多發(fā)性特發(fā)牙頸部外吸收患者TNFRSF11A基因突變分析

劉佼佼， 王 晨， 趙祥宇， 董囡囡

1.北部戰(zhàn)區(qū)總醫(yī)院 口腔科，遼寧 沈陽 110016；2.大連市第二人民醫(yī)院 口腔科，遼寧 大連 116031；3.沈陽市口腔醫(yī)院，遼寧 沈陽110002

特發(fā)性牙頸部外吸收是臨床上的罕見病，而多發(fā)性特發(fā)牙頸部外吸收(multiple idiopathic cervical root resorption，MICRR)則更為罕見，其發(fā)生在上皮附著下方的牙根頸部表面，是牙周膜中吸收性細胞進行性破壞牙體硬組織的結(jié)果[1]。MICRR發(fā)生在同一牙列中，同時累及超過3顆牙齒，其特發(fā)性表現(xiàn)為無相關(guān)口腔疾病、無全身系統(tǒng)疾病及無家族遺傳性。MICRR發(fā)病率低，病因復雜不明，因其特殊的發(fā)生部位及侵襲性特征，早期發(fā)現(xiàn)較為困難，臨床治療難度高，患牙預后不良導致多數(shù)被拔除[2]。RANKL-RANK-OPG軸是破骨細胞分化和功能的中央調(diào)節(jié)劑，其突變會導致骨骼異常相關(guān)疾病[3]。其中，編碼蛋白質(zhì)RANK的TNFRSF11A基因發(fā)生突變是造成多種溶骨性骨改建異常疾病的原因，如家族性消耗性骨質(zhì)溶解癥、畸形性骨炎和消耗性骨高磷酸酶癥，這3種疾病患者TNFRSF11A基因1號外顯子上均有串聯(lián)性重復發(fā)生[4-6],且均伴有牙根外吸收性病變[7]。目前，國內(nèi)外對MICRR的相關(guān)基因?qū)W研究少見報道。本研究旨在探討MICRR患者的TNFRSF11A基因突變情況。現(xiàn)報道如下。

1 對象與方法

1.1 研究對象 本研究納入2例MICRR患者、1例家系成員及5例健康者為研究對象。MICRR診斷根據(jù)X線影像牙頸部區(qū)域的透射影及環(huán)繞髓腔外周的牙本質(zhì)層的阻射影[8]。健康者為各項常規(guī)性檢查及口腔臨床檢查確認為無系統(tǒng)性疾病及MICRR者。病例1，男性，16歲，右上前牙因松動致拔除一周余，一周前曾因“牙周感染”拔除13。病例2，女性，23歲，左上頜前牙咬硬物疼痛四月余，10余年前曾經(jīng)佩戴全牙列固定矯治器進行正畸治療1.5年。2例患者均無系統(tǒng)性疾病史、頜面部外傷史；家族成員中無類似疾病發(fā)生；無特殊嗜好及藥物過敏史。2例患者X線影像檢查均可見涉及上下頜多個牙齒的牙根頸部不同范圍的X線透射影，范圍從局限于牙根頸1/3到累及牙冠頸1/3不等。所有患牙根管腔外均有線狀阻光帶包繞根管外形。與被吸收根頸部相鄰的牙槽嵴骨密度減低。其中，除病例2患者的22根頸部被完全吸收致冠根分離外，雖錐束計算機斷層掃描(cone-beam computed tomography，CBCT)顯示缺損區(qū)域較大，但大多未累及牙髓。見圖1、2。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準。所有研究對象均簽署知情同意書。

圖1 病例2患者21牙CBCT圖像(矢狀位) 圖2 病例2患者25牙CBCT圖像(矢狀位)

1.2 研究方法 采集所有研究對象清晨空腹血液樣品4.0 ml,K2EDTA抗凝，備檢。采用基因組DNA試劑盒(Promega，美國)提取外周血DNA，按試劑盒說明書操作。提取的產(chǎn)物DNA定量。以提取到的基因組DNA為模板，以GenBank公布的TNFRSF11A基因序列為參考序列，設(shè)計引物對TNFRSF11A基因1號外顯子序列(113bp)進行PCR擴增。目標DNA擴增產(chǎn)物分子量為415 bp。引物設(shè)計如下，上游引物：5，-ACCGCAAACCAGGGGAGCTT-3′，下游引物：5′-CTCCCCAGCTTCCCACGGC-3′。PCR反應總體積為50 μl。測序PCR熱循環(huán)條件：94℃、3 min(98℃、10 s，58℃、10 s，72℃、30 s)，共35個循環(huán)，72℃、5 min，4℃保溫。采用普通瓊脂糖凝膠DNA(天根生物)回收試劑盒進行目的片段的回收，按試劑盒說明書操作。委托北京奧科生物技術(shù)有限責任公司進行純化及測序鑒定。

1.3 統(tǒng)計學方法 測序結(jié)果采用Sequencher 5.0軟件與GenBank提供的序列進行比對分析。

2 結(jié)果

2.1 受試者基因組DNA提取后電泳結(jié)果 將提取后的受試者基因組DNA進行瓊脂糖凝膠電泳，顯示為一高分子量的單一條帶。見圖3。

圖3 基因組DNA提取(M為 HindⅢ/λ DNA分子量標準；1～2為MICRR患者DNA；3為家系成員DNA；4～8為健康者DNA)

2.2 TNFRSF11A基因1號外顯子獲取后的電泳結(jié)果 將PCR產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，顯示為一單一條帶，分子量為415 bp。見圖4。

圖4 TNFRSF11A 基因1號外顯子的獲取(M為DL2000 DNA分子量標準；1～2為MICRR患者TNFRSF11A基因1號外顯子；3為家系成員TNFRSF11A基因1號外顯子；4～8為健康者TNFRSF11A基因1號外顯子)

2.3 目的片段純化后的電泳結(jié)果 將切膠回收后的目的片段(PCR產(chǎn)物)進行瓊脂糖凝膠電泳，顯示為一單一條帶，分子量為415 bp。見圖5。

圖5 目的片段的純化(M為DL2000 DNA分子量標準；1～2為MICRR患者DNA；3為家系成員DNA；4～8為健康者DNA)

2.4 純化后PCR產(chǎn)物的測序結(jié)果 3′ACCGCAAACCAGGGGAGCTTGGGCACCACCTGGCTGGCA CCGCCGGGCCCGGCCGGAGGGGGGCGCAGGAGGG CGGCGCGGGGGCAGGTGCGGGGCGGGGCACGGGG GCGGGACCACACAGGGCCGCGGCAGCCGCGCCCG CTGGGCCACAGAGGCCGCTGAGGCCGCGGCGCCC GCCAGCCTGTCCCGCGCCATGGCCCCGCGCGCCCG GCGGCGCCGCCCGCTGTTCGCGCTGCTGCTGCTCTG CGCGCTGCTCGCCCGGCTGCAGGTAAGGAGCGCCC GCGCCTGCCGGGCCGCGCGGCCCGACGCCTCCTCG GGAGCCCCGGGAAGGGCCGGGGCCGGCGGCATCCT GGCTCCTCCGCCTT5′

2.5 序列同源性的比對 將測序結(jié)果與GenBank公布的序列進行比對，未發(fā)現(xiàn)目標基因位點，編碼蛋白質(zhì)RANK的TNFRSF11A基因1號外顯子有突變發(fā)生。測序片段(上)與正常序列(下)一致，即所得序列與已公布序列的同源性為100%。見圖6。

圖6 序列同源性比對結(jié)果

3 討論

MICRR發(fā)病率低，國內(nèi)外相關(guān)報道僅數(shù)十例，多發(fā)于年輕女性[9-11]。由于MICRR病變發(fā)生在除牙髓外的牙體組織內(nèi)，因此，即使到了晚期也常無任何癥狀。MICRR患牙一般仍為活髓，對電活力檢測及叩診反應也多在正常范圍內(nèi)，多由常規(guī)X線檢查時偶然發(fā)現(xiàn)[12]。本研究的2例MICRR患者均在咬硬物引起患牙病理性根折并疼痛，就診時經(jīng)X線檢查顯示多數(shù)牙齒牙根外吸收引起注意。病例2患者否認系統(tǒng)性疾病史、頜面部外傷史及家族史，曾于10余年前接受過全牙列固定矯治器進行正畸治療1.5年余。雖然急性(牙合)創(chuàng)傷、過度矯治力和牙冠內(nèi)漂白等是根頸部吸收的病因，但由于正畸治療結(jié)束距發(fā)現(xiàn)該病間隔久遠，因此，不能確定該治療是其多數(shù)牙齒牙根外吸收發(fā)生的直接病因[13]。

由于等位基因發(fā)生突變的頻率隨著受檢對象的不同而有區(qū)別[14]，本著同族人群的原則，本研究選取了漢族健康者為對照，以消除有可能因人種不同而形成的干擾。健康者經(jīng)由各項常規(guī)性檢查及口腔臨床檢查確認為無系統(tǒng)性疾病及MICRR。OPG、RANK、RANKL是偶聯(lián)成骨細胞、基質(zhì)細胞和破骨細胞分化、活化與生物活性的3種主要細胞因子。TNFRSF11A是編碼蛋白質(zhì)RANK的基因，其在骨組織內(nèi)高度表達，且在破骨細胞的分化活動中發(fā)揮著重要的作用。有研究發(fā)現(xiàn)，TNFRSF11A基因發(fā)生突變是造成多種異常性骨吸收病變的原因，此類突變導致RANK的信號肽區(qū)域產(chǎn)生了新的氨基酸插入，肽結(jié)構(gòu)的改變降低了信號肽的正常裂解，增加了RANK的信號傳導，破骨活動增強[15]。值得注意的是，家族性消耗性骨質(zhì)溶解癥患者的主要牙齒病變特征是涉及多個恒牙的特發(fā)性根頸部吸收和牙髓組織的多發(fā)性髓石，在臨床表現(xiàn)、好發(fā)年齡和組織病理學特征上與MICRR類似[16]。而一項有關(guān)正畸導致的根尖部外吸收的基因?qū)W研究表明，基因TNFRSF11A的多態(tài)性與上頜中切牙根尖部外吸收有關(guān)聯(lián)[17]。另有研究對家族性MICRR患者的30年隨訪報道中也提示致病基因存在的可能性[18]。以上研究提示，特發(fā)性牙頸部吸收，特別是MICRR的發(fā)病可能存在遺傳學基礎(chǔ)。因此，筆者推斷MICRR的發(fā)病可能也與該基因某種形式的突變有關(guān)。

本研究得到的序列經(jīng)與GenBank公布的序列比對后，未能發(fā)現(xiàn)目標基因位點，即MICRR患者編碼蛋白質(zhì)RANK的TNFRSF11A基因1號外顯子無突變發(fā)生，可初步說明該疾病的發(fā)生與此基因位點無關(guān)。但因本研究納入例數(shù)較少，且研究操作過程中可能有誤差產(chǎn)生，因此，兩者之間的關(guān)系尚不能定論。由于在RANKL-RANK-OPG軸中，編碼RANKL、RANK及OPG的基因分別有5、10和5個外顯子，所以該疾病的致病基因突變可能存在于其他相關(guān)基因中，進一步外顯子測序?qū)⒂兄谥虏』虻拇_定。

綜上所述，多發(fā)性特發(fā)牙頸部外吸收患者TNFRSF11A基因1號外顯子無突變，排除其為該疾病致病基因的可能性。