牛結(jié)核病診斷方法及在疫病凈化中的應(yīng)用

肖穎 趙明

（1，重慶市動物疫病預(yù)防控制中心 401120；2，山東省青島市動物疫病預(yù)防控制中心 266100）

牛結(jié)核?。˙ovine tuberculosis,bTB）是由牛分枝桿菌（Mycobacterium bovis）引起的一種人和動物的慢性細菌性傳染病，OIE 將其列為必須報告的動物疫病，我國將其列為二類動物疫病。據(jù)估計，全球結(jié)核病潛伏感染約占總?cè)丝诘?/3，發(fā)展為臨床活動結(jié)核的比例約為5%～10%。在發(fā)展中國家，10%以上的人結(jié)核病是由牛分枝桿菌引起的[1]。據(jù)我國獸醫(yī)公報顯示，2020 年全國共發(fā)生牛結(jié)核病疫情115 起，發(fā)病761 例，撲殺261 例，累計疫情最多的省份依次為內(nèi)蒙古自治區(qū)、新疆維吾爾自治區(qū)和陜西省。牛結(jié)核病呈現(xiàn)宿主范圍廣、感染基數(shù)大、發(fā)病數(shù)相對較少的特點，給該病的防控乃至凈化造成困擾。本文主要從牛分枝桿菌病原與流行病學(xué)特點、檢測方法及其在發(fā)達國家牛結(jié)核凈化根除中的應(yīng)用進行綜述。

1 病原學(xué)特點

牛結(jié)核病主要由牛分枝桿菌（牛型）、山羊分枝桿菌（山羊型）引起，結(jié)核分枝桿菌（人型）也可致病。牛分枝桿菌屬于嚴格需氧菌，革蘭氏陽性菌，長約1.5～4μm、寬0.2～0.5μm 的細長彎曲桿菌，沒有鞭毛，無運動性，不形成芽孢和莢膜[2]。細胞壁含有較高的類脂和臘脂，脂質(zhì)含量約占干重的60%，耐干燥，對熱的抵抗力較差，60℃30min，80℃5min 即可滅活。對一般消毒劑抵抗力較強，對濕熱、酒精及紫外線相對敏感。

2 流行病學(xué)特點

牛結(jié)核病一年四季均可發(fā)生。宿主范圍廣泛，約50 多種哺乳動物及25 種禽類可感染本病。在家畜中，奶牛易感性最高，其次是黃牛和水牛。發(fā)病動物尤其是開放性結(jié)核病動物是主要傳染源，通過唾液、鼻液、痰液和生殖道分泌物等排出體外。該病主要經(jīng)呼吸道傳播，牛、人及野生動物等通過吸入含有病原菌的飛沫而感染。該病還可通過消化道傳播，易感動物采食了被污染的飼料、草、飲水等感染。飼養(yǎng)管理良好通風(fēng)可有效控制牛結(jié)核病患病率。研究發(fā)現(xiàn)，結(jié)核病人飼養(yǎng)的?；寂＝Y(jié)核病的比率比健康人飼養(yǎng)的牛高2 倍[2]，放牧飼養(yǎng)模式牛結(jié)核病患病率為1%～5%，圈養(yǎng)模式動物結(jié)核患病率可達25%～50%，排菌病人家中牛結(jié)核病患病率較痰菌陰性病人飼養(yǎng)牛患病率高70%，較不活動結(jié)核病病人家庭牛高4 倍[3]。

因致病菌感染部位不同病例表現(xiàn)形式也不同，如肺結(jié)核、乳房結(jié)核、腸結(jié)核、淋巴結(jié)核和神經(jīng)結(jié)核等。其中以肺結(jié)核最為常見，主要表現(xiàn)為進行性消瘦、咳嗽和呼吸困難；乳房結(jié)核表現(xiàn)為泌乳量減少或停止，泌乳稀薄并可通過乳汁引起小牛感染；腸結(jié)核可引起腸道系膜淋巴結(jié)炎，腹瀉和便秘交替出現(xiàn)，多見于犢牛；淋巴結(jié)核會引起附近淋巴結(jié)腫大；神經(jīng)結(jié)核常出現(xiàn)神經(jīng)癥狀。

3 主要診斷方法

3.1 細菌學(xué)方法

主要包括涂片染色法、細菌培養(yǎng)法、分枝桿菌生長指示管法（MGIT）等。涂片染色法通常采用萋尼染色或熒光抗酸染色法檢查抗酸性桿菌，需解剖后無菌采集病變明顯組織器官如肺臟、淋巴結(jié)、肝臟等進行涂片。該方法只能檢出抗酸桿菌，不能準確對結(jié)核分枝桿菌及其他非典型分枝桿菌進行鑒定，并且40%～60%的病例和75%的其他結(jié)核病例不能被檢出[4]。細菌培養(yǎng)法是結(jié)核病診斷的金標準，牛分枝桿菌對營養(yǎng)要求高，生長緩慢，需要14～15h 分裂一次，一般需要4～8 周時間，對標本采集和樣品前處理都有相應(yīng)要求，臨床分離成功率通常較低[5]。傳統(tǒng)的固體培養(yǎng)基如羅氏培養(yǎng)基、丙酮酸鈉培養(yǎng)基，制作簡單，價格低廉，但培養(yǎng)時間較長。羅氏培養(yǎng)基甘油含量超過0.75%，對剛分離出的牛分枝桿菌有抑制作用，并且初代培養(yǎng)菌落不容易處理，而丙酮酸鈉培養(yǎng)基初代培養(yǎng)后菌落為團型，操作性強。液體培養(yǎng)基如：7H9、MB/BACTALERT 3D 和BACTEC MGIT 960 等，液體培養(yǎng)基含有復(fù)雜的營養(yǎng)成分，添加了細菌抑制劑，在分離培養(yǎng)時間、陽性率和污染率方面優(yōu)于固體培養(yǎng)基，但檢測成本較高[6]。牛分枝桿菌在培養(yǎng)過程中存在污染率高、耗時長、陽性率低的缺點，不適合推廣。

3.2 遲發(fā)型過敏反應(yīng)試驗

結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)（TST）是國際貿(mào)易指定的檢測方法，1890 年Koch 研制出了結(jié)核菌素，該方法至今已使用了130 年，至今仍是主要的牛結(jié)核病檢測方法之一。初期牛結(jié)核的診斷是采用結(jié)核菌素點眼的辦法，根據(jù)牛眼充血程度進行結(jié)核陰陽性判斷。但該方法對牛刺激較大，后來改為皮試方法[3]。該方法在結(jié)核病早期具有檢測優(yōu)勢，因為在感染初期，細胞免疫水平比體液免疫反應(yīng)更容易被檢測到。皮試法可進一步分為尾褶結(jié)核菌素皮內(nèi)檢測（CFT）、頸部單一結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗（SICT）及比較結(jié)核菌素皮內(nèi)試驗（SICCT）。有試驗表明，SICT 陽性率高于SICCT，陽性符合率為27.27%；CFT 陽性率低于SICT，符合率可達69.39%[7]。對于環(huán)境中副結(jié)核分枝桿菌污染較嚴重的區(qū)域，適合選擇比較皮試法進行檢測。該方法的優(yōu)點是便于在基層推廣、成本低，但缺點是特異性差，感染后3～6 周內(nèi)易出現(xiàn)假陰性。易與非結(jié)核分枝桿菌（NTM）發(fā)生交叉反應(yīng)出現(xiàn)假陽性結(jié)果，且需要間隔72h 才能測量皮厚，勞動強度大、主觀判斷性強、不適合所有易感動物的檢測，檢測發(fā)病后期病情嚴重的牛易出現(xiàn)假陰性結(jié)果。

3.3 γ-干擾素檢測方法

γ-干擾素試驗作為牛結(jié)核病檢測的補充試驗，需要采集抗凝全血，用結(jié)核菌素（牛結(jié)核菌素、禽結(jié)核菌素）平行刺激外周血淋巴細胞，由于免疫記憶，陽性牛會釋放大量的IFN-γ，且IFN-γ 產(chǎn)生的量和檢測樣本中結(jié)核菌素含量呈正相關(guān)。因此，可通過對比釋放出的IFN-γ 含量來判定。目前，我國已制定γ-干擾素檢測方法國家標準，可作為牛結(jié)核病的早期診斷方法。但結(jié)核菌素皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)試驗與γ-干擾素試驗在檢測結(jié)果上存在不一致性。研究發(fā)現(xiàn)，部分個體IFN-γ 方法結(jié)果為陽性而皮試法結(jié)果呈陰性，采用皮試法對陰性個體持續(xù)進行跟蹤監(jiān)測觀察，20 個月后，86%的個體陸續(xù)轉(zhuǎn)為皮試陽性[8]。IFN-γ 檢測方法的優(yōu)勢在于在個體感染極低劑量下，只要外周淋巴細胞釋放較微量的IFN-γ 即可檢測到，且讀取結(jié)果較皮試法客觀。但缺點是檢測成本高，操作復(fù)雜，采集的全血需盡快運到實驗室進行結(jié)核菌素刺激，通常需要有經(jīng)驗的實驗室人員進行操作。研究發(fā)現(xiàn)，在皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)實驗后8～28d 內(nèi)再進行IFN-γ 檢測，其靈敏度和特異性沒有顯著影響[9]。因此，IFN-γ 檢測實驗可以配合皮內(nèi)變態(tài)實驗進行牛結(jié)核病平行試驗和系列試驗。

3.4 ELISA 抗體檢測方法

ELISA 抗體檢測方法是牛結(jié)核病診斷輔助手段中唯一的血清學(xué)檢測方法，可作為TST 的補充方法。牛分枝桿菌生長緩慢，在感染的不同階段會分泌不同的蛋白質(zhì)，主要用于血清學(xué)反應(yīng)抗原有CFP10、MPB70、MPB164、ESAT-6、MPB83 及LPSO 等。CFP-10 和ESAT-6 蛋白屬于早期分泌性抗原，單獨應(yīng)用，兩者特異性均為100%，但敏感性較低。將兩種蛋白混合使用不但能保持高特異性，且大大提高了敏感性，甚至超過PPD 的敏感性，同時還可以對卡介苗免疫牛和自然感染牛進行鑒別診斷[10]。MPB70 是牛結(jié)核病重要的體液免疫和細胞免疫靶抗原，單獨應(yīng)用MPB70 建立的ELISA 方法，特異性可達98%，而敏感性僅為21%[11]。將MPB70、MPB83 和ESAT-6抗原融合表達建立的MA-ELISA 方法，特異性可達96%，敏感性為69.4%，明顯高于MPB70、MPB83 和ESAT-6 單獨表達所建立方法的敏感性[12]。提示多抗體聯(lián)合應(yīng)用可極大提高血清學(xué)診斷的敏感性[13]。感染晚期牛體內(nèi)存在高循環(huán)抗體，此時細胞免疫受到抑制，TST 可能出現(xiàn)假陰性，比較適合用ELISA 抗體檢測方法。鹿抗體反應(yīng)發(fā)展的較早，運用比較ELISA 檢測敏感性較高[14]，ELISA 可以用作對野生動物（如鹿等）的輔助檢測方法。在牛分枝桿菌感染動物體上存在變態(tài)反應(yīng)疊加現(xiàn)象，皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)2～8 周，更利于ELISA 檢測[15]。ELISA 方法可作為TST 皮試的補充方法及對“無反應(yīng)性個體”的替代方法，進一步發(fā)現(xiàn)和淘汰陽性牛，確保牛群健康[16]。

3.5 分子生物學(xué)檢測方法

隨著分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，PCR、巢氏PCR、熒光定量和核酸探針等方法應(yīng)用到牛結(jié)核病病原學(xué)診斷中。1989 年聚合酶鏈反應(yīng)首先應(yīng)用在人結(jié)核病檢測中。IS6110 是結(jié)核分枝桿菌中一個多拷貝的保守片段，以該序列設(shè)計引物擴增靶序列，特異性強和靈敏性高，廣泛用于人結(jié)核病PCR 檢測。IS6110 在人結(jié)核分離株中拷貝數(shù)較高，但在大多數(shù)牛分枝桿菌分離株中只有1 個拷貝[17]。而插入序列IS1081 在人型和牛型分枝桿菌中有5～6 個拷貝，并未在其他分枝桿菌中發(fā)現(xiàn)該序列[18]。因此，以IS6110 和IS1081 等結(jié)核桿菌插入序列作為擴增靶點進行PCR 檢測，在牛結(jié)核病診斷、分型和流行病學(xué)調(diào)查中具有重要意義[19]。針對插入序列IS6110 基因片段設(shè)計一對引物，6h 可完成整個檢測過程，最低核酸檢測量為1.025pg/uL[20]。建立的FQ-PCR 檢測方法，針對插入序列IS1081 序列設(shè)計的熒光定量PCR 引物和探針，敏感性達到10 個拷貝[21]。檢測牛結(jié)核菌recA-IS6110-IS1081 三重PCR 檢測方法，敏感性達到585、19.5 和19.5fg，可作為牛分枝桿菌和結(jié)核分枝桿菌的快速檢測和流行病學(xué)調(diào)查工具[22]。

4 檢測方法在牛結(jié)核凈化根除中的應(yīng)用

4.1 常用檢測方法實際應(yīng)用比較

TST 和IFN-γ 檢測方法適合牛結(jié)核病的早期診斷，而ELISA 血清學(xué)檢測方法在病情后期、感染嚴重時期具有檢測優(yōu)勢。一般皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)要求牛結(jié)核菌素注射劑量為2000IU 單位，但在結(jié)核病凈化和根除時，OIE 推薦使用5000IU 單位，注射劑量不得大于0.2ml。雖然目前制定了皮內(nèi)變態(tài)反應(yīng)標準操作方法，但結(jié)核菌素抗原標準化尚未統(tǒng)一[23]。比較SICT 和SICCT 兩種檢測方式，SICT 敏感性更高，適合在牛結(jié)核病流行地區(qū)可增加感染牛檢出。SICCT 在控制或穩(wěn)定地區(qū)更有利于開展檢測凈化[24]。通過ELISA 和TST 對比試驗，對TST 檢測呈陰性的牛進行跟蹤監(jiān)測，并采用組織病理學(xué)和PCR 方法驗證，發(fā)現(xiàn)陰性牛中83.7%感染了牛分枝桿菌。ELISA 可作為TST 的補充試驗，來改善奶牛的健康[16]。以TST 試驗為標準，比較了IFN-γ、ELISA、SICTT 在污染場臨床檢出效果，發(fā)現(xiàn)IFN-γ 方法陽性檢出率顯著高于SICCT 檢出率，而ELISA 敏感性顯著低于TST 試驗[25]。牛結(jié)核病陽性率較高的牧場可選用SICT、IFN-γ 方法單獨或者聯(lián)合使用來增加陽性檢出率。目前尚無商品試劑盒可以進行牛潛伏感染和活動性結(jié)核的鑒別診斷。

4.2 發(fā)達國家牛結(jié)核病防控主要監(jiān)測方法

成功控制和根除了牛結(jié)核病的發(fā)達國家在控制過程中都遵循了“檢疫-撲殺”相結(jié)合的綜合防控措施，選擇了合適的監(jiān)測體系，通過立法進行保障來加快凈化進程。在凈化成功經(jīng)驗中，皮試法發(fā)揮了重要作用。如愛爾蘭采用單一皮試方法每年對所有牛群進行監(jiān)測；美國、加拿大、澳大利亞及歐洲許多國家采用皮試法和IFN-γ 聯(lián)合使用的方法；澳大利亞在早期根除牛結(jié)核病監(jiān)測中采用單一皮試法，提高牛結(jié)核菌素劑量，在后期引入IFN-γ 方法后開始進行聯(lián)合試驗，這樣既增加了陽性牛的檢出，又保證了陰性牛的健康，歐洲大部分國家首先用TST進行普查，對高風(fēng)險地區(qū)采用平行試驗，提高敏感性增加陽性牛的檢出，對低風(fēng)險區(qū)域采用系列試驗，提高特異性避免錯殺；也有使用TST 和ELISA 方法相結(jié)合的辦法，如韓國在后期采用ELISA 抗體和IFN-γ 方法進行牛結(jié)核病根除。英國的野生動物獾、美國的鹿、新西蘭的負鼠等都因野生儲存宿主的存在給牛結(jié)核病的根除造成了一定的阻礙。當前，德國、澳大利亞、荷蘭等國家獲得了歐盟“無結(jié)核”的認可，日本、美國、法國等國家牛結(jié)核病已得到控制，目前尚無任何國家通過OIE 無結(jié)核病認可。

4.3 我國牛結(jié)核病防控主要措施

我國牛結(jié)核病的防控中主要采取以“監(jiān)測、檢疫、撲殺和消毒”相結(jié)合的綜合性防治措施。因地制宜、分類指導(dǎo)、因場施策、逐步凈化，積極開展場群和區(qū)域凈化工作。目前對牛結(jié)核病沒有疫苗預(yù)防，不進行藥物治療，在牛結(jié)核病凈化群中（包括犢牛群）檢出陽性牛時應(yīng)及時撲殺?；鶎訖z測手段主要依賴SICT 和SICCT，有條件的實驗室選用IFN-γ 方法進行監(jiān)測。近年來，我國開始推進布魯氏菌病和牛結(jié)核病凈化場和示范縣創(chuàng)建，以養(yǎng)殖場和縣為單位極大地推動了我國牛結(jié)核病凈化進程。

5 展望

目前，我國多個省份均有牛結(jié)核病發(fā)生的報道，野生動物感染情況不詳，部分縣存在牛結(jié)核病檢疫積極性不高，養(yǎng)殖場戶主動檢疫意識不強和對牛結(jié)核病凈化不了解、沒有意愿的情況。據(jù)2015～2018 年我國部分地區(qū)牛結(jié)核病流行病學(xué)調(diào)查顯示，只有60.17%的養(yǎng)殖場戶進行了PPD-TST 檢疫，其中67.61%場戶每年檢疫一次[26]。有研究學(xué)者對SICT 陽性牛用細菌學(xué)方法進行鑒定，25.9%樣品分離到抗酸陽性菌，18.5%樣品分離到分枝桿菌，僅有1.9%的樣品分離到牛分枝桿菌[24]。部分PPD-TST 檢測陽性牛，未見典型結(jié)核癥狀，剖檢僅有少數(shù)發(fā)現(xiàn)結(jié)核病變。因此，在凈化過程中，應(yīng)采用一種以上的檢測方法加以驗證，同時加強對屠宰環(huán)節(jié)檢疫，探索更加合理的無害化處理方式，減少資源浪費。

目前，牛結(jié)核診斷的各種方法可能適合疫病進展的一個階段，但不一定適用于其他階段。開發(fā)適用于基層推廣的敏感性高、特異性強、耗時短的鑒別診斷方法，對潛伏感染和活動性結(jié)核鑒別診斷方法。探索撲殺活動性牛結(jié)核陽性牛，對潛伏感染牛持續(xù)隔離跟蹤觀察，既可節(jié)省撲殺成本，又提高養(yǎng)殖場戶對牛結(jié)核病凈化的支持，對牛結(jié)核病的防控具有積極意義。