曹允馨,張寧,常智慧
(北京林業(yè)大學(xué)草業(yè)與草原學(xué)院,北京 100083)
污泥是污水處理廠凈化處理污水時(shí)產(chǎn)生的不包括柵渣、浮渣和沉砂池沙礫的廢棄物[1]。污泥不僅可以提高植物氮素和水分利用效率,促進(jìn)其在干旱條件下的生長(zhǎng)[2-4],而且可以提高土壤的生物和化學(xué)性質(zhì),促進(jìn)土壤微生物的活性[5-7],增加土壤中細(xì)菌和放線菌的數(shù)量[8-9]。
污泥中富含多種生物活性物質(zhì)[10-11],這是污泥對(duì)微生物產(chǎn)生影響的原因,如含有作為酶促底物的有機(jī)碳、有機(jī)氮[12-13]等可以促進(jìn)土壤微生物生長(zhǎng)和分泌各種酶[14]。研究表明施入污泥可以提高土壤酶活性[15];污泥復(fù)混肥可以增加硝化細(xì)菌和好氣性纖維素分解細(xì)菌數(shù)量,提高放線菌和氨化細(xì)菌的活性[16]。此外污泥堆肥也可以顯著提高微生物量碳氮和土壤微生物量[12,17],增加土壤中一些酶如脲酶、過氧化氫酶等的含量,從而改善土壤結(jié)構(gòu)[18-20]。
微生物以污泥中的生物活性物質(zhì)為基質(zhì),可以產(chǎn)生并向土壤中釋放激素[21]。許多獨(dú)立生長(zhǎng)的微生物都可以合成植物激素,如生長(zhǎng)素、赤霉素、類激動(dòng)素物質(zhì)等[22]。因此,污泥可以通過影響微生物,間接影響植物生長(zhǎng)。吲哚-3乙酸(indole-3-acetic acid,IAA)是天然植物生長(zhǎng)素的主要活性成分[23]。近年來發(fā)現(xiàn)的與生長(zhǎng)素合成相關(guān)的重要催化酶系和克隆的關(guān)鍵調(diào)控基因多數(shù)通過依賴色氨酸(Trp-dependent pathway)合成途徑合成[24]。此外,在植物體內(nèi)還存在其他生長(zhǎng)素,如吲哚丁酸(indole-3-bu- tyric acid,IBA)和4-氯吲哚-3-乙酸(4-chloroindole- 3-acetie acid,4-CI-IAA)等[25]。有研究表明,吲哚乙酸與吲哚丁酸的生理功能相似,但吲哚乙酸在植物體外易降解。與吲哚乙酸相比,吲哚丁酸不易被光分解,比較穩(wěn)定[22,24]。
草地早熟禾(Poapratensis)是一種優(yōu)質(zhì)的冷季型草坪草,適應(yīng)性廣、綠期長(zhǎng),坪質(zhì)優(yōu)美,是我國(guó)北方地區(qū)常用的建坪草種[26]。但草地早熟禾具有生長(zhǎng)緩慢、抗旱性不強(qiáng)的特性,影響其坪用質(zhì)量和效率[27]。本試驗(yàn)用硝酸銨與污泥提供等量氮素,研究干旱脅迫下污泥和生長(zhǎng)素對(duì)草地早熟禾生長(zhǎng)和土壤微生物的影響,觀察草地早熟禾的耐旱性,探究污泥提高草地早熟禾抗旱性的機(jī)理。
試驗(yàn)所用草種是草地早熟禾品種午夜,播種量為15 g/m2;基質(zhì)是煅燒黏土(profile products,Chicago),經(jīng)800℃高溫煅燒,不含任何營(yíng)養(yǎng)物質(zhì);污泥取自北京某污水處理廠,其含水量為84.7%,pH值為5.36,全氮含量66.6 mg/g,磷含量68.9 mg/g,鉀含量13.3 mg/g,有機(jī)質(zhì)含量72.6%,腐殖酸含量40.0%。試驗(yàn)所用氮肥是硝酸銨溶液與污泥,除氮素外的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)由無氮霍格蘭營(yíng)養(yǎng)液提供。
試驗(yàn)處理分為施用污泥和不施用污泥兩類,為保證所有處理能為草地早熟禾提供等量的有效氮素,需要用幾個(gè)梯度濃度的硝酸銨溶液和一定量的污泥處理草地早熟禾以測(cè)定污泥中的有效氮含量。
試驗(yàn)在光照培養(yǎng)箱中進(jìn)行,日/夜溫度為24℃/18℃,光照14 h,光強(qiáng)600 μmol/(m2·s)。采用直徑16 cm,深10 cm 的聚乙烯塑料盆,每盆裝0.7 kg 煅燒黏土。播種前澆水,使每盆的土壤含水量達(dá)到90%田間持水量。
試驗(yàn)采用隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì),設(shè)6個(gè)處理:1)對(duì)照;2)25 mg/kg氮素;3)50 mg/kg氮素;4)75 mg/kg氮素;5)15 g未添加色氨酸的污泥(UB);6)15 g添加20 μmol/g色氨酸的污泥(TB)。每個(gè)處理5次重復(fù)。前4個(gè)處理利用8 mg/mL 硝酸銨溶液提供氮素(具體添加量根據(jù)土重進(jìn)行換算),后兩個(gè)處理利用污泥提供氮素,硝酸銨溶液分別在播種前、播種15 d、播種30 d 分3次等量加入,污泥在播種前用水調(diào)成勻漿加入基質(zhì)中,混合均勻。
試驗(yàn)持續(xù)8周,全程保持充足的澆水,所有處理用無氮霍格蘭溶液提供除氮素外的其他營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。定期修剪,保持草坪草高度為8~10 cm,將每次修剪所得的草屑收集,烘干保存。試驗(yàn)結(jié)束后,將所有地上部分全部收集烘干,與之前收集的樣品合并,采用凱氏定氮法[28]測(cè)定各處理草坪草的全氮含量。
利用前4個(gè)處理的數(shù)據(jù)作出氮攝入量Y(mg/盆)和氮施用量X(mg/kg)的標(biāo)準(zhǔn)曲線,并得出線性方程:Y= 0.339 6X+7.058 2(R2=0.942 3)。通過方程計(jì)算出未添加色氨酸的污泥的有效氮含量為2.339 mg/g,添加色氨酸的污泥的有效氮含量為2.577 mg/g。而后的試驗(yàn)中要施用75 mg/kg氮素所需的UB、TB添加量分別為:19.87 g/kg和18.03 g/kg。
試驗(yàn)在北京林業(yè)大學(xué)氣象站溫室進(jìn)行,日夜溫度約為29℃/17℃,光照時(shí)間為13 h,光照強(qiáng)度約600 μmol/(m2·s)。
采用裂區(qū)設(shè)計(jì),主處理為水分條件,包括:(1)充分澆水:土壤水分含量保持在90%田間持水量;(2)干旱處理:不澆水,草坪自然干旱,待土壤水分含量降至25%田間持水量時(shí)復(fù)水,保持90%田間持水量一周。副處理有5個(gè):(1)對(duì)照CK;(2)吲哚丁酸處理IBA(2 μmol/L);(3)未加色氨酸的污泥處理UB(19.87 g/kg);(4)添加色氨酸的污泥處理TB(18.03 g/kg);(5)色氨酸處理TRP(360.6 μmol/kg),每處理4個(gè)重復(fù)。IBA 的施用量經(jīng)計(jì)算后是0.365 mg/盆(相當(dāng)于70%田間持水量時(shí)濃度為2 μmol/L 的IBA)。色氨酸的用量與TB 處理中的色氨酸含量相等。所有處理的氮施入量為75 mg/kg。污泥在播種前用水調(diào)成勻漿均勻混入基質(zhì)中,IBA、TRP 配成溶液,播種前均勻混入基質(zhì)中,硝酸銨溶液分別在播種前、播種15 d、播種30 d 分3次等量加入。2016年4月20日播種,在25 cm×25 cm的方形塑料花盆中裝入2.5 kg煅燒黏土,澆透水靜置一段時(shí)間后,土表與盆沿距離不超過1 cm為宜。播種前及整個(gè)生長(zhǎng)期內(nèi)保持充足的澆水,土壤含水量達(dá)到90%田間持水量。
取樣時(shí)間分別為:干旱處理組土壤水分含量分別為田間持水量的90%、50%、30%、25%和90%(復(fù)水一周后)時(shí),具體時(shí)間為7月7日、7月14日、8月3日、8月11日和8月19日。
草坪坪觀質(zhì)量參考楊燕等[29]的方法,9分制,依據(jù)草坪顏色、均一度、蓋度等方面打分,1代表草坪完全死亡,9代表草坪顏色濃綠、稠密、均一,有茂盛的地上莖葉,6代表可接受的最低草坪質(zhì)量水平[3];目測(cè)草坪葉片測(cè)定葉片萎蔫度,從0到100%,0代表葉冠完全,100%代表永久萎蔫;相對(duì)含水量采用飽和稱重法[4]。使用Li-6400 光合儀測(cè)定草地早熟禾葉片光合速率。微生物總量采用改良后的氯仿熏蒸浸提法[30]測(cè)定。土壤微生物群落結(jié)構(gòu)在干旱處理開始前(7月7日),取干旱脅迫組的各處理的土壤樣品(每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)),送至美吉生物公司做16S rRNA 測(cè)序,以測(cè)定干旱脅迫開始前不同處理的土壤微生物多樣性。
使用Microsoft Excel 2007 軟件整理原始數(shù)據(jù)、繪制圖表,用SPSS 20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析。
2.1.1 坪觀質(zhì)量 充分澆水條件下,各處理的坪觀質(zhì)量基本沒有顯著變化,整體來看,兩種污泥處理的坪觀質(zhì)量高于對(duì)照(表1),污泥處理可以顯著提高草地早熟禾的坪觀質(zhì)量。干旱處理情況下,各處理的坪觀質(zhì)量隨土壤含水量的下降而下降,復(fù)水一周后顯著恢復(fù)。干旱期間,IBA處理與空白對(duì)照的坪觀質(zhì)量無顯著差異,TRP、UB和TB 處理可以顯著降低干旱對(duì)草地早熟禾坪觀質(zhì)量的損傷。
表1 2種水分條件下草地早熟禾的坪觀質(zhì)量
2.1.2 葉片相對(duì)含水量 充分澆水條件下,純污泥處理的葉片相對(duì)含水量在試驗(yàn)過程中無顯著變化,CK、IBA、TB和TRP處理均在8月3日顯著上升,之后無顯著變化(表2)。 單獨(dú)施用IBA和TRP只能在試驗(yàn)前期提高草地早熟禾的葉片相對(duì)含水量,而施用兩種污泥能顯著提高草地早熟禾葉片的相對(duì)含水量(P<0.05)。
表2 2種水分條件下草地早熟禾葉片的相對(duì)含水量
干旱脅迫條件下,各處理葉片相對(duì)含水量均從脅迫之初開始一直顯著下降,復(fù)水一周后顯著回升。干旱處理期間,4個(gè)處理的葉片相對(duì)含水量均顯著高于對(duì)照(P<0.05),IBA、UB、TB和TRP處理都能在干旱脅迫下減緩草地早熟禾葉片相對(duì)含水量的下降,UB、TB 和TRP 對(duì)葉片相對(duì)含水量的影響比IBA 處理更顯著。
2.1.3 葉片萎蔫度 充分澆水條件下的各處理葉片萎蔫度無顯著變化。干旱脅迫下,各處理的葉片萎蔫度都隨著土壤水分含量的下降而顯著上升,復(fù)水后顯著下降(表3)。干旱處理期間,IBA、UB、TB 和TRP處理的葉片萎蔫度都顯著低于對(duì)照(P<0.05)。復(fù)水一周后,對(duì)照組的葉片萎蔫度仍然顯著高于其他處理(P<0.05)。說明,IBA、UB、TB 和TRP 處理均能在干旱脅迫下緩減草地早熟禾的萎蔫,且在復(fù)水后可以加快草坪草的恢復(fù)速度。
表3 干旱脅迫下草地早熟禾葉片的萎蔫度
2.1.4 光合速率 充分澆水條件下,各處理的光合速率在試驗(yàn)過程中均無明顯變化(表4),污泥處理和激素處理都可以顯著提高草地早熟禾的光合速率。試驗(yàn)后期,UB、TB 和TRP 處理的光合速率顯著高于IBA(P<0.05),說明在試驗(yàn)后期,UB、TB 和TRP 對(duì)草地早熟禾的光合速率的影響比IBA 處理更顯著。
表4 2種水分條件下草地早熟禾葉片的光合速率
干旱脅迫下,所有處理的光合速率均隨著土壤水分含量的下降而降低,在8月11日達(dá)到最低,8月19日(復(fù)水一周后)有所回升。與對(duì)照相比,TRP、UB 和TB 處理能顯著提高干旱脅迫下草地早熟禾的光合速率,IBA也可以提高其光合速率,但差異不顯著,總體上污泥處理的影響比激素處理更顯著。
2.2.1 土壤微生物量碳 充分澆水條件下,處理間微生物量碳的關(guān)系為UB、TB>IBA、TRP>CK,IBA、TRP、UB和TB處理在充分澆水條件下都能夠提高土壤微生物量碳,但污泥處理的影響比激素處理更顯著。
干旱處理下,各處理的土壤微生物總量均在8月11日(土壤水分含量降至25%田間持水量)顯著下降(P<0.05),又在復(fù)水一周后顯著回升,且與對(duì)照差異顯著(P<0.05)。在干旱脅迫下,IBA和TRP處理均能顯著提高土壤微生物量碳,UB和TB處理也能顯著提高土壤微生物量碳的含量,且效果明顯優(yōu)于IBA和TRP處理。
2.2.2 土壤微生物生物多樣性 稀釋性曲線[31]用來比較測(cè)序數(shù)據(jù)量不同的樣本中物種的豐富度,也用來說明樣本的測(cè)序數(shù)據(jù)量是否合理。
Shannon-Wiener反映樣本中微生物多樣性的指數(shù)[32],以此反映各樣本在不同測(cè)序數(shù)量時(shí)的微生物多樣性。由圖1和圖2可知,本試驗(yàn)的數(shù)據(jù)量是合理的。
表5 2種水分條件下草地早熟禾土壤的微生物量碳
圖1 稀釋曲線Fig.1 Rarefaction curve
圖2 Shannon-Wiener 曲線Fig.2 Shannon-Wiener curve
此外,Shannon指數(shù)越高代表生物多樣性越高。充分澆水條件下,UB 處理的土壤微生物多樣性顯著高于CK、IBA 和TRP 處理(P<0.05),CK 顯著高于IBA和TR 處理(P<0.05),UB 和TB處理間無顯著差異(圖3)。
圖3 污泥和生長(zhǎng)素處理下草地早熟禾土壤微生物多樣性Fig.3 Effects of biosolids and auxin on soil microbial diversity of Kentucky bluegrass
2.2.3 土壤微生物種群結(jié)構(gòu) Venn 圖[33]用于統(tǒng)計(jì)多個(gè)樣本中所共有和獨(dú)有的OTU 數(shù)目,即菌種數(shù)目。大部分的菌種是所有處理及對(duì)照所共有的,此外每個(gè)處理還有一定數(shù)量的特有的菌種,其中兩種污泥處理所特有的菌種最多,遠(yuǎn)高于其他處理,而兩種激素處理所特有的菌種低于對(duì)照(圖4)。由此表明添加污泥(UB 和TB)能夠提高水分充足條件土壤微生物的豐度。
圖4 污泥和生長(zhǎng)素處理下草地早熟禾土壤微生物豐度Fig.4 Effects of biosolids and auxin on soil microbial abundance of Kentucky bluegrass
LEfSe[34]分析結(jié)果中,從內(nèi)到外的5個(gè)圓圈分別代表門、綱、目、科、屬5個(gè)分類學(xué)水平,每個(gè)圓圈上的彩色點(diǎn)代表在該分類水平上該顏色所代表的處理組中的對(duì)樣本劃分具有顯著差異影響的類群。圖5中,紫色、藍(lán)色、綠色和紅色分別代表TB、UB、IBA 處理和CK。由圖可以看出,紫色所覆蓋的范圍遠(yuǎn)大于藍(lán)色,藍(lán)色覆蓋的范圍大于紅色和綠色,這說明TB 和UB 處理的土壤微生物豐度明顯高于CK 和IBA 處理。已知類芽孢桿菌屬(Paenibacillus)中的一些菌種能夠刺激植物的生長(zhǎng)[35],通過對(duì)每個(gè)處理的單樣本多級(jí)生物組成分析,可以找出各處理的土壤中類芽孢桿菌的含量百分比,如圖6,TB 處理中的類芽孢桿菌含量顯著高于CK 和TRP 處理(P<0.05),IBA 和UB 處理的類芽孢桿菌含量高于CK,低于TB 處理,但差異不顯著。
圖5 污泥和生長(zhǎng)素對(duì)草地早熟禾土壤微生物豐度(顯著差異物種)的影響-Lefse 分析Fig.5 Effects of biosolids and auxin on soil microbial abundance(significantly different species)of Kentucky bluegrass using Lefse analysis
圖6 污泥和生長(zhǎng)素處理下土壤中類芽孢桿菌含量Fig.6 Effects of biosolids and auxin on the abundance of Paenibacillus in soil
PCoA[32]是一種研究數(shù)據(jù)相似性或差異性的可視化方法,Unifrac PCoA 基于進(jìn)化距離,在進(jìn)化水平上挖掘影響樣品群落組成差異的潛在主成分。PC1 和PC2 代表對(duì)于兩組樣本微生物組成發(fā)生偏移的疑似影響因素,PC1的值為43.96%,表示X 軸的差異結(jié)果可以解釋全面分析結(jié)果的43.96%,PC2的值為14.03%,表示Y 軸的差異結(jié)果可以解釋全面分析結(jié)果的14.03%(圖7)。
CK 與其他處理的微生物群落結(jié)構(gòu)均存在差異,UB 和TB 處理的差異較小,IBA 與TRP 處理的差異較小,但可能UB 和TB 與CK 的差異較IBA 與TRP 的差異更大(圖7)。
圖7 污泥和生長(zhǎng)素處理下草地早熟禾土壤微生物群落結(jié)構(gòu)Fig.7 Effects of biosolids and auxin on the structure of soil microbial community in Kentucky bluegrass
Heatmap[36]直觀地將數(shù)據(jù)值的大小以定義的顏色深淺表示出來。將高豐度和低豐度的物種分塊聚集,通過顏色梯度及相似程度來反映多個(gè)樣本在各分類水平上群落組成的相似性和差異性。
根據(jù)圖8中的色塊可以找出一些細(xì)菌如小單孢菌屬(Micromonospora)、鏈霉菌屬(Streptomyces)和紅球菌屬(Rhodococcus)等,在添加污泥的處理(UB 和TB)與未添加污泥的處理(IBA、TRP 和CK)中的含量相差很明顯,對(duì)上述3個(gè)菌種在樣品中的數(shù)量進(jìn)行比較(表6),UB 和TB 處理中的小單孢菌和鏈霉菌細(xì)菌數(shù)量均顯著高于CK、IBA 和TRP 處理(P<0.05),UB 處理中的紅球菌數(shù)量顯著高于其他處理(P<0.05)。
圖8 污泥和生長(zhǎng)素對(duì)草地早熟禾土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響-Heatmap 圖Fig.8 Heatmap showing the effects of biosolids and auxin on soil microbial community structure of Kentucky bluegrass
表6 草地早熟禾土壤中幾種微生物的含量
施用污泥能在干旱脅迫下顯著降低草坪草坪觀質(zhì)量和葉片萎蔫度,有效緩解光合速率、葉片相對(duì)含水量的下降,使草地早熟禾在干旱脅迫下仍能維持較高的生長(zhǎng)勢(shì)。研究表明,施用污泥能夠提高高羊茅的坪觀質(zhì)量、葉片相對(duì)含水量和葉綠素含量[2],加快干旱脅迫復(fù)水后坪觀質(zhì)量的恢復(fù)速率,在干旱脅迫下,污泥與無機(jī)肥料混合施用比單獨(dú)施用污泥更利于減緩干旱對(duì)坪觀質(zhì)量造成的損傷[3]。在本試驗(yàn)中,干旱脅迫下,UB、TB和TRP處理可以減緩坪觀質(zhì)量的下降,UB和TB比TRP對(duì)改善草地早熟禾的坪觀質(zhì)量有更顯著的影響,與前人研究結(jié)果一致。UB和TB處理在水分充足或是干旱脅迫下都可以提高草地早熟禾的光合速率,Zhang等[9]的研究表明污泥能夠提高高羊茅的光合速率,與本試驗(yàn)研究結(jié)果一致。
本試驗(yàn)中,在兩種水分條件下,4種處理對(duì)草地早熟禾葉片相對(duì)含水量均有顯著提高的效果,且UB和TB處理的表現(xiàn)優(yōu)于IBA和TRP處理。干旱脅迫下,UB、TB和TRP處理均能減輕草地早熟禾葉片的萎蔫程度,干旱結(jié)束復(fù)水后,IBA、TRP、UB和TB處理還能加快草坪草的恢復(fù),韓朝等[2]的研究也表明污泥能夠在重度干旱脅迫下降低高羊茅的葉片萎蔫度,與本試驗(yàn)的結(jié)果一致。
添加污泥能夠顯著提高土壤微生物量碳,增加微生物群落多樣性。本試驗(yàn)中,UB和TB處理能夠顯著增加草地早熟禾土壤中的微生物量碳,且比IBA和TRP處理對(duì)其提高的幅度更大,在微生物群落結(jié)構(gòu)的分析中也顯示,UB和TB處理的土壤微生物多樣性、微生物豐度明顯優(yōu)于對(duì)照,在群落結(jié)構(gòu)上與CK存在一定的差異。已有的研究表明污泥的施用能夠增加土壤微生物量碳,提高土壤微生物活性、增加土壤微生物群落功能多樣性指數(shù),這與本試驗(yàn)結(jié)果一致[37-39]。
有研究表明,施用污泥堆肥一段時(shí)間后可,土壤中的綠彎菌門(Chloroflexi)細(xì)菌成為優(yōu)勢(shì)菌[40],這種菌是絲狀菌,可以降解大分子有機(jī)物[41-42],本試驗(yàn)中,通過對(duì)單樣本多級(jí)物種組成的分析可知UB、TB和TRP處理均提高了土壤中綠彎菌門的數(shù)量。所以污泥中的豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)可能會(huì)為微生物創(chuàng)造更適宜的條件而增加其總量與多樣性。超過80%從根際分離的細(xì)菌都可以合成IAA[43-44]。所以微生物量碳及群落結(jié)構(gòu)的多樣性提高可能意味著為植物提供生長(zhǎng)素的能力提高。
試驗(yàn)以污泥和生長(zhǎng)素為主要影響因素,探究干旱脅迫下,污泥對(duì)草地早熟禾生長(zhǎng)和土壤微生物的影響,旨在從植物生長(zhǎng)和微生物層面,找到污泥提高草地早熟禾耐旱性的原因。污泥提高草地早熟禾的抗性可能是改變了土壤中微生物的數(shù)量和種類,促進(jìn)了土壤微生物的生長(zhǎng),提高了土壤酶活性和生長(zhǎng)素水平,改善了土壤結(jié)構(gòu),從而促進(jìn)了草地早熟禾的生長(zhǎng)代謝。在污泥中加入色氨酸比單獨(dú)施用污泥或色氨酸對(duì)草坪草的耐旱性能產(chǎn)生更顯著的影響,說明污泥提高微生物多樣性的效應(yīng)與增加生長(zhǎng)素前體色氨酸含量的效應(yīng)疊加,可以為草坪草提供更多的激素營(yíng)養(yǎng),以促進(jìn)其生長(zhǎng)并改善耐旱性。這為生物污泥的再利用提供了新的思路。