成纖維細(xì)胞來源外泌體在疾病相關(guān)細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)中的作用

胡佳琦 謝臻蔚

浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬婦產(chǎn)科醫(yī)院，浙江省杭州市 310000

成纖維細(xì)胞是介導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)(Extracellular matrix， ECM)重構(gòu)的重要細(xì)胞類型，可產(chǎn)生膠原、彈性蛋白等組成ECM，亦可分泌其降解關(guān)鍵酶——基質(zhì)金屬蛋白酶(Matrix metalloproteinase，MMPs)等分解ECM。當(dāng)成纖維細(xì)胞調(diào)控ECM重構(gòu)過程失衡時(shí)，將引起ECM過度沉積或過度降解，導(dǎo)致器官纖維化、炎癥、皮膚衰老及腫瘤侵襲等[1-2]，但其具體調(diào)控機(jī)制尚不明確。外泌體是一種新型胞間通訊方式，新近研究發(fā)現(xiàn)，成纖維細(xì)胞來源的外泌體可攜帶膠原、MMPs等參與ECM組成及代謝[3-4]，還可以自分泌形式區(qū)域性調(diào)控成纖維細(xì)胞功能，在局灶ECM重構(gòu)中發(fā)揮關(guān)鍵作用，為人體多種疾病病因機(jī)制和治療靶點(diǎn)研究帶來了新思路。

1 成纖維細(xì)胞外泌體簡(jiǎn)介

外泌體(Exosomes)是一類由多種細(xì)胞內(nèi)體—溶酶體途徑產(chǎn)生、直徑40～160nm的胞外囊泡[5]，可聚集并傳遞蛋白、脂質(zhì)及遺傳物質(zhì)等，類似“號(hào)富集器”。由于外泌體具備特有的囊泡結(jié)構(gòu)，保證了信號(hào)群轉(zhuǎn)移的完整性，使胞間信息傳導(dǎo)更精準(zhǔn)和全面[5-6]，因此，其在維持局灶微環(huán)境穩(wěn)態(tài)中的作用日益被關(guān)注。

在病理及生理情況下，成纖維細(xì)胞均可分泌外泌體[7]。早在2006年，Zhang等采用密度梯度離心法成功獲得人滑膜成纖維細(xì)胞來源的外泌體[8]。其后，隨著超濾法、超速離心法、基于聚合物的共沉淀法等外泌體提取技術(shù)的發(fā)展，許多學(xué)者在支氣管、肌肉、滑膜、肝臟等多種組織中獲得成纖維細(xì)胞外泌體[9-13]。目前，成纖維細(xì)胞來源外泌體鑒定方法已較成熟，主要包括以下3點(diǎn)：(1)大小30～100nm[9]；(2)形態(tài)為經(jīng)典的“杯狀”；(3)表達(dá)外泌體相關(guān)蛋白標(biāo)志物?，F(xiàn)較明確的外泌體蛋白標(biāo)志物主要有：腫瘤易感性基因101蛋白、熱休克蛋白70、凋亡誘導(dǎo)因子相互作用蛋白、四跨膜蛋白質(zhì)CD9、CD63和CD81。波形蛋白是成纖維細(xì)胞的蛋白標(biāo)志物，若提取到的外泌體出現(xiàn)波形蛋白，則可認(rèn)為該外泌體來源于成纖維細(xì)胞[10-11]。以上多種鑒定方法的成熟運(yùn)用為成纖維細(xì)胞外泌體的深入研究奠定了基礎(chǔ)。

2 成纖維細(xì)胞外泌體與ECM重構(gòu)

ECM是廣泛存在于人體多種組織中的動(dòng)態(tài)結(jié)構(gòu)，在應(yīng)激條件下，通過不斷的重構(gòu)以維持組織微環(huán)境穩(wěn)態(tài)[14]。ECM主要由膠原蛋白、蛋白聚糖、糖胺聚糖、彈性蛋白、纖連蛋白、層粘連蛋白等組成[14]；并可被多種蛋白酶降解，包括MMPs、聚蛋白多糖酶、組織蛋白酶、肝素酶和硫酸酯酶等[1]，其中，MMPs及其抑制劑(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinases，TIMPs)是其降解關(guān)鍵酶。ECM重構(gòu)過程中的主要環(huán)節(jié)是組分的合成和降解，其他還包括組分的組裝和化學(xué)修飾[1]等。

研究顯示，成纖維細(xì)胞外泌體可能通過參與ECM合成和降解等機(jī)制參與ECM重構(gòu)。2017年，有學(xué)者基于高分辨質(zhì)譜技術(shù)，將人正常傷口中分離出的肌成纖維細(xì)胞的胞外囊泡進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定及功能分析，發(fā)現(xiàn)其中涉及細(xì)胞外基質(zhì)組成的蛋白—膠原分子[4]，且成纖維細(xì)胞來源的外泌體內(nèi)攜帶有MMPs-TIMPs[3]。另有學(xué)者對(duì)腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞(Cancer associated fibroblasts,CAFs)外泌體進(jìn)行高通量測(cè)序，鑒定出了其中含有種類豐富的長(zhǎng)鏈及短鏈非編碼RNA，且外泌體內(nèi)miRNA與ECM重構(gòu)的發(fā)生相關(guān)[7,11]。此外，成纖維細(xì)胞外泌體還可以自分泌方式參與ECM重構(gòu)。將纖維化肺組織來源的原代人肺成纖維細(xì)胞分泌的外泌體作用于正常人肺成纖維細(xì)胞，觀察到外泌體處理后的細(xì)胞內(nèi)纖連蛋白、Ⅰ型膠原和肌腱蛋白C等ECM蛋白的基因表達(dá)下降[15]。上述對(duì)成纖維細(xì)胞外泌體內(nèi)容物的研究，提示成纖維細(xì)胞來源外泌體參與ECM組成和代謝，并存在自分泌作用，是ECM重構(gòu)的重要調(diào)控方式。

3 成纖維細(xì)胞外泌體在不同疾病相關(guān)ECM重構(gòu)中的作用

越來越多的研究表明，成纖維細(xì)胞來源外泌體攜帶蛋白、RNA等信號(hào)分子，通過傳遞胞間信息來調(diào)控ECM重構(gòu)，參與組織損傷修復(fù)、細(xì)胞遷移等病理生理過程，與皮膚老化、腫瘤、炎癥等疾病密切相關(guān)。部分證據(jù)顯示，外源性給予成纖維細(xì)胞來源外泌體，可改善組織ECM重構(gòu)病理狀態(tài)，有望治療疾病，具潛在臨床應(yīng)用價(jià)值[16-17]。

3.1 成纖維細(xì)胞外泌體與皮膚衰老 ECM重構(gòu)紊亂導(dǎo)致其膠原組分改變是皮膚老化的重要特征[18]。紫外線照射下，皮膚Ⅰ型前膠原分子合成減少而MMPs合成增加，使局部組織膠原蛋白缺乏，從而引起皮膚彈性缺失、產(chǎn)生皺紋。皮膚成纖維細(xì)胞可分泌外泌體，促進(jìn)Ⅰ型前膠原分子及TIMPs的表達(dá)，通過介導(dǎo)ECM重構(gòu)改善皮膚老化現(xiàn)象。Hu等[16]通過構(gòu)建紫外線誘導(dǎo)皮膚衰老的小鼠模型，在其背部皮膚局部注射人真皮成纖維細(xì)胞外泌體，發(fā)現(xiàn)注射區(qū)域內(nèi)膠原纖維豐富且致密、ECM重構(gòu)蛋白MMP-1表達(dá)下調(diào)而TIMP 1-2表達(dá)上調(diào)，提示成纖維細(xì)胞外泌體可通過抑制膠原降解來改善皮膚膠原含量。

成纖維細(xì)胞來源外泌體對(duì)皮膚衰老具有潛在的治療前景。尤其是研究發(fā)現(xiàn)，小鼠局部皮膚注射人真皮成纖維細(xì)胞外泌體比注射間充質(zhì)干細(xì)胞外泌體，更能增加局部組織內(nèi)Ⅰ型前膠原分子表達(dá)[16]，其具體機(jī)制可能與轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β(Transforming growth factor-beta,TGF-β)、IL-1β、腫瘤壞死因子-α等因子表達(dá)改變有關(guān)。其中，TGF-β是公認(rèn)的ECM生物合成的主要調(diào)節(jié)分子，可上調(diào)膠原蛋白、彈性蛋白、纖連蛋白、肌腱蛋白等多種ECM蛋白的表達(dá)[19]。該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)異常將引起膠原蛋白合成減少、ECM重構(gòu)障礙，使真皮中膠原蛋白呈碎片狀、粗分布[20]。而外源性人真皮成纖維細(xì)胞外泌體注射可促進(jìn)小鼠皮膚TGF-β高表達(dá)。通過激活TGF-β信號(hào)通路，成纖維細(xì)胞外泌體發(fā)揮局部組織的抗衰老效應(yīng)。

3.2 成纖維細(xì)胞外泌體與腫瘤 在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，ECM發(fā)生了重構(gòu)，這種重構(gòu)最重要的特征表現(xiàn)為ECM的分子組成的改變，重構(gòu)后的ECM為腫瘤細(xì)胞的增殖、分化創(chuàng)造了一個(gè)寬松的微環(huán)境，導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移和浸潤(rùn)生長(zhǎng)[21]。其中，MMPs的水解作用是導(dǎo)致 ECM 重構(gòu)的主要原因。

CAFs是腫瘤組織中持續(xù)活化的成纖維細(xì)胞，其所產(chǎn)生的外泌體在腫瘤微環(huán)境中起信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用，誘導(dǎo)細(xì)胞外基質(zhì)降解和重構(gòu)。研究顯示，口腔鱗狀細(xì)胞癌組織中CAFs來源的外泌體內(nèi)miR-34a-5p含量較正常成纖維細(xì)胞外泌體下降， miR-34a-5p可經(jīng)外泌體途徑傳遞至腫瘤細(xì)胞，直接結(jié)合于受體酪氨酸激酶AXL(Aexekleto，AXL)靶基因，經(jīng)糖原合成酶激酶-3β/β-連環(huán)蛋白/鋅指轉(zhuǎn)錄因子snail信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，調(diào)控E-鈣黏蛋白和MMPs的表達(dá)[22]。將腫瘤細(xì)胞內(nèi)miR-34a-5p分子過表達(dá)，發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)E-鈣黏蛋白表達(dá)水平同樣升高，MMP-2和MMP-9表達(dá)下降。已知基底膜由Ⅳ型膠原蛋白、層粘連蛋白、巢蛋白、蛋白多糖如聚集蛋白和硫酸乙酰肝素蛋白多糖核心蛋白等組成[14]，而MMP-2及MMP-9可參與其中多種成分的降解。因此，CAFs所分泌的含低水平miR-34a-5p的外泌體作用于口腔鱗癌細(xì)胞，經(jīng)AXL/GSK-3β/β-catenin/snail信號(hào)通路，調(diào)控MMP-2及MMP-9的表達(dá)，從而參與基底膜降解，在腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移中發(fā)揮了重要作用。

3.3 成纖維細(xì)胞外泌體與炎癥 炎癥作為組織重構(gòu)的重要驅(qū)動(dòng)因素，導(dǎo)致了骨組織慢性重塑，其所導(dǎo)致的組織損傷與基質(zhì)降解酶密切相關(guān)。MMPs在炎癥條件下表達(dá)增加，活性增強(qiáng)，且與炎癥的嚴(yán)重程度有關(guān)[23]。炎癥組織中MMPs及含血小板結(jié)合蛋白基序的解聚蛋白樣金屬蛋白酶(A disintegrin and metalloprotease with thrombospondin motifs, ADAMTS)等酶的活化，參與基膜及間質(zhì)膠原的降解，導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)重構(gòu)。

炎癥組織中，成纖維細(xì)胞外泌體下調(diào)軟骨細(xì)胞膠原表達(dá)，而促進(jìn)膠原降解相關(guān)酶的表達(dá)，引起ECM過度降解。Kato等將白介素-1β(Interleukin，IL-1β)刺激人滑膜成纖維細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外泌體釋放增加，將外泌體與關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞共培養(yǎng)24h，結(jié)果顯示，與未受IL-1β處理的成纖維細(xì)胞來源外泌體相比，IL-1β刺激組中軟骨細(xì)胞內(nèi)MMP-13、ADAMTS-5表達(dá)上調(diào)，聚集蛋白聚糖、Ⅱ型膠原蛋白表達(dá)下降[13]。而在軟骨關(guān)節(jié)中，ECM主要由Ⅱ型膠原蛋白和蛋白聚糖組成，MMP-13被認(rèn)為是骨關(guān)節(jié)炎疾病中降解ECM的主要酶類，且ADAMTS-5具有降解蛋白聚糖的能力。兩者的上調(diào)將引起骨關(guān)節(jié)中細(xì)胞外基質(zhì)的過度降解，結(jié)合胞外基質(zhì)成分合成減少，最終導(dǎo)致骨關(guān)節(jié)的破壞。在牙周炎進(jìn)展中，Zhao等發(fā)現(xiàn)經(jīng)脂多糖處理的成纖維細(xì)胞來源外泌體，可下調(diào)人成骨細(xì)胞內(nèi)的堿性磷酸酶、Ⅰ型膠原蛋白等骨特異性基質(zhì)蛋白的表達(dá)水平[24]，且Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2與骨保護(hù)素的表達(dá)下降共同參與了胞外基質(zhì)重構(gòu)過程[25]。上述研究均提示成纖維細(xì)胞外泌體在炎癥疾病ECM重構(gòu)過程中發(fā)揮重要作用。

3.4 成纖維細(xì)胞外泌體與纖維化 纖維化是一種主要由成纖維細(xì)胞介導(dǎo)的過度細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生和沉積的疾病，表現(xiàn)為膠原纖維的過度沉積，各類型膠原比例失衡，排列紊亂，可發(fā)生在多種組織器官中[1]。Ⅰ、Ⅲ型膠原的過度表達(dá)及早期膠原酶活性的增加，晚期活性的降低，導(dǎo)致膠原蛋白網(wǎng)絡(luò)發(fā)生改變[26]。ECM合成和降解之間的失衡致使ECM重構(gòu)障礙。

在肝纖維化疾病中，肝星狀細(xì)胞作為損傷后分化為肌成纖維細(xì)胞的主要來源，經(jīng)血小板源性生長(zhǎng)因子刺激后，分泌富含血小板源性生長(zhǎng)因子受體α的外泌體，以酪氨酸磷酸酶依賴性方式，促進(jìn)體外HSCs的遷移和體內(nèi)肝纖維化的發(fā)生[12]。在肺纖維化疾病中，人肺成纖維細(xì)胞來源外泌體以自分泌方式作用于成纖維細(xì)胞后，成纖維細(xì)胞代謝活性及增殖能力增強(qiáng)[15]。用TGF-β刺激人肺成纖維細(xì)胞，可增加外泌體內(nèi)Wnt蛋白家族成員5a含量，進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞增殖，參與肺纖維化進(jìn)展。此外，miRNA也可經(jīng)成纖維細(xì)胞分泌，經(jīng)外泌體途徑參與纖維化疾病的進(jìn)展。在杜氏肌營(yíng)養(yǎng)不良疾病中，肌組織成纖維細(xì)胞來源外泌體內(nèi)所含的miR-199a-5p水平顯著升高，將正常成纖維細(xì)胞與DMD成纖維細(xì)胞源性外泌體共培養(yǎng)后，細(xì)胞增殖能力增強(qiáng)，成纖維細(xì)胞中Ⅰ型膠原蛋白、纖連蛋白、TIMP-1和TGF-β等纖維化相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄水平上升，胞外膠原沉積增加[11]。然而，Shannon等發(fā)現(xiàn)活化的成纖維細(xì)胞來源的外泌體存在對(duì)鄰近原始成纖維細(xì)胞的抗纖維化作用，且其內(nèi)含有高水平的抗纖維化分子[27]。深入研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)β-連環(huán)蛋白和轉(zhuǎn)錄因子Gata4的皮膚成纖維細(xì)胞來源的外泌體可減少小鼠脛骨前肌纖維化并改善小鼠運(yùn)動(dòng)能力[17]。因此，成纖維細(xì)胞外泌體內(nèi)關(guān)鍵信號(hào)分子對(duì)纖維化的作用仍有待進(jìn)一步研究。

4 展望

成纖維細(xì)胞是參與ECM重構(gòu)的重要細(xì)胞，通過細(xì)胞與細(xì)胞間通訊，參與組織ECM成分合成與降解的穩(wěn)態(tài)維持。外泌體作為胞間信號(hào)傳遞的一種方式，參與纖維化、炎癥等疾病的進(jìn)展。現(xiàn)認(rèn)為成纖維細(xì)胞來源外泌體可以自分泌方式調(diào)控其細(xì)胞活性，而外泌體內(nèi)攜帶的蛋白質(zhì)、RNA等信號(hào)分子在ECM重構(gòu)中可能發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。在纖維化疾病的研究中發(fā)現(xiàn)，疾病組織中的成纖維細(xì)胞分泌的外泌體可促進(jìn)正常成纖維細(xì)胞纖維化相關(guān)基因的表達(dá)。近年來，在皮膚衰老的研究中發(fā)現(xiàn)成纖維細(xì)胞來源的外泌體是一種極具前景治療方式。因此，深入闡明成纖維細(xì)胞來源外泌體在ECM重構(gòu)相關(guān)疾病中的作用，以外泌體為載體，從而改變病理狀態(tài)下的細(xì)胞外基質(zhì)，這將為更多的疾病治療提供思路。