基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探討三七治療心房顫動的分子生物學(xué)機制

陶詩怡，于林童，朱春臨，張 瑾，張?zhí)m鑫，黃 力

心房顫動是臨床上最常見的持續(xù)性心律失常，是由心房肌纖維相互獨立除極而導(dǎo)致的無序激動和無效收縮的房性節(jié)律，以心房基質(zhì)重構(gòu)和電重構(gòu)為關(guān)鍵病理機制，其患病率隨年齡增長而增加，可誘發(fā)栓塞、腦卒中等并發(fā)癥，具有極高的致殘率和致死率[1]。傳統(tǒng)西醫(yī)治療以抗心律失常藥物和電復(fù)律為主，但研究表明心房顫動復(fù)發(fā)率仍處于40%～50%的較高水平[2]，而中醫(yī)藥在防治心房顫動方面發(fā)揮了積極作用并展現(xiàn)出巨大潛力，因此，進一步挖掘中藥抗心房顫動的分子機制不僅有利于研發(fā)新藥新方，也有助于推動中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展。中醫(yī)古籍中無心房顫動病名的記載，根據(jù)臨床表現(xiàn)可將其歸屬于“心悸”“怔忡”范疇，心脈瘀阻證是臨床常見證型之一。三七是五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥根和根莖，性溫，味甘、微苦，歸肝、胃經(jīng)，具有散瘀止血、消腫定痛的功效[3]，現(xiàn)代藥理研究證實三七具有抗心律失常、抗動脈粥樣硬化、擴張血管、降低心肌耗氧量等作用[4]，但其治療心房顫動的具體分子生物學(xué)機制尚未見明顯立論。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于系統(tǒng)生物學(xué)理論，利用生物網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫、生物網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建方法和生物網(wǎng)絡(luò)分析技術(shù)，通過構(gòu)建“藥物-靶點-疾病”復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)，從分子層面分析藥物、靶點、疾病之間的內(nèi)在聯(lián)系，從而揭示其潛在機制的一門交叉學(xué)科[5]。故本研究立足于中藥網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)，在現(xiàn)代研究充實的基礎(chǔ)上對三七治療心房顫動的分子機制進行預(yù)測和總結(jié)，以期為后續(xù)深入研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 三七活性成分、靶點收集及網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 以“三七”為關(guān)鍵詞，通過檢索中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(TCMSP)數(shù)據(jù)庫(http://tcmspw.com/tcmsp.php)收集三七活性成分與作用靶點。根據(jù)藥代動力學(xué)(ADME)屬性值的推薦篩選標(biāo)準(zhǔn)，以口服利用度(oral bioavailability，OB)≥30%、類藥性(drug-likeness，DL)≥0.18為篩選閾值[6-7]，獲得可納入研究的活性成分，并通過檢索已發(fā)表文獻對成分進行補充。利用PubChem數(shù)據(jù)庫[8](https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)對活性成分名稱、結(jié)構(gòu)式、分子式及CAS號進行校訂確認，并借助Uniprot數(shù)據(jù)庫[9](https://www.uniprot.org/)進行靶蛋白基因名的轉(zhuǎn)換。通過Cystoscape 3.7.2軟件構(gòu)建三七活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)。

1.2 心房顫動相關(guān)靶點預(yù)測 以“atrial fibrillation”為關(guān)鍵詞，通過檢索OMIM[10](https://www.omim.org/)、DrugBank[11](https://www.drugbank.ca/)、GeneCards[12](https://www.genecards.org/)、DisGeNET[13](https://www.disgenet.org/)數(shù)據(jù)庫，采集心房顫動靶點信息，利用Draw Venn Diagram平臺(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/Venn/)繪制藥物-疾病靶點韋恩圖，得到三七-心房顫動交集靶點。

1.3 交集靶點蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(PPI)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊(module)提取 將交集靶點導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫[14](https://string-db.org/)，設(shè)定物種為“Homo Sapiens”，最小互相作用大于0.4，隱藏游離節(jié)點，得到PPI網(wǎng)絡(luò)，并通過Cytoscape 3.7.2軟件對PPI網(wǎng)絡(luò)進行可視化分析，設(shè)置連接度(degree)、綜合得分(combined score)分別與節(jié)點大小及顏色深淺、邊的粗細及顏色深淺成正比，進一步以degree的2倍中位數(shù)為篩選標(biāo)準(zhǔn)提取關(guān)鍵靶點。通過MCODE插件定位PPI網(wǎng)絡(luò)中密度較高的區(qū)域(community/module)，得到具有生物學(xué)意義的潛在蛋白質(zhì)復(fù)合體或功能模塊[15]。

1.4 生物信息學(xué)基因本體(GO)功能注釋和京都基因與基因組百科全書(KEGG)通路富集分析 Metascape平臺(http://metascape.org/gp/index.html)擁有全面的基因注釋功能并且每月更新數(shù)據(jù)資料[16]。將三七-心房顫動交集靶點導(dǎo)入Metascape平臺，設(shè)定物種為“Homo Sapiens”，P<0.01，分析其生物學(xué)過程(biological process，BP)、分子功能(molecular function，MF)和細胞組分(cellular component，CC)及信號通路，利用Sangerbox平臺(http://sangerbox.com/)對結(jié)果進行可視化處理。

1.5 活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 基于主要活性成分、交集靶點及信號通路的篩選結(jié)果，通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建三七活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖，進而以degree、介數(shù)中心性(betweenness centrality，BC)及緊密中心性(closeness centrality，CC)大小作為參考依據(jù)，評估節(jié)點在全網(wǎng)絡(luò)中的重要程度。

1.6 活性成分-靶點分子對接 分別通過PubChem數(shù)據(jù)庫[8]和PDB數(shù)據(jù)庫[17](https://www.rcsb.org/)收集活性成分3D結(jié)構(gòu)和篩選主要靶點最佳蛋白晶體結(jié)構(gòu)(有配體、結(jié)構(gòu)相對完整)。利用AutoDock Tolls 1.5.6軟件對蛋白進行去水、加氫，原子類型設(shè)為Assign AD4 type，運用Vina進行分子對接[18]，結(jié)合能(predicted binding affinity)越小則表明蛋白與配體對接活性越好，利用Pymol 2.3.0對結(jié)合能最低的前5種對接模式進行可視化處理。

2 結(jié) 果

2.1 三七活性成分預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過TCMSP數(shù)據(jù)庫共收集到三七活性成分119個，經(jīng)ADME篩選后得到有效成分8個，同時查閱文獻發(fā)現(xiàn)三七皂苷r1[19]亦是三七重要活性成分，因此，共篩選出三七有效成分9個(見表1)，靶點253個，剔重后得到預(yù)測靶點188個。通過UniPort數(shù)據(jù)庫檢索后得到251個已驗證性人源靶基因，剔重后得到有效靶基因186個，構(gòu)建三七活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)，共包含196個節(jié)點、260條邊(見圖1)。

表1 三七活性成分信息

圖1 三七活性成分-預(yù)測靶點網(wǎng)絡(luò)

2.2 交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及模塊提取 從GeneCards數(shù)據(jù)庫收集心房顫動靶點2 830個，篩選出Relevance score大于中位數(shù)(2.09)的靶點1 416個，分別從OMIM、DrugBank、DisGeNET數(shù)據(jù)庫收集得到心房顫動靶點110個、135個、287個，所有數(shù)據(jù)庫結(jié)果去重后共得到心房顫動相關(guān)靶點1 638個，韋恩圖示三七-心房顫動交集靶點共102個(見圖2)。通過Cytoscape 3.7.2軟件獲取degree大于中位數(shù)(32)的交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)，包含52個節(jié)點、1 019條邊(見圖3)，進而以degree大于2倍中位數(shù)(64)為篩選標(biāo)準(zhǔn)，提取出7個關(guān)鍵靶點(見表2)。通過MCODE插件分子復(fù)合物檢測算法對PPI網(wǎng)絡(luò)進行分析，獲得2類模塊(見圖4)。

圖2 三七成分-心房顫動靶點韋恩圖

圖3 三七-心房顫動交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)

表2 三七-心房顫動交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵靶點拓撲結(jié)構(gòu)參數(shù)

圖4 三七-心房顫動交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)中的模塊

2.3 生物信息學(xué)GO分析及KEGG通路富集分析 利用Metascape平臺對102個交集靶點進行基因注釋，得到顯著相關(guān)生物學(xué)過程6個、分子功能4種及細胞組分表達過程4條。結(jié)果提示，三七主要參與的生物學(xué)過程包括細胞因子介導(dǎo)的信號通路、對脂多糖的反應(yīng)、活性氧代謝過程、凋亡信號通路、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)級聯(lián)反應(yīng)的調(diào)控、對生長因子的反應(yīng)等，相關(guān)靶點治療心房顫動的功能主要富集于細胞因子活性、蛋白激酶結(jié)合、泛素樣蛋白連接酶結(jié)合、內(nèi)肽酶活性等(見圖5)。KEGG通路富集分析顯示，主要涉及晚期糖基化產(chǎn)物(AGE)-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體(RAGE)信號通路、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)-蛋白激酶B(Akt)信號通路、腫瘤壞死因子(TNF)信號通路、MAPK信號通路、白細胞介素(IL)17信號通路等(見圖6)。三七治療心房顫動靶點通路富集結(jié)果詳見表3。

圖5 三七-心房顫動交集靶點GO生物功能富集分析

圖6 三七-心房顫動交集靶點KEGG通路富集分析

表3 三七-心房顫動交集靶點通路富集結(jié)果

2.4 活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建三七活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)，共包括129個節(jié)點、408條邊(見圖7)。通過Network Analyzer分析網(wǎng)絡(luò)拓撲結(jié)構(gòu)參數(shù)，結(jié)果顯示，槲皮素degree為88，BC為0.66，CC為0.70(見表4)，MAPK1 degree為16，BC為0.04，CC為0.48(見表5)，預(yù)測槲皮素與MAPK1在三七活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)是較關(guān)鍵的成分與靶點。

圖7 三七活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)圖

表4 三七活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)中活性成分拓撲結(jié)構(gòu)參數(shù)

表5 三七活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)中主要靶點拓撲結(jié)構(gòu)參數(shù)

2.5 活性成分-靶點分子對接 選擇三七-心房顫動交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)與活性成分-靶點-信號通路網(wǎng)絡(luò)中的14個主要靶點TNF、IL-6、B淋巴細胞瘤-2(BCL-2)、半胱天冬酶3(CASP3)、Akt1、MAPK1、前列腺素內(nèi)過氧化物合酶2(PTGS2)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、腫瘤蛋白P53(TP53)、CXC趨化因子配體8(CXCL8)、原癌基因絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-1(RAF1)、表皮生長因子受體(EGFR)、蛋白激酶Cα(PRKCA)、蛋白激酶Cβ(PRKCB)和三七9個活性成分進行分子對接。按結(jié)合能從低到高排序，其中，結(jié)合能最低的是BCL-2與β-sitosterol，其次為TNF與Ginsenoside rh2，PTGS2與Quercetin(見表6)，對結(jié)合能最低的前5種對接模式進行可視化處理(見圖8)。

表6 三七主要活性成分-關(guān)鍵靶點分子對接結(jié)果(前12位)

圖8 三七活性成分與主要靶點分子對接Vina得分最低的前5種對接模式

3 討 論

本研究共篩選出三七活性成分9個，心房顫動相關(guān)的三七靶點102個，顯著相關(guān)生物學(xué)過程6個、分子功能4種及細胞組分表達過程4條，顯著相關(guān)信號通路20條，14個主要靶點與配體分子對接結(jié)果得分均小于-6.0，體現(xiàn)出三七活性成分和靶標(biāo)之間具有良好的結(jié)合活性。

本研究結(jié)果可知，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇、人參皂苷rh2在三七治療心房顫動作用機制中占有重要地位，預(yù)測三七主要通過此4種成分達到治療心房顫動的目的。交集靶點PPI網(wǎng)絡(luò)結(jié)果顯示，三七治療心房顫動的102個靶點間連線緊密，說明靶點間互相關(guān)聯(lián)而非獨立存在，體現(xiàn)出其作用機制的復(fù)雜性與相互性。MCODE分析提取出兩個模塊(見圖4)：F2-CAV1-IGF2-HSPA5-IL1A-RAF1-CXCL2-HSPB1-IGFBP3-NFKBIA-CD40LG-F3-SOD1與CYP1B1-CYP1A2-NR1I2，提示這些靶點間連線密度較高，常作為多個蛋白質(zhì)共同組成復(fù)合體而發(fā)揮生物學(xué)作用或為功能模塊，相互作用更加密切。KEGG通路分析提示，三七主要通過調(diào)控AGE-RAGE信號通路、PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路等而發(fā)揮抗心房顫動的作用。

研究證實，槲皮素、β-谷甾醇、豆甾醇可通過下調(diào)IL-6、TNF-α水平改善心肌炎癥反應(yīng)[20-23]。IL-6、TNF-α是重要的炎性因子，通過參與心房的電重構(gòu)、結(jié)構(gòu)重構(gòu)與血栓形成而使心房顫動持續(xù)存在，TNF-α主要受核轉(zhuǎn)錄因子-κB(NF-κB)信號調(diào)節(jié)，通過下調(diào)T型鈣通道表達、抑制T型鈣通道功能，改變連接蛋白的表達，干擾電生理及直接改變心肌細胞中Ca2+的處理為心房顫動起始提供底物，促進電重構(gòu)[24]，從而促進心房顫動的發(fā)展和維持，通過抑制NF-κB/TNF-α信號傳導(dǎo)途徑并降低促炎性細胞因子，有助于改善心房顫動易感性[25]。此外，IL-6可加速內(nèi)皮細胞活化與損傷，其與白細胞、血小板之間的相互作用可致高凝狀態(tài)的形成，最終引起血栓形成[26]，并且IL-6對p38絲裂原活化蛋白激酶(p38-MAPK)具有極強的激活作用，而MAPK信號通路的激活亦可促進心肌纖維化，加速基質(zhì)重構(gòu)[27-28]。同時，IL-6、TNF-α可誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)與受體結(jié)合、誘導(dǎo)氧化應(yīng)激及內(nèi)皮素-1(ET-1)等促纖維化因子表達而加劇心肌纖維化進程[29]。此外，AGE-RAGE信號通路在血管內(nèi)皮損傷介導(dǎo)的心房顫動中亦具有重要作用，研究表明，AGE與RAGE結(jié)合可增加內(nèi)皮層通透性、增加血栓形成機會及降低血管舒張性，從而促進炎癥和纖維化反應(yīng)[30]，心房顫動病人的AGE和可溶性晚期糖基化終產(chǎn)物受體(sRAGE)血漿水平較高，并與心房大小呈正相關(guān)[31]，并且大量AGE和RAGE的相互作用可增強結(jié)締組織生長因子(CTGF)表達，進一步促進心房纖維化[32]，預(yù)測三七可能通過抑制IL-6、TNF-α及AGEs-RAGE軸從而抑制心房纖維化進程。

槲皮素亦可通過調(diào)控PI3K/Akt信號通路來減輕炎癥[33]，PI3K屬于心臟保護蛋白，可抑制G蛋白偶聯(lián)受體下游的病理信號傳導(dǎo)級聯(lián)，Akt激活依賴PI3K途徑并且為通路關(guān)鍵節(jié)點，PI3K/Akt可協(xié)同缺氧誘導(dǎo)因子1(HIF-1)上調(diào)以預(yù)防體內(nèi)外缺血再灌注誘導(dǎo)的細胞凋亡，并可通過參與重建細胞代謝途徑實現(xiàn)心腦保護作用，抑制心臟PI3K-Akt信號傳導(dǎo)可增加發(fā)生心房顫動的風(fēng)險[34-35]。此外，Li等[36]研究表明，心房顫動病人中PI3K上調(diào)，通過PI3K/Akt/p300軸可調(diào)節(jié)心臟成肌細胞功能以適應(yīng)血流動力學(xué)變化，從而降低心房顫動發(fā)生率及改善病人預(yù)后。Chong等[37-38]研究證實PI3K/Akt/內(nèi)皮型一氧化氮合酶(eNOS)信號通路激活可減少左心房纖維化并調(diào)節(jié)離子通道變化，促進K+外流，從而降低心房顫動敏感性。Marín-Aguilar等[39]研究顯示PI3K/Akt/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路抑制可促進細胞自噬，消除累積細胞含量，從而改善心臟功能。

研究表明，心房顫動消退后，心房電生理重塑可在幾天之內(nèi)恢復(fù)，但結(jié)構(gòu)損傷修復(fù)需要更長時間，甚至部分損傷永遠無法復(fù)原，心房顫動發(fā)生后肌細胞凋亡帶來的損傷是心肌修復(fù)的重大挑戰(zhàn)[40]。β-谷甾醇和豆甾醇在抗心肌凋亡過程中具有重要作用，主要通過上調(diào)Bcl-2/Bax以抑制心肌細胞凋亡及纖維化[21，23]。Bcl-2是抗細胞凋亡的關(guān)鍵基因，研究證實Bcl-2可通過保護線粒體內(nèi)膜以減少細胞色素C(Cyt C)釋放、抑制超氧陰離子的產(chǎn)生從而抑制細胞凋亡[39]，并能將細胞維持在低代謝狀態(tài)來調(diào)節(jié)心肌細胞的新陳代謝，從而大大增強心肌細胞對細胞損傷的耐受力[41]。此外，CASP3是促凋亡的重要基因，是凋亡過程的關(guān)鍵下游酶，可直接裂解凋亡底物。Liang等[23]研究顯示，豆甾醇可下調(diào)CASP3表達從而抑制細胞凋亡過程；Trappe等[42]亦證實敲低CASP3基因后可減少細胞凋亡和預(yù)防房內(nèi)傳導(dǎo)延遲從而抑制或減緩持續(xù)性心房顫動的發(fā)作，故推測三七可通過上調(diào)Bcl-2或下調(diào)CASP3水平以抑制細胞凋亡從而達到治療心房顫動的目的。

本研究運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探索了三七抗心房顫動的分子機制，其作用涉及細胞、組織、器官、代謝、免疫、炎癥、凋亡、氧化應(yīng)激、離子通道等多個方面，并與細胞因子、凋亡基因家族、蛋白激酶家族、激素等物質(zhì)密切相關(guān)，體現(xiàn)出中藥可通過多成分、多靶點、多通路治療疾病的特點。但由于數(shù)據(jù)交互分析的誤差及局限性，部分結(jié)果暫未有足夠文獻支持，以期能為后續(xù)開展三七治療心房顫動的相關(guān)研究提供新視角與新思路。