它們的細(xì)胞和分子作用機(jī)制對(duì)AD的治療有很大幫助；與ESCs或IPSCs相比，MSCs免疫應(yīng)答低，并發(fā)癥少。雖然MSCs在細(xì)胞移植治療中應(yīng)用多樣，但其分泌的因子類型和細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還不是很明確；同時(shí)需要一種更有效的方法提高M(jìn)SCs利用率。一旦確定MSCs治療AD的機(jī)制和有效的使用方法，MSCs治療很有可能進(jìn)入臨床實(shí)踐，成為最有前景的治療AD的干細(xì)胞類型。截至目前，UCMSCs的安全性和有效性已得到諸多臨床前和臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證，因此UMSCs或可成為干細(xì)胞移植治療AD的首選。

2.2NSCs NSCs是一種自我更新能力強(qiáng)且具多向分化潛能的神經(jīng)祖細(xì)胞，主要來(lái)源于胚胎或胎兒神經(jīng)組織。隨著研究深入，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)NSCs也出現(xiàn)在成鼠的紋狀體、海馬齒狀回，人腦的嗅球、側(cè)室壁、大腦白質(zhì)和海馬等哺乳動(dòng)物中樞神經(jīng)系統(tǒng)的部位，其中成人海馬的粒下區(qū)和腦室側(cè)壁室下區(qū)的NSCs[2，35]不僅能分化為神經(jīng)元、少突膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞[36],且具有高遷移、高播散及低免疫原性的特點(diǎn)[2]。

海馬和皮質(zhì)的膽堿能神經(jīng)元減少，是目前公認(rèn)的引起AD認(rèn)知障礙的主要原因。NSCs廣泛參與哺乳動(dòng)物大腦的動(dòng)態(tài)平衡和修復(fù)，并表現(xiàn)出多效性的固有特性，這可能使其成為治療AD有潛力的候選細(xì)胞。一項(xiàng)使用人神經(jīng)干細(xì)胞治療顱腦放療不良反應(yīng)的試驗(yàn)表明，注射人神經(jīng)干細(xì)胞恢復(fù)了放療后海馬區(qū)神經(jīng)元的可塑性[37]；研究顯示，NSCs移植顯著改善了記憶障礙和空間學(xué)習(xí)能力[38]。NSCs移植治療AD主要通過(guò)內(nèi)源性和外源性兩種途徑達(dá)到修復(fù)和代替受損的神經(jīng)細(xì)胞，重建細(xì)胞環(huán)路、改善細(xì)胞功能的目的。

內(nèi)源性NSCs療法即當(dāng)發(fā)生神經(jīng)元損傷或變性時(shí)，利用自身的NSCs，動(dòng)員靜止的神經(jīng)干細(xì)胞[39-40]，誘導(dǎo)其增殖與分化，使受損傷的中樞神經(jīng)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)。該方法相較其他細(xì)胞替代療法具有可避免免疫反應(yīng)、減少腫瘤發(fā)生以及不涉及倫理問(wèn)題等優(yōu)勢(shì)，同時(shí)內(nèi)源性NSCs擁有針對(duì)環(huán)境的變化調(diào)整增殖與分化速度的潛力，且這種能力并不局限于正在進(jìn)行神經(jīng)組織生成的區(qū)域。因此可以用各種干預(yù)手段對(duì)內(nèi)源性NSCs進(jìn)行調(diào)整和改善,促進(jìn)其激活與增殖，最終遷移至靶區(qū)進(jìn)一步分化整合[41]。然而，這種內(nèi)源性神經(jīng)發(fā)生不能抵消受損大腦中神經(jīng)元的丟失。此外，神經(jīng)退行性患者逐漸失去神經(jīng)元，不能產(chǎn)生新的神經(jīng)元來(lái)取代丟失的神經(jīng)元[42-43]。

外源性NSCs療法主要是通過(guò)移植的方法，使其在體內(nèi)存活、遷移并分化為功能性神經(jīng)元，整合入宿主神經(jīng)回路，修復(fù)神經(jīng)功能[44-45]。有學(xué)者將胎兒端腦內(nèi)的人神經(jīng)干細(xì)胞移植到AD小鼠側(cè)腦室中，觀察到人神經(jīng)干細(xì)胞在側(cè)腦室中分化為神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞，這一過(guò)程可以改善空間記憶，減少Tau蛋白磷酸化和降低Aβ42水平、減少小膠質(zhì)細(xì)胞病和星形膠質(zhì)細(xì)胞病、增強(qiáng)內(nèi)源性突觸發(fā)生以及增加神經(jīng)元、突觸和神經(jīng)纖維密度[46-47]。這些作用通過(guò)信號(hào)通路的調(diào)節(jié)、代謝活性、抗炎因子的分泌和細(xì)胞與細(xì)胞的接觸等機(jī)制實(shí)現(xiàn)。腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子能夠改善海馬突觸密度和增加膽堿能神經(jīng)元數(shù)量[48-51]，對(duì)移植NSCs改善AD大鼠的認(rèn)知至關(guān)重要。此外，外源性NSCs在受體腦組織的病灶內(nèi)遷移并分化為相應(yīng)神經(jīng)元的過(guò)程中，其分化方向與NSCs的內(nèi)在和所在的微環(huán)境密切相關(guān)。

以上兩種途徑的研究表明，雖然外源性NSCs在治療AD中效果明顯，但其機(jī)制是NSCs分化的神經(jīng)元替代了缺失組織，還是NSCs分泌的細(xì)胞因子或移植的NSCs激活了某些信號(hào)通路促進(jìn)了神經(jīng)發(fā)生[52]，目前尚不清楚；內(nèi)源性途徑雖在一定程度上避免了免疫原性和倫理限制[53]的問(wèn)題，但這兩種途徑均存在的重要缺陷為將NSC移植入成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)非神經(jīng)元部位，絕大部分細(xì)胞因?yàn)槭荏w腦內(nèi)微環(huán)境影響并不向神經(jīng)元方向分化，分化條件無(wú)法掌控，在腦內(nèi)存活數(shù)量不足[11,54]。NSCs移植可以補(bǔ)充AD患者缺失的神經(jīng)元，但因目前醫(yī)學(xué)技術(shù)的局限，仍無(wú)法精確提高NSCs的體外行為與其對(duì)腦環(huán)境的適應(yīng)度，故還需要廣泛的基礎(chǔ)研究。

2.3ESCs ESCs是胚胎發(fā)育囊胚期的多能干細(xì)胞，被稱為“最原始”的全能干細(xì)胞，ESCs從外胚層、中胚層和內(nèi)胚層產(chǎn)生體細(xì)胞及具有自我更新的能力，決定了其多能性,可以誘導(dǎo)分化為任何方向的細(xì)胞[2,55]。

基底前腦膽堿能神經(jīng)元在AD患者腦中受到嚴(yán)重破壞，將小鼠ESCs成功分化產(chǎn)生的基底前腦膽堿能神經(jīng)元移植入AD大鼠腦中后，其雖然推動(dòng)了大鼠腦中神經(jīng)元的衍生，明顯改善了記憶，但也出現(xiàn)了鼻咽癌的分化[56]。有研究將人ESCs在體外產(chǎn)生的膽堿能神經(jīng)元，移植到培養(yǎng)的小鼠內(nèi)嗅海馬切片上，發(fā)現(xiàn)它們可以和現(xiàn)有的神經(jīng)元網(wǎng)絡(luò)相連[57]，達(dá)到改變認(rèn)知的效果。美國(guó)食品藥品管理局批準(zhǔn)的第一個(gè)使用人類ESCs衍生細(xì)胞的臨床試驗(yàn)于2010年由Geron公司啟動(dòng)，標(biāo)志著設(shè)計(jì)人ESCs移植的臨床試驗(yàn)正式啟動(dòng)。雖然ESCs具有許多優(yōu)點(diǎn)，但為了達(dá)到研究目的，ESCs多是從體外受精的卵子中發(fā)育出來(lái)的胚胎獲得，由此引發(fā)的倫理問(wèn)題和潛在的免疫排斥反應(yīng)使其臨床應(yīng)用存在較大爭(zhēng)議，且直接移植ESCs存在分化方向難以調(diào)控、細(xì)胞增殖失控[2，56]和腫瘤發(fā)生、胎瘤形成等問(wèn)題[58-59]。因此需要更新的方法改善供體細(xì)胞和受體的相容性，防止?jié)撛诘拿庖叻磻?yīng)[60-61]。

2.4IPSCs IPSCs的原理是通過(guò)向體細(xì)胞中轉(zhuǎn)入若干轉(zhuǎn)錄因子，使其逆向重編程回到ESCs樣狀態(tài)具有干細(xì)胞的基本特性[62]。除來(lái)源外，IPSCs的其他特征與ESCs幾乎完全一致，具有多項(xiàng)分化潛能，并能夠在體外自我更新，理論上可以誘導(dǎo)分化為成體生物體內(nèi)的所有細(xì)胞類型。IPSCs通過(guò)特定的重編程基因的傳遞，各種類型的體細(xì)胞(如皮膚成纖維細(xì)胞和外周血單核細(xì)胞)可通過(guò)誘導(dǎo)達(dá)到類似ESCs的狀態(tài)，發(fā)揮ESCs的作用。因此，IPSCs技術(shù)可以解決與使用ESCs有關(guān)的短缺和復(fù)雜的社會(huì)問(wèn)題。借助IPSCs可以從患者自身產(chǎn)生多能細(xì)胞，進(jìn)行自體移植，解決免疫排斥反應(yīng)和倫理限制的問(wèn)題[63]。將人IPSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元細(xì)胞，并移植到具有Aβ沉積和空間記憶障礙的小鼠海馬中，觀察到細(xì)胞分化為膽堿能神經(jīng)元，且記憶障礙有所好轉(zhuǎn)[64]。

目前國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)IPSCs的研究時(shí)間尚短，研究過(guò)程受技術(shù)等條件限制，IPSCs的應(yīng)用仍面臨許多挑戰(zhàn)，如如何概括散發(fā)性疾病的表型，以及如何選擇理想的表型和進(jìn)行大規(guī)模藥物的篩選。但現(xiàn)在已經(jīng)開發(fā)了許多新策略，可以與以IPSCs為基礎(chǔ)的模型相結(jié)合來(lái)解決這些問(wèn)題，包括有機(jī)體技術(shù)、單細(xì)胞RNA測(cè)序、基因組編輯和深度學(xué)習(xí)人工智能等[65]。

3 問(wèn)題與展望

迄今為止，多種動(dòng)物實(shí)驗(yàn)、體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，干細(xì)胞可以有效填補(bǔ)AD患者丟失的神經(jīng)元，為AD的治療提供新思路[2,29,37]；同時(shí)，通過(guò)研究干細(xì)胞誘導(dǎo)激活分化為神經(jīng)元的機(jī)制，還可以進(jìn)一步明確神經(jīng)元的產(chǎn)生與凋亡機(jī)制，為AD的病理研究提供新領(lǐng)域。

但目前仍缺乏對(duì)干細(xì)胞移植后腦修復(fù)因素的分析研究，在如何消除免疫排斥反應(yīng)、提高移植干細(xì)胞存活率、獲得有效臨床級(jí)數(shù)量、獲得活化年輕的干細(xì)胞、選擇給藥途徑以及防止回輸后干細(xì)胞適應(yīng)腦內(nèi)微環(huán)境等方面面臨巨大挑戰(zhàn)。目前，有關(guān)應(yīng)用干細(xì)胞移植技術(shù)治療AD的研究大多停留在動(dòng)物模型實(shí)驗(yàn)階段，其臨床應(yīng)用較少。未來(lái)的臨床前研究應(yīng)特別強(qiáng)調(diào)安全性，確定最佳的細(xì)胞來(lái)源和輸送方法，并積極評(píng)估AD患者腦內(nèi)微環(huán)境中干細(xì)胞的分化反應(yīng)，積極隨訪。

4 小 結(jié)

AD發(fā)病率逐年上升，目前尚無(wú)有效治療手段，干細(xì)胞移植可能成為一種治療AD的有效方法。豐富的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)為臨床試驗(yàn)提供了可靠的理論依據(jù)，提高干細(xì)胞移植在臨床的可行性。干細(xì)胞種類多樣，其中MSCs以其易獲取、可自我更新、多向分化等特點(diǎn)成為首選干細(xì)胞類型。但干細(xì)胞的作用機(jī)制仍未完全闡明，人類臨床試驗(yàn)仍處于初起階段，為使更多AD患者獲益，需建立完備的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床試驗(yàn)的數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)，反復(fù)驗(yàn)證其安全性、有效性，準(zhǔn)確把控倫理問(wèn)題，盡早實(shí)現(xiàn)干細(xì)胞移植治療AD。