循環(huán)腫瘤細胞在上皮性卵巢癌診治中的進展

秦昭娟，杜逸，鄭艾

卵巢癌死亡率在婦科惡性腫瘤中占第一位。據(jù)2019 年的統(tǒng)計，美國每年新發(fā)卵巢癌患者約22 000例，其中死于卵巢癌的病例數(shù)約14 000 例[1]。卵巢癌發(fā)病隱匿，約70%的患者被發(fā)現(xiàn)時已經(jīng)進入中晚期。雖然當前卵巢癌的診治水平進一步提高，由于手術縮瘤不滿意、術后復發(fā)和化療耐藥等，卵巢癌5 年生存率普遍低于30%。目前血清CA-125 是卵巢癌最敏感的標志物，但女性孕期、子宮內(nèi)膜異位等情況均會造成血清CA-125 的升高，CA-125 對卵巢癌診斷假陰性的比例較高[2]。90%來源于卵巢上皮細胞的卵巢惡性腫瘤為上皮性卵巢癌（epithelial ovarian cancer，EOC）。早在1896 年Ashworth 首先提出循環(huán)腫瘤細胞（circulating tumor cell，CTC）的概念，CTC作為一種新型的腫瘤標志物，具有獲取樣本容易、創(chuàng)傷小、可重復的優(yōu)點，且在多種類型的腫瘤如肺癌、乳腺癌等已證實其具有早期診斷、評估抗腫瘤藥物療效及判斷患者預后的價值[3-4]。CTC 由原發(fā)灶進入血液被認為是腫瘤轉(zhuǎn)移的早期事件[5]，大部分CTC被免疫系統(tǒng)清除，部分幸存的細胞到達遠處器官形成轉(zhuǎn)移灶。目前EOC 的CTC 檢測得到廣泛研究，現(xiàn)主要探討幾種典型的上皮性卵巢癌CTC 捕獲和鑒定的方法，CTC 在EOC 診治中的臨床意義及其臨床應用轉(zhuǎn)化的前景。

1 CTC 的表面標志物

CTC 的檢測首先需要選擇其表面標志物。CTC的形成與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化有著密切關系。在此過程中，腫瘤細胞的上皮性質(zhì)標志物如上皮細胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）和細胞角蛋白（cytokeratin，CK）表達減少，間質(zhì)細胞標志物如波形蛋白的表達增加，這種轉(zhuǎn)變有利于減少腫瘤細胞間的黏附，促進CTC 的產(chǎn)生并向鄰近或遠處器官組織侵襲轉(zhuǎn)移。血液中的CTC 大致分為上皮型、混合型和間質(zhì)型，若在血液中發(fā)現(xiàn)較多混合型或間質(zhì)型CTC 可能預示患者轉(zhuǎn)移復發(fā)的風險更大[6]。常用的CTC 表面標志物包括EpCAM、切除修復交叉互補蛋白1（excision and repair of cross complementary protein 1，ERCC1）和CK 等。EpCAM 為非鈣離子通道依賴性跨膜糖蛋白，其生物學功能包括細胞黏附、增殖、維持未分化狀態(tài)以及調(diào)節(jié)分化等。在EOC 中EpCAM 高表達，也是最常用的CTC 檢測標志物之一。ERCC1 參與核酸切除修復途徑，介導機體對鉑類化療藥物的抗藥性和敏感性，是卵巢癌鉑類化療藥物可能的耐藥機制之一。Chebouti 等[7]的研究發(fā)現(xiàn)ERCC1 是一個獨立的預測卵巢癌鉑耐藥性和不良預后的生物標志物。CK 廣泛應用于標記各種上皮來源的組織和腫瘤細胞，通過分析CK 亞型有助于確定腫瘤病理類型。人類表皮生長因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）是表皮生長因子受體家族酪氨酸激酶受體的成員之一，在腫瘤生物學過程中起著關鍵作用[8]，HER2 過表達與卵巢癌不良預后相關。黏蛋白1（Mucins 1，MUC1）是一種高分子質(zhì)量的糖基化的1 型跨膜糖蛋白，在正常卵巢組織中不表達，在所有組織類型的原發(fā)性卵巢癌中均表達，在EOC 中表達率可達90%。當卵巢腫瘤從良性變?yōu)閻盒裕琈UC1 表達上調(diào)。Aktas 等[9]的研究中卵巢癌患者手術前和化療后外周血中CTC 表面MUC1 的表達率分別為50%和47%。MUC16 主要發(fā)揮保護和修復上皮的作用。MUC16 可以通過與間皮素結合，抑制腫瘤細胞和免疫細胞，形成免疫突觸，促進卵巢癌遠處轉(zhuǎn)移[10]。MUC16 與EOC 細胞的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化、EOC 的腫瘤形成及轉(zhuǎn)移關系密切。

CTC 的檢測常受到血液中大量白細胞和原發(fā)腫瘤異質(zhì)性的影響。EpCAM 雖然是目前檢測EOC 中CTC 最常用的腫瘤標志物，但因其在不同CTC 中表達水平的變化，僅基于EpCAM 進行CTC 檢測，可能丟失一些CTC 亞型[11]，導致檢測的敏感度低。在分析對比了多種研究的基礎上，Zhang 等[12]發(fā)現(xiàn)聯(lián)合使用EpCAM、HER2 和MUC1 進行檢測效果最好。通常來說，聯(lián)合使用兩種及以上的標志物將提高CTC 在血液中的富集效率。

2 CTC 的檢測方法

理想的CTC 檢測系統(tǒng)能夠在血液中的強大背景中分離檢測血液所有異質(zhì)性的CTC。Yousefi 等[13]比較了最近十年關于EOC 的研究結果發(fā)現(xiàn)CTC 的檢測率約為12%～43%，發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化后的卵巢癌CTC 具有多樣的生物學行為。由于CTC 的稀有性以及單個細胞中存在的核酸以及細胞間的異質(zhì)性[14]，在運用CTC 檢測技術診斷腫瘤時面臨巨大挑戰(zhàn)。CTC 檢測包括CTC 的分離與檢測兩個部分。首要是CTC 在血液中的分離，以物理特性為基礎的CTC 分離方法包括密度梯度離心法、上皮腫瘤細胞體積分離法、膜濾過分離法和細胞變形性富集法等；基于電子信息技術的CTC 分離方法主要包括免疫磁珠法、微流控芯片法和光纖陣列掃描法等，主要是利用抗原抗體結合原理對CTC 進行富集。

2.1 物理分離方法密度梯度離心法是利用CTC在配制的分離液與正常血液細胞沉降系數(shù)不同，通過離心技術將不同密度的細胞區(qū)分在不同區(qū)域，紅細胞、粒細胞密度比CTC 大，離心后會沉于管底；淋巴細胞和單核細胞密度小于或等于分離介質(zhì)，因此離心后懸浮于介質(zhì)中漂浮于上層，CTC 也留存于單核細胞富集層。膜濾過分離法是基于CTC 比正常血細胞的體積大，采用8 μm 孔徑的濾膜將CTC 聚集在濾膜上，但血液中體積較大的正常血細胞同時也會被富集而造成假陽性。物理分離后CTC 仍保留活力，缺點是缺乏特異性，富集后的細胞需要進一步檢測排除假陽性，因而限制其運用。

2.2 Cell Search 系統(tǒng)目前大多數(shù)的臨床CTC 研究資料來自于唯一被美國食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準的Cell Search 系統(tǒng)，是衡量其他CTC 檢測方法的標準。原理是利用EpCAM 抗體免疫磁珠富集7.5 mL 外周血中的CTC[15]，4′,6-二脒基-2-苯基吲哚（4′,6-diamidino-2-phenylindole，DAPI）核染色，CK8、CK18 和CK19 熒光抗體標記上皮細胞，CD45熒光抗體識別白細胞。符合腫瘤細胞學形態(tài)特征并且CK 熒光抗體陽性、DAPI 陽性和CD45 陰性的細胞被定義為CTC。其截斷值為2 個細胞。Cell Search系統(tǒng)只能檢測EpCAM 陽性的細胞。Yoo 等[16]將高密度的透明二氧化硅制作的微珠與EpCAM 抗體結合，之后CTC 和微珠的復合體再利用密度梯度離心法與其他細胞分離，可以分離出低表達EpCAM 的CTC細胞。2017 年獲得國家食品藥品監(jiān)督管理總局（CFDA）批準上市的Cell Collector[17]富集技術是將包被EpCAM 抗體的Cell Collector 功能區(qū)裝置通過留置針插入患者的靜脈，保持30 min 富集CTC，該技術是目前效率較高的CTC 富集技術。

2.3 免疫磁珠法基于細胞上皮表面抗原與連有免疫磁珠的特異性單抗相結合，形成抗原-抗體-磁珠復合物。血液中幾乎所有的細胞都是反磁性或者弱磁性的，在磁場的作用下，可將特定的腫瘤細胞進行分離?？贵w的選擇是免疫磁性分離技術重要環(huán)節(jié)，單用EpCAM 作為檢測標志的文獻報道較多，部分報道運用EpCAM 與CK 聯(lián)合檢測，EpCAM 與HER2、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、MUC1 抗體組合對EOC 進行檢測，均獲得較高的分選效率。國內(nèi)有研究采用陰性免疫磁微粒法檢測健康人群與EOC 患者血液中的CTC，結果顯示EOC 組的CTC 陽性率為90.22%，且隨著腫瘤分期的進展檢測出的CTC 數(shù)目更多，CTC 計數(shù)與EOC 臨床分期具有相關性[18]。免疫磁性分離技術的優(yōu)點能夠較好保存細胞形態(tài)，并可在熒光顯微鏡下觀察。

2.4 微流控芯片基于微流控芯片的分離方法通過在芯片通道內(nèi)部修飾可識別細胞表面抗原的抗體或核酸適配體，當接入待測樣本時，目標標志物與通道表面捕獲試劑結合，實現(xiàn)特異性分離。Tsai 等[19]采用以卵巢癌CX-BG1-10-A 適配體包被的磁珠來捕獲血液的CTC，明顯減少混雜的白細胞數(shù)量，假陽性率比Cell Search 檢測方法低至少兩個數(shù)量級。Tang等[20]將微流系統(tǒng)和免疫磁性分離技術結合，其CTC的捕獲效率提高到94%，同時保留捕獲細胞的形態(tài)，捕獲的CTC 可在顯微鏡下進行原位觀察，與免疫納米磁珠分離后的CTC 還可繼續(xù)培養(yǎng)觀察。Obermayr等[21]結合密度梯度離心和濃縮、ParsortixTM微流體技術及實時熒光定量聚合酶鏈反應富集CTC，消耗CTC 中污染的白細胞，提高了CTC 富集的純度，從而為臨床研究中CTC 的檢測和分子表征的探索進一步提供了可靠的理論依據(jù)。

2.5 石墨烯材料石墨烯材料是一種由碳原子構成的單層片狀結構的二維納米材料，具有良好的生物相容性，可用以固定抗體分子，制成生物傳感器。石墨烯的表面可以被芳香族苯環(huán)非共價修飾，修飾后的石墨烯電傳導性發(fā)生改變，可以放大生物學效應，提高探測的敏感度。以納米結構為基礎的氧化石墨烯芯片檢測技術，使用高傳導性的石墨烯納米片材料富集CTC 的微流體設備：通過單向磁泳從血細胞中分離出CTC，然后通過電阻信號的變化從富集細胞樣本中鑒別CTC[22]。石墨烯納米片可以改變CTC 表面的傳導性，因此可以提高電信號檢測的精確性。Han 等[23]利用納米石墨烯材料研究出了基于兩種不同的電化學信號——振幅和相位差異的微流體設備來分離和檢測CTC，通過細胞大小和石墨烯納米板表面結合的CTC 的電學性質(zhì)改變的相位差來鑒定CTC。目前，對于石墨烯材料用于CTC 的檢測方法仍在進一步研究中。

2.6 CTC 鑒定方法將血液中可能的CTC 分離出來后，鑒定CTC 的檢測方法則基于CTC 的生物化學或者生物物理的特性，以及CTC 與白細胞表面的抗原特性的差異，通過免疫細胞化學技術、流式細胞分析、細胞化學染色熒光原位雜交技術、聚合酶鏈反應、測序等技術對其鑒定。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應主要檢測外周血中特異mRNA 的表達，但只能定性而不能定量[24]。激光掃描細胞儀作為高通量版的流式細胞儀，可在較短時間內(nèi)（1 h）自動檢測5×104個細胞，并能全面分析CTC 內(nèi)部微結構，連續(xù)掃描成像產(chǎn)生可視化數(shù)據(jù)，現(xiàn)已發(fā)展成標準化操作程序分析，是目前CTC 定量檢測的最佳方法。

3 CTC 在EOC 中的臨床應用價值

3.1 CTC 與CA-125 早期診斷預測EOC 的效果Zhang 等[12]應用免疫磁珠聯(lián)合多重逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應分別檢測109 例新診斷為EOC 患者血液中CTC 和CA-125 的表達情況，CA-125＞35 U/mL為陽性，結果顯示CTC 的陽性率為98%，其中在ⅠA、ⅠB 期患者CTC 和CA-125 的陽性率分別為93%和64%，說明在早期卵巢癌患者檢測CTC 發(fā)現(xiàn)卵巢癌的敏感度較CA-125 更高。2017 年一項前瞻性研究報道了87 例不確定良惡性附件包塊的患者，術前CTC 的富集和檢測區(qū)分卵巢良性腫瘤與卵巢惡性腫瘤的敏感度為77.4%[25]。在一組118例確診為卵巢癌患者中77 例（65.2%）成功分離出CTC，捕獲到了可能有助于診斷不同組織學類型卵巢癌亞型增殖潛能的細胞[26]。上述研究表明，CTC 檢測能在很大程度上提高EOC 早期診斷的敏感度和特異度，血液中檢測到CTC 與卵巢癌的不良臨床結局、CA-125 和人附睪蛋白4（HE4）升高相關[27]。

3.2 治療效果的監(jiān)測研究已證實CTC 的檢測可以判斷腫瘤的預后[28-29]。CTC 的檢測與腫瘤負荷明顯相關，且晚期腫瘤的CTC 檢出率高于局限性腫瘤。在129 例未接受治療的患者中，CTC 檢測Ⅰ期和Ⅱ期EOC 惡性腫瘤的敏感度為41.2%，特異度為95.1%，陽性預測值為77.8%，檢測EOC 所有期次惡性腫瘤的敏感度為83%，陽性預測值為97.3%，且與腫瘤分期、復發(fā)和死亡方面有顯著差異，與化療反應及生存相關[30]。另有研究發(fā)現(xiàn)，123 例EOC 患者血液樣本CTC 計數(shù)的變化與治療反應高度相關，隨訪期間CTC（79.5%）的增加比CA-125（67.6%）更敏感預測進展或復發(fā)；此外，CTC 的存在與較短的總生存期（overall survival，OS）和無進展生存期（progress free survival，PFS）顯著相關[31]。Lee 等[32]研究了54 例EOC患者，發(fā)現(xiàn)檢出CTC≥3 個細胞的患者PFS 下降。最近的一項薈萃分析研究了來自8 項研究的1 184 例卵巢癌患者，結果表明CTC 陽性的患者OS（HR=2.09，95%CI：1.13～3.88）和PFS（HR=1.72；95%CI：1.32～2.25）降低，預后較差[33]。Blassl 等[34]研究認為CTC可用于預測EOC 遠處轉(zhuǎn)移和復發(fā)。因此，對于卵巢癌CTC 的檢測可以用于治療期間的隨訪，判斷療效、預測疾病復發(fā)等。

3.3 CTC 用于指導EOC 精準治療Aktas 等[9]研究發(fā)現(xiàn)，卵巢癌患者CTC 表面的分子標志物或腫瘤抗原可作為生物靶向治療可能的靶點。程序性死亡配體1（PD-L1）能在卵巢癌、結直腸癌和惡性黑色素瘤等多種腫瘤中表達。腫瘤細胞通過免疫抑制機制來阻止免疫細胞消滅異常細胞而生長，免疫細胞對CTC 的生存能力有影響，PD-L1 的表達減少導致轉(zhuǎn)移病灶形成減少[35]。Buderath 等[36]與健康對照者相比，在EOC 患者中可溶性PD-L1 的表達增加，與腫瘤負荷正相關；可溶性PD-L2 表達減少，與鉑耐藥相關。分離酶（Seprase）是表達于侵襲性循環(huán)腫瘤細胞（invasive circulating tumor cell，iCTC）表面的標志物，抗分離酶實驗表明iCTC 可促進原發(fā)灶腫瘤細胞侵入血液形成遠處轉(zhuǎn)移[37]。Geethadevi 等[38]研究表明從血液中捕獲酪氨酸激酶受體陽性的CTC 可用于腫瘤細胞的基因組和蛋白質(zhì)組學表征分析，有助于設計癌癥治療方法，確定癌癥患者對化療藥物效果和耐藥機制。此外，檢測CTC 還可以研究腫瘤細胞轉(zhuǎn)錄的mRNA 和表達的蛋白質(zhì)，這些蛋白質(zhì)可能成為抗腫瘤藥物的作用靶點。

4 結語

提高目前卵巢癌的診治效果需尋求一種高敏感度、特異度的早期腫瘤標志物，卵巢癌CTC 的檢測可以為快速和準確診斷疾病、治療反應的實時監(jiān)測過程提供新的思路。CTC 檢測的優(yōu)勢除了研究DNA序列分析外，還能研究腫瘤細胞表達的mRNA 和蛋白質(zhì)，而許多蛋白質(zhì)是抗腫瘤藥物的實際靶點，可用于個體化治療。CTC 已在許多類型的癌癥中顯示出預后價值，并在EOC 中顯示出比CA-125 更好的監(jiān)測工具價值，CTC 可能成為一種越來越有價值的EOC 檢測工具，特別是在早期階段。目前的檢測方法大多是基于腫瘤細胞表面的抗原抗體反應捕獲CTC，如何篩選鑒別不同腫瘤細胞的標記物仍是一個巨大的挑戰(zhàn)。其次，隨著科學技術的發(fā)展，一系列有前景的新方法已經(jīng)出現(xiàn)，能夠提高血液中CTC 的檢測和分離水平。目前在早期卵巢癌患者的血液中檢測出CTC 的陽性率普遍較低，且結果判斷存在爭議，因此仍然需要繼續(xù)研究出更為完善的CTC 分離與檢測系統(tǒng)。盡管血液CTC 作為一種潛在的診斷和預后的生物標志物已被廣泛研究，但其固有的稀少性和異質(zhì)性給開發(fā)具有臨床顯著特異度和敏感度的CTC 檢測方法帶來了巨大的挑戰(zhàn)，目前仍然缺乏一個統(tǒng)一客觀的標準建立依賴閾值的標準化CTC 診斷技術，因此，定量評估CTC 可以發(fā)揮其高預后價值和檢測耐藥或進展風險增加的能力。