基于TGF-β/Smad通路研究益心附葶飲抗腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心肌纖維化的機(jī)制

劉 婧，張 妍，李凡勃，賀江超，楊 敏

心肌纖維化(myocardial fibrosis，MF)是多種因素造成心肌損傷后過(guò)度代償修復(fù)，導(dǎo)致心功能的惡化，甚至誘發(fā)心力衰竭。高血壓是引發(fā)心肌纖維化的主要誘因，心肌纖維化是高血壓心室重構(gòu)的基本病理改變。高血壓導(dǎo)致心肌纖維化與腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)有關(guān)[1-2]。而轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(TGF-β)作為重要細(xì)胞因子參與了高血壓心肌纖維化形成過(guò)程。TGF-β可促進(jìn)膠原基因表達(dá)和誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)合成增加。也有研究表明TGF-β/Smad通路是心肌纖維化過(guò)程中重要的信號(hào)通絡(luò)[3-5]。益心附葶飲是雷瑗琳主任在長(zhǎng)期臨床實(shí)踐中總結(jié)出的治療慢性心力衰竭的有效方劑，前期臨床研究表明該方具有增強(qiáng)心力衰竭病人心肌收縮力、改善心功能的作用，前期動(dòng)物實(shí)驗(yàn)也證明該藥對(duì)心力衰竭有抑制作用[6]。本研究擬通過(guò)觀察益心附葶飲對(duì)腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心肌組織中膠原纖維比例及TGF-β1、Smad3、Smad7 mRNA基因表達(dá)量的影響，來(lái)分析該方對(duì)TGF-β/Smad通路的抑制作用。希望更進(jìn)一步明確該方防治高血壓心肌纖維化、治療心力衰竭的靶點(diǎn)，為該方的進(jìn)一步推廣應(yīng)用奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 清潔級(jí)雌性SD大鼠35只，體質(zhì)量(230±20)g，由成都達(dá)碩實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，許可證號(hào)：SCXK(川)2020-035。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 RNA Trizol Reagent，批號(hào)：vs18061730，規(guī)格：每瓶50 mL，合肥博美生物科技有限公司生產(chǎn)；異丙醇，貨號(hào)：B422BA0020，規(guī)格：每瓶50 mL，上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)；氯仿，PrimeScript RT reagent Kit，貨號(hào)：RR047A，規(guī)格：100 Preps，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；TB GreenTMPremix Ex TaqTMⅡ(Tli RNaseH Plus)，貨號(hào)：RR820A，規(guī)格200Rxns，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)；無(wú)水乙醇(AR級(jí))，批號(hào)：GB678-90，規(guī)格：每瓶500 mL，成都海興化工試劑有限公司生產(chǎn)。

中藥：益心附葶飲原方(黑附片20 g先煎，炒葶藶子30 g，生白術(shù)15 g，桂枝12 g，川芎12 g，茯苓皮30 g，太子參30 g，丹參30 g，麥冬12 g，生地黃15 g，醋五味子6 g，炙甘草10 g)，由西安市中醫(yī)院制劑科提供顆粒劑。根據(jù)體表面積計(jì)算法，大鼠用量為3.5 g/(kg·d)，使用時(shí)沖調(diào)至需要濃度。

1.1.3 儀器設(shè)備 轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)(徠卡-2016，德國(guó))；JT-12S自動(dòng)組織脫水機(jī)(武漢俊杰電子有限公司)；BMJ-A型包埋機(jī)(常州郊區(qū)中威電子)；RS36型全自動(dòng)染色機(jī)(常州派斯杰醫(yī)療設(shè)備有限公司)；PHY-Ⅲ型病理組織漂烘儀(常州市中威電子儀有限公司)；數(shù)字切片掃描儀Pannoramic 250(濟(jì)南丹吉爾電子有限公司)；圖像軟件Image-Pro Plus 6.0(美國(guó)Cybernetics公司)；實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)儀(美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司，型號(hào)PIKORed 96)；低溫離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)儀器廠，型號(hào)C2500)；熱循環(huán)儀(美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司，型號(hào)TCA0096)；優(yōu)普超純水制造系統(tǒng)(成都超純科技有限公司，型號(hào)UPH-Ⅱ-10T)；旋渦混合器(江蘇康健醫(yī)療用品有限公司，型號(hào)XH-B)；電子天平(美國(guó)康州HZ電子科技有限公司生產(chǎn))；手提式不銹鋼壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠，型號(hào)SYQ-DSX-280B)；移液槍[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司，規(guī)格：1 000 μL、200 μL、20 μL、10 μL、2 μL]；槍頭(美國(guó)Axygen公司，規(guī)格：1 000 μL、200 μL、20 μL)；EP管(美國(guó)Axygen公司，規(guī)格：1.5 mL、0.2 mL、100.0 μL)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物模型建立 大鼠常規(guī)喂養(yǎng)1周，采用腹主動(dòng)脈縮窄法制作心力衰竭大鼠模型。采用10%水合氯醛麻醉大鼠，開(kāi)腹后分離出腹主動(dòng)脈，以鈍性7號(hào)針頭4號(hào)線結(jié)扎，結(jié)扎后觀察到腎臟缺血變白，迅速抽出針頭，縫合關(guān)腹。連續(xù)3 d腹腔注射青霉素4×104U/d。假手術(shù)組開(kāi)腹分離出腹主動(dòng)脈后，穿線不結(jié)扎。

1.2.2 分組 造模過(guò)程死亡3只大鼠，將造模成功的20只大鼠采用隨機(jī)數(shù)字表法分為模型組與中藥組，每組10只。在剩余12只大鼠中隨機(jī)取10只作為假手術(shù)組。

1.2.3 給藥方法 中藥組每只大鼠灌胃3.5 g/(kg·d)，連續(xù)灌胃8周。模型組與假手術(shù)組以等體積蒸餾水灌胃，連續(xù)灌胃8周。其余不做特殊處理，每組常規(guī)喂水、喂食。

1.3 檢測(cè)方法

1.3.1 Masson染色與心肌纖維化檢測(cè) 處死大鼠后，打開(kāi)胸腔，取出心臟，洗凈血液，分離左室，于左室最大橫徑處橫切開(kāi)，將左心室分為兩個(gè)部分。一部分組織甲醛固定、石蠟包埋、Masson染色后切片，每張切片放大100倍先觀察全部組織，再根據(jù)組織大小及表達(dá)情況分別選取3個(gè)區(qū)域，400倍采集圖像，每個(gè)部位選3個(gè)視野，用圖像分析軟件(Image Pro Plus 6.0，美國(guó))測(cè)量膠原纖維面積與所選視野面積的比值作為心臟膠原容積分?jǐn)?shù)(collagen volumetric fraction，CVF)；另一部分組織置于-80 ℃低溫冰箱凍存，待進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)。

1.3.2 RT-PCR

1.3.2.1 樣本總RNA提取 將組織用剪刀剪碎，取100 mg組織加入1 mL TRIZOL。將勻漿樣品在室溫15～30 ℃環(huán)境放置5～15 min，使核酸蛋白復(fù)合物分離。加入0.2 mL氯仿，劇烈振蕩，室溫放置，2～8 ℃、12 000 r/min離心15 min。樣品分為3層：底層為紅色有機(jī)相，上層為無(wú)色水相。把水相轉(zhuǎn)移到新無(wú)酶EP管中，加入等量異丙醇，顛倒混勻，室溫放置。2～8 ℃、12 000 r/min離心15 min，棄其上清。用1 mL 75%乙醇洗滌RNA沉淀，室溫放置，2～8 ℃、5 000 r/min離心3 min，棄上清。用槍頭吸出殘余乙醇，加入10 μL DEPC水，4 ℃放置備用。

1.3.2.2 基因組DNA的去除反應(yīng)(見(jiàn)表1)

表1 基因組DNA去除反應(yīng)體系

1.3.2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)(見(jiàn)表2)

表2 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系

1.3.2.4 引物設(shè)計(jì) 本實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)從美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心數(shù)據(jù)庫(kù)(NCBI)中搜索基因序列，使用Primer Premier引物設(shè)計(jì)軟件篩選設(shè)計(jì)引物。設(shè)計(jì)完成后交由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成。具體引物基因序列見(jiàn)表3。

表3 引物及堿基序列

1.3.2.5 逆轉(zhuǎn)錄PCR反應(yīng)(見(jiàn)表4、表5)

表4 RT-PCR反應(yīng)體系

表5 RT-PCR反應(yīng)條件

2 結(jié) 果

2.1 3組大鼠心臟組織內(nèi)纖維組織表達(dá)比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟纖維組織表達(dá)面積百分比明顯升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組心臟纖維組織表達(dá)面積百分比明顯降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表6、圖1。

表6 3組大鼠心臟組織內(nèi)纖維組織表達(dá)面積百分比比較(±s)

2.2 3組大鼠心臟組織TGF-β1mRNA的表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟組織中TGF-β1mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠心臟組織中TGF-β1mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表7。

表7 3組大鼠心臟組織TGF-β1 mRNA的表達(dá)水平比較(±s)

2.3 3組大鼠心臟組織Smad3 mRNA的表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟組織中Smad3 mRNA表達(dá)升高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠心臟組織中Smad3 mRNA表達(dá)降低(P<0.05)。詳見(jiàn)表8。

表8 3組大鼠心臟組織Smad3 mRNA的表達(dá)水平比較(±s)

2.4 3組大鼠心臟組織Smad7 mRNA的表達(dá)水平比較 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠心臟組織中Smad7 mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)；與模型組比較，中藥組大鼠心肌組織中Smad7 mRNA表達(dá)水平升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表9。

表9 3組大鼠心臟組織Smad7 mRNA的表達(dá)水平比較(±s)

3 討 論

本實(shí)驗(yàn)中腹主動(dòng)脈縮窄法主要造成心臟后負(fù)荷增加，主動(dòng)脈縮窄早期表現(xiàn)出左室肥大和室壁增厚，隨后出現(xiàn)左室擴(kuò)張，收縮和舒張功能障礙逐步加重[7]。壓力性負(fù)荷過(guò)重時(shí)心室負(fù)荷會(huì)轉(zhuǎn)化為單個(gè)心肌細(xì)胞膜壓力，這是心肌能量消耗的主要決定因素。心臟可以通過(guò)增加膜厚度來(lái)適應(yīng)升高的壓力負(fù)荷。根據(jù)拉普拉斯定律，增加細(xì)胞膜厚度可以減少膜壓力，提高其能量效率[8-9]，但在代償超過(guò)一定范圍后，受損組織內(nèi)部和周圍纖維結(jié)締組織增加，最終導(dǎo)致纖維化，也是心肌損傷后心臟重塑的標(biāo)志[10]。本實(shí)驗(yàn)中，模型組較假手術(shù)組膠原纖維比例明顯增加，中藥組膠原纖維比例較模型組降低。表明益心附葶飲減輕了腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心肌纖維化程度。

TGF-β/Smad信號(hào)通路廣泛參與了心肌肥大、心肌纖維化、心力衰竭多個(gè)病理過(guò)程[11]?；罨腡GF-β首先與細(xì)胞膜表面Ⅱ型TGF-β受體(TβR)結(jié)合，形成異源二聚體復(fù)合物。TβRⅠ識(shí)別并結(jié)合該二聚體復(fù)合物，TβRⅡ?qū)βRⅠ胞質(zhì)區(qū)中的絲氨酸/蘇氨酸磷酸化，進(jìn)而使TβRⅠ激活?；罨腡βRⅠ進(jìn)一步磷酸化R-Smad蛋白，后者再與Co-Smad結(jié)合成為轉(zhuǎn)錄復(fù)合物，調(diào)節(jié)特定靶基因。而TGF-β1通過(guò)活化一系列通路信號(hào)分子和激酶，誘導(dǎo)心肌成纖維細(xì)胞增殖，細(xì)胞外基質(zhì)沉積，從而介導(dǎo)血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)誘發(fā)心臟重構(gòu)[12]。另有研究表明，除AngⅡ外，醛固酮、內(nèi)皮素等均可刺激TGF-β/Smad信號(hào)通路參與高血壓心肌纖維化[13-14]。Smad蛋白通過(guò)細(xì)胞膜上特異性受體將TGF-β信號(hào)傳遞至核內(nèi)。Smad3、Smad7蛋白已被鑒定為TGF-β1通路下游介質(zhì)。Smad3屬于受體調(diào)節(jié)型蛋白，Smad7屬于受體抑制型蛋白。有研究表明Smad3在心肌梗死區(qū)表達(dá)明顯上調(diào)，Smad3作為TGF-β1下游介質(zhì)被激活，從而促進(jìn)心肌纖維化[15-16]。Smad7作為TGF-β/Smads信號(hào)通路中的關(guān)鍵負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過(guò)以下幾方面來(lái)調(diào)節(jié)TGF-β/Smad信號(hào)通路：①Smad7通過(guò)其MH2結(jié)構(gòu)域與TβRⅠ結(jié)合并阻斷R-Smad激活來(lái)抑制TGF-β信號(hào)傳導(dǎo)；②Smad7與Smad4競(jìng)爭(zhēng)與R-Smad聚集，通過(guò)招募蛋白磷酸酶E3泛素連接酶或去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)來(lái)調(diào)節(jié)TβRⅠ的活性或穩(wěn)定性；③Smad7可以同Smad4競(jìng)爭(zhēng)與R-Smad結(jié)合，并招募E3泛素連接酶神經(jīng)前體細(xì)胞表達(dá)發(fā)育調(diào)控樣蛋白4(NEDD4L)激活R-Smad，導(dǎo)致其多泛素化和蛋白酶體降解[17-19]。這與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本吻合。從本實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析：模型組TGF-β1、Smad3 mRNA表達(dá)水平明顯升高，Smad7降低，證明腹主動(dòng)脈縮窄導(dǎo)致心力衰竭過(guò)程中，TGF-β/Smad通路發(fā)揮了重要作用，TGF-β1、Smad3起到了促進(jìn)心肌纖維化作用，而Smad7起到了抑制作用。中藥組TGF-β1、Smad3的mRNA表達(dá)量較模型組明顯降低，證明在心肌纖維化過(guò)程中益心附葶飲有效抑制了心肌組織中TGF-β1及Smad3 mRNA的過(guò)度表達(dá)。中藥組與模型組Smad7 mRNA的表達(dá)比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能與樣本量較少有關(guān)，也可能與實(shí)驗(yàn)測(cè)定周期有關(guān)。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，心力衰竭歸屬“心衰病”范疇，心衰病病位在心，與腎、脾、肺等臟腑均有密切聯(lián)系?！端貑?wèn)·痿論》記載“心主一身之血脈”，全身血液能夠在體內(nèi)順暢地運(yùn)行全依賴心陽(yáng)推動(dòng)。心陽(yáng)推動(dòng)無(wú)力，則血行遲緩，甚則瘀阻脈道。因此，氣陽(yáng)兩虛是中醫(yī)心衰病發(fā)作重要的一種病理基礎(chǔ)，也是影響病情轉(zhuǎn)歸的決定因素。病程一旦遷延不愈，累及元陽(yáng)，導(dǎo)致心腎陽(yáng)虛。在病情發(fā)展過(guò)程中，不可避免地形成許多病理產(chǎn)物，常見(jiàn)的病理產(chǎn)物有水飲、痰濁等。一方面陽(yáng)氣虧虛，溫煦失司，氣化無(wú)力而水飲內(nèi)停；另一方面，氣虛日久，瘀血停滯，血不利則化為水。水為陰邪，水飲痰邪久留則更傷陽(yáng)氣。如此形成惡性循環(huán)。本病治療當(dāng)以益氣溫陽(yáng)利水為主[20]，在此治則指導(dǎo)下，雷瑗琳主任自創(chuàng)益心附葶飲，該方以益氣溫陽(yáng)為主要治則。方中黑附片、炒葶藶子為君藥，附子溫腎通陽(yáng)，葶藶子平喘利水，共同起到溫陽(yáng)利水之效果。白術(shù)、太子參益氣健脾，桂枝助君藥溫振心腎陽(yáng)氣，佐以川芎、丹參行氣活血，生地、五味子滋陰，甘草調(diào)和諸藥。全方組方精當(dāng)而全面，有補(bǔ)有利，以溫通心腎陽(yáng)氣為主，補(bǔ)而不滯。在利水同時(shí)又兼顧滋陰，防止利水太過(guò)耗傷陰液。

本研究分析了腹主動(dòng)脈縮窄大鼠心肌纖維化比例以及益心附葶飲干預(yù)后的變化，證明了益心附葶飲對(duì)纖維化有抑制作用；又用RT-PCR法分別測(cè)定了假手術(shù)組、模型組、中藥組大鼠心肌組織中TGF-β1、Smad3、Smad7的mRNA表達(dá)，證明了TGF-β/Smad通路與心肌纖維化密切相關(guān)，該方抗心肌纖維化可能與抑制TGF-β/Smad信號(hào)通路有關(guān)。下一步將繼續(xù)通過(guò)對(duì)TGF-β/Smad通路下游靶基因進(jìn)行調(diào)控及基因敲除，進(jìn)一步研究該方對(duì)TGF-β/Smad通路的抑制作用；另外，還將繼續(xù)研究不同劑量藥物對(duì)心力衰竭不同階段的作用，進(jìn)一步細(xì)化研究該方抗心肌纖維化、糾正心力衰竭的機(jī)制，為該藥進(jìn)一步研制成藥提供理論基礎(chǔ)。

綜上所述，心肌纖維化是心力衰竭重要病理改變，益心附葶飲具有抑制心肌纖維化的作用，TGF-β/Smad信號(hào)通路可能是該方治療心力衰竭的主要靶點(diǎn)。