冠心病血瘀證“瘀毒”病機(jī)轉(zhuǎn)變的蛋白質(zhì)組學(xué)研究

尚青華，徐 浩，史大卓，陳可冀

冠心病(coronary heart disease，CHD)的二級(jí)預(yù)防是臨床防治的重點(diǎn)，中醫(yī)藥在預(yù)防和治療心血管疾病中發(fā)揮著非常重要的作用。血瘀證(blood stasis syndrome，BSS)貫穿于CHD發(fā)生、發(fā)展的始終，是其核心和關(guān)鍵證候要素。但在CHD穩(wěn)定期病人轉(zhuǎn)變?yōu)椴环€(wěn)定的過(guò)程中，中醫(yī)病機(jī)發(fā)生怎樣的改變還不清楚。

基于此，陳可冀院士團(tuán)隊(duì)在既往研究的基礎(chǔ)上，提出心血管血栓性疾病“瘀毒”病因病機(jī)學(xué)說(shuō)，制定了CHD穩(wěn)定期病人“因毒致病”診斷及量化標(biāo)準(zhǔn)[1]，“熱毒血瘀證”被納入了國(guó)家中醫(yī)藥管理局2012年頒布的《22個(gè)專(zhuān)業(yè)105個(gè)病種中醫(yī)臨床診療方案》[2]，活血解毒治法已被臨床廣泛應(yīng)用。陳可冀院士團(tuán)隊(duì)研制的活血解毒中藥“清心解瘀方”已被證實(shí)可通過(guò)抗炎[3]、調(diào)控巨噬細(xì)胞凋亡[4]、重塑腸道菌群[5]等途徑發(fā)揮抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。臨床研究也表明，在西醫(yī)常規(guī)治療基礎(chǔ)上加用清心解瘀方可以減少穩(wěn)定性CHD病人急性心腦血管事件，且安全性良好[6]。但CHD穩(wěn)定期“瘀毒”是如何轉(zhuǎn)化的、有何生物學(xué)基礎(chǔ)，尚有待進(jìn)一步闡明。

蛋白質(zhì)組學(xué)是研究一個(gè)細(xì)胞、組織、器官或有機(jī)體在一定時(shí)間或一定狀態(tài)下所表達(dá)的所有蛋白質(zhì)，其研究重心是某一層次所有蛋白質(zhì)及其動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，具有動(dòng)態(tài)性、時(shí)間性、空間性、特異性、整體性等特點(diǎn)，與中醫(yī)“證候”相似。不同證候之間的差異，必然有其相應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)，證候蛋白質(zhì)組學(xué)研究作為中醫(yī)證候研究的重要手段，旨在揭示證候發(fā)生、發(fā)展規(guī)律和證候診斷的實(shí)質(zhì)和生物學(xué)基礎(chǔ)。蛋白質(zhì)組學(xué)可以直接研究中醫(yī)證候的特征與細(xì)胞蛋白質(zhì)整體動(dòng)態(tài)變化之間的內(nèi)在聯(lián)系，因而具有高效解碼證候生物學(xué)基礎(chǔ)的潛力，將是揭示證候?qū)嵸|(zhì)的最有效手段，也為研究CHD穩(wěn)定期“瘀毒”病機(jī)轉(zhuǎn)化的生物學(xué)基礎(chǔ)提供了技術(shù)支撐。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 中日友好醫(yī)院、中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院西苑醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬同仁醫(yī)院、首都醫(yī)科大學(xué)附屬安貞醫(yī)院、福建中西醫(yī)結(jié)合研究院門(mén)診的CHD穩(wěn)定期血瘀證病人，中日友好醫(yī)院急診科急性心肌梗死(AMI)病人。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 CHD診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照國(guó)際心臟病學(xué)會(huì)及世界衛(wèi)生組織臨床命名標(biāo)準(zhǔn)化聯(lián)合專(zhuān)題組報(bào)告的《缺血性心臟病的命名及診斷標(biāo)準(zhǔn)》[7]，且既往有陳舊性心肌梗死病史或經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查證實(shí)至少有1支冠狀動(dòng)脈狹窄≥50%者。

1.2.2 AMI診斷標(biāo)準(zhǔn) 參照2001年中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管分會(huì)《急性心肌梗死診斷和治療指南》中AMI的診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]。

1.2.3 中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn) 參照中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)冠心病中醫(yī)辨證標(biāo)準(zhǔn)[9]、中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)[10]和2012年《中西醫(yī)結(jié)合雜志》發(fā)表的“冠心病血瘀證診斷標(biāo)準(zhǔn)研究”[11]。

1.3 納入標(biāo)準(zhǔn)

1.3.1 CHD穩(wěn)定期 ①年齡35～80歲；②符合CHD診斷，既往有陳舊性心肌梗死病史或經(jīng)冠狀動(dòng)脈造影檢查證實(shí)；③無(wú)明顯心絞痛癥狀，或急性冠脈綜合征穩(wěn)定1個(gè)月以上。

1.3.2 AMI ①年齡35～80歲；②符合AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)，即具備下列3項(xiàng)標(biāo)準(zhǔn)中的2項(xiàng)：缺血性胸痛的臨床病史；心電圖的動(dòng)態(tài)演變；心肌壞死的血清心肌標(biāo)志物濃度的動(dòng)態(tài)改變。

1.4 排除標(biāo)準(zhǔn) ①近1個(gè)月內(nèi)有感染、發(fā)熱、創(chuàng)傷、燒傷、手術(shù)史；②嚴(yán)重心力衰竭，射血分?jǐn)?shù)(EF)<35%；③惡性腫瘤；④活動(dòng)性風(fēng)濕免疫性疾病、結(jié)核??；⑤肝硬化、腎衰竭或臟器移植；⑥嚴(yán)重慢性阻塞性肺疾病、呼吸衰竭或肺源性心臟病、右心衰竭；⑦嚴(yán)重血液系統(tǒng)疾病如白血病、再生障礙性貧血；⑧依從性較差或參加其他臨床試驗(yàn)者。

1.5 剔除標(biāo)準(zhǔn) ①入選后發(fā)現(xiàn)不符合納入標(biāo)準(zhǔn)或具備排除標(biāo)準(zhǔn)；②入選后缺乏病史、癥狀、體征等主要記錄，無(wú)法進(jìn)行分析；③電話(huà)或地址變動(dòng)，未能進(jìn)行1年心血管事件隨訪(fǎng)。

1.6 研究方法

1.6.1 病例選擇 對(duì)符合入選標(biāo)準(zhǔn)的病人，在病例報(bào)告表(case report form，CRF)上詳細(xì)記錄病人臨床信息，包括病人一般資料、既往史、個(gè)人史、癥狀、體征、舌象、脈象、理化指標(biāo)等。舌象由專(zhuān)人采用佳能IXUS 860數(shù)碼相機(jī)統(tǒng)一拍照存檔。同時(shí)留取血清于-80 ℃凍存，用于蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。

1.6.2 隨訪(fǎng) 所有入選的CHD血瘀證病人均電話(huà)預(yù)約進(jìn)行半年、1年面診復(fù)查，記錄臨床信息，并抽血檢查及留取血清凍存。對(duì)于未能進(jìn)行面診復(fù)查者，盡可能電話(huà)隨訪(fǎng)其急性心血管事件(acute cardiovascular events，ACEs)發(fā)生情況。對(duì)于隨訪(fǎng)期間因心血管病住院者，查閱其住院病歷，對(duì)是否屬于心血管事件進(jìn)行確認(rèn)。ACEs的定義：①心源性死亡；②非致命性心肌梗死；③缺血性腦卒中；④因不穩(wěn)定型心絞痛需行血運(yùn)重建術(shù)；⑤因不穩(wěn)定型心絞痛住院。

1.6.3 病例分組 入選CHD穩(wěn)定期病人1 503例，其中，血瘀證病人1 269例。對(duì)1 269例CHD血瘀證病人進(jìn)行1年隨訪(fǎng)后，共有57例病人發(fā)生ACEs，其中，隨訪(fǎng)發(fā)生ACEs且入組時(shí)血樣保存完好的23例病人為事件組(A組，作為“潛毒”組)；參照事件組病人，以性別、年齡(±5歲)、高血壓、糖尿病、心肌梗死病史為匹配因素，按1∶1比例匹配未發(fā)生ACEs的23例病人為對(duì)照組(B組)；隨訪(fǎng)半年以后發(fā)生ACEs且血樣保存完好的13例病人為復(fù)查組(C組)；AMI病人為D組(作為“毒證”組)。

1.7 血清多肽譜實(shí)驗(yàn)方法 根據(jù)CRF詳細(xì)記錄各組一般資料、既往史、個(gè)人史、癥狀、體征、辨證分型等。信息采集、錄入人員均為心血管科專(zhuān)科醫(yī)師并接受過(guò)統(tǒng)一培訓(xùn)考核，所有錄入信息由課題組主要研究人員進(jìn)行核查確認(rèn)后，方為有效。數(shù)據(jù)錄入采用雙人錄入，確保資料的準(zhǔn)確可靠。中醫(yī)的辨證分型由兩名副主任醫(yī)師以上中西醫(yī)結(jié)合心血管醫(yī)師確認(rèn)。同時(shí)留取空腹血清于-80 ℃凍存，用于最后統(tǒng)一的蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)。

采用Matrix Assisted Laser Desorption Ionization/Time-of Flight Mass Spectroscopy(Maldi-Tof-MS)方法對(duì)各組差異蛋白進(jìn)行比較分析和鑒定，最終確定CHD“因瘀致毒”的特異表達(dá)蛋白。采用ClinProTool 2.1軟件進(jìn)行圖譜分析和統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用Bioworks Browser 3.3.1 SP1進(jìn)行SequestTM檢索，檢索數(shù)據(jù)庫(kù)為 International Protein Index(IPI human v3.45 fasta with 71983 entries)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 15.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。假設(shè)檢驗(yàn)使用雙側(cè)檢驗(yàn)，以P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。定量資料采用t檢驗(yàn)、配對(duì)t檢驗(yàn)、秩和檢驗(yàn)、配對(duì)秩和檢驗(yàn)、F檢驗(yàn)、Kruskal-WallisH非參數(shù)檢驗(yàn)；定性資料采用χ2檢驗(yàn)、Fisher精確檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 一般資料 在入選的1 269例CHD血瘀證病人中，根據(jù)隨訪(fǎng)ACEs和血樣保存情況，共有23例事件組病人(A組)、23例對(duì)照組病人(B組)、13例復(fù)查組病人(C組)和15例AMI病人(D組)血清用于差異蛋白分析，13例復(fù)查組病人入組時(shí)的血樣(C0組)亦用于差異蛋白分析。4組在性別、年齡、高血壓、高脂血癥、糖尿病、腦卒中病史、吸煙史、體質(zhì)指數(shù)(BMI)及腰圍等方面比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，組間資料基本均衡。

2.2 蛋白組學(xué)分析 在所有入組病人中，“B-A-D”代表了由“無(wú)事件-潛毒-毒證”發(fā)生發(fā)展的過(guò)程，而“B-A”代表了“無(wú)事件-潛毒”的發(fā)展過(guò)程，且“B-A”的差異蛋白可能提示1年內(nèi)是否發(fā)生ACEs。因此，本研究以“B-A-D”“B-A”的差異蛋白分析為主線(xiàn)，結(jié)合“A-D”“C0-C”的差異蛋白特點(diǎn)，尋找更適合反映“因毒致變”的蛋白質(zhì)。篩選出的瘀毒相關(guān)差異蛋白多肽譜分析結(jié)果見(jiàn)表1，這些多肽在“A-B-D”“B-A”中差異均顯著且趨勢(shì)相同。分子量為1 945.31 Da的多肽在各組中差異最明顯、趨勢(shì)相同；分子量為1 981.25 Da、4 644.76 Da、6 631.28 Da、9 527.44 Da的多肽在“B-A-D”“B-A”“A-D”中趨勢(shì)一致；但分子量為6 631.28 Da、9 527.44 Da的多肽在“C0-C”的比較中趨勢(shì)相反且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；分子量為1 071.55 Da的多肽在“B-A-D”“B-A”中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且趨勢(shì)相同，但在“A-D”“C0-C”中未發(fā)現(xiàn)該峰。綜合以上結(jié)果，考慮分子量為1 945.31 Da、1 981.25 Da、1 071.55 Da、4 644.76 Da、6 631.28 Da、9 527.44 Da可作為1年內(nèi)“因瘀致毒”的蛋白指標(biāo)。

表1 “瘀毒”相關(guān)蛋白的多肽譜分析結(jié)果

2.3 建立穩(wěn)定期CHD病人“潛毒”及預(yù)測(cè)ACEs發(fā)生的模型 “B-A”兩個(gè)狀態(tài)轉(zhuǎn)變是本研究最為重視也是病機(jī)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵。把A和B兩組的數(shù)據(jù)導(dǎo)出，對(duì)齊后找到利用1 945.31 Da、1 981.25 Da、1071.55 Da、4 644.76 Da、6 631.28 Da、9 527.44 Da和9 527 Da建立模型(模型1)，采用K最近鄰(k-Nearest Neighbor，KNN)算法，最終計(jì)算得到模型的識(shí)別率，即ClassFA：0.865，ClassFB：0.836，均值：0.850 5；交叉驗(yàn)證，進(jìn)行了50次5折交叉確認(rèn)預(yù)測(cè)率，即ClassFA：0.802，ClassFB：0.823，均值：0.812 5。

上述模型蛋白多肽數(shù)量較多，為進(jìn)一步篩選關(guān)鍵蛋白，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果和既往文獻(xiàn)[12-14]，利用1 945.31 Da、1 979.64 Da兩個(gè)蛋白多肽建立模型(模型2)。最終計(jì)算得到模型的識(shí)別率，即ClassA：0.902，ClassB：0.786，均值：0.844 0；交叉驗(yàn)證，進(jìn)行了50次5折交叉確認(rèn)預(yù)測(cè)率，即ClassA：0.896，ClassB：0.764，均值：0.830 0。

2.4 “瘀毒”相關(guān)血清蛋白多肽的鑒定 根據(jù)以上方法及數(shù)據(jù)分析結(jié)果，本研究最終鑒定蛋白見(jiàn)表2。

表2 “瘀毒”相關(guān)蛋白多肽鑒定

3 討 論

本研究表明，模型2較模型1對(duì)A組的確認(rèn)預(yù)測(cè)率更高；對(duì)B組的確認(rèn)預(yù)測(cè)率雖不及模型1，但仍較高。因此，同種型高分子量激肽原1的前體 (isoform HMW of kininogen-1 precursor，KNG1)和過(guò)氧化物還原酶-1(peroxiredoxin-1，PRDX1)可考慮作為CHD血瘀證“因瘀致毒”的分子標(biāo)志物。

3.1 KNG1 本研究中，KNG1在CHD血瘀證病人“對(duì)照-潛毒-毒證”變化過(guò)程中逐漸增高，在發(fā)生事件病人入組至半年隨訪(fǎng)時(shí)的過(guò)程中亦逐漸升高，且在“毒證”病人中高表達(dá)最明顯，表明KNG1增高可能是CHD“因瘀致毒”的特有指標(biāo)，是CHD穩(wěn)定期病人再發(fā)ACEs新的分子標(biāo)志物。KNG1在細(xì)胞內(nèi)經(jīng)過(guò)加工、翻譯形成高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HK)，而HK是激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kininsystem，KKS)的重要組成部分[15]，HK對(duì)心血管系統(tǒng)的作用有：①促凝作用。HK是一種凝血因子，在KKS的激活、裂解過(guò)程中，產(chǎn)生了促凝血和促纖溶兩種作用，從而保持在生理狀態(tài)下的平衡。有實(shí)驗(yàn)證明，在A(yíng)MI大鼠中，HK升高，從而參與內(nèi)源性凝血過(guò)程[16]。血HK濃度升高可能是下肢深靜脈血栓的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[17]，能明顯增加骨外科術(shù)后下肢深靜脈血栓形成的風(fēng)險(xiǎn)[18]。②致炎作用。激肽調(diào)節(jié)通過(guò)B1和B2兩個(gè)受體發(fā)揮作用。已有證據(jù)證實(shí)，B2受體在心肌疾病中發(fā)揮抗纖維化、抗凋亡、抗炎的作用，而B(niǎo)1受體則促進(jìn)炎性因子產(chǎn)生，刺激免疫細(xì)胞的遷移[19]。而在A(yíng)MI病人中B1受體負(fù)向作用占優(yōu)勢(shì)，免疫系統(tǒng)的強(qiáng)烈反應(yīng)會(huì)促進(jìn)炎癥發(fā)展并擴(kuò)大梗死面積[20]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，HKα通過(guò)激活PKC等多種途徑與BK結(jié)合發(fā)揮致炎作用；HKα也可促進(jìn)白細(xì)胞介素(IL)-1β、IL-6、IL-8和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)等細(xì)胞因子和趨化因子釋放，加劇炎癥反應(yīng)。Dones等[21]研究表明，在急性冠脈綜合征后4 d、2個(gè)月、6個(gè)月直至穩(wěn)定的隨訪(fǎng)過(guò)程中，KNG1表達(dá)在穩(wěn)定期出現(xiàn)下調(diào)趨勢(shì)，與本研究結(jié)果相似，提示KNG1增高可作為CHD穩(wěn)定期病人發(fā)生ACEs的一種生物標(biāo)志物。但Parikh等[22]研究納入了4 195例成年動(dòng)脈粥樣硬化病人，并進(jìn)行了18年隨訪(fǎng)，并未找出KNG與CHD、腦卒中和心力衰竭的線(xiàn)性關(guān)系，提示KNG1可能是短期A(yíng)CEs發(fā)生的特異性指標(biāo)。Liu等[23]研究證實(shí)，KNG1是心陰虛證候的特異性分子標(biāo)志物，但在病證結(jié)合中醫(yī)病機(jī)轉(zhuǎn)變方面仍需要進(jìn)一步探索。

本研究在“無(wú)事件-潛毒-毒證”比較中，KNG1逐漸增高，且在“毒證”病人中增高更為明顯，可能與“潛毒”和“毒證”病人中存在相對(duì)高凝狀態(tài)和炎癥反應(yīng)有關(guān)，即“毒證”病人體內(nèi)內(nèi)源性凝血途徑和炎癥反應(yīng)被過(guò)度激活。在穩(wěn)定期CHD病人血清中KNG1表達(dá)較低，提示該蛋白在穩(wěn)定期CHD病人中低表達(dá)，僅在A(yíng)CEs風(fēng)險(xiǎn)增大時(shí)才會(huì)升高。

3.2 PRDX1 本研究中PRDX1在CHD血瘀證病人“無(wú)事件-潛毒-毒證”發(fā)展過(guò)程中亦逐漸升高，提示與“潛毒”的發(fā)展相關(guān)。通過(guò)EMBL-EBI中Uniprot查找該蛋白功能，主要參與細(xì)胞內(nèi)氧化還原反應(yīng)。PRXs是一類(lèi)過(guò)氧化物酶家族，可分為6種亞型(PRXsⅠ-Ⅵ)、3個(gè)亞類(lèi)，PRDX1是其中1種亞類(lèi)。PRDX1位于細(xì)胞質(zhì)，在肝臟、腎臟和胚胎中高表達(dá)。CHD的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中有氧化應(yīng)激反應(yīng)的參與。過(guò)多的氧自由基可引發(fā)脂質(zhì)過(guò)氧化形成大量脂質(zhì)過(guò)氧化物蓄積，損傷血管壁內(nèi)皮細(xì)胞，加速動(dòng)脈粥樣硬化形成，最終導(dǎo)致心肌梗死和腦卒中；氧自由基可損傷心肌細(xì)胞膜、細(xì)胞內(nèi)線(xiàn)粒體膜DNA、蛋白質(zhì)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡；氧自由基還可導(dǎo)致鉀、鈉、鈣等電解質(zhì)紊亂，影響心肌細(xì)胞膜電位，使心肌細(xì)胞自律性加強(qiáng)，引發(fā)各種心律失常[24]。也有研究認(rèn)為，氧化應(yīng)激可以增加炎性因子的釋放，加劇炎癥反應(yīng)，進(jìn)而促使動(dòng)脈粥樣硬化斑塊破裂[25]。

PRDX1在氧化應(yīng)激條件下表達(dá)顯著增高，具有去除過(guò)氧化氫、脂質(zhì)過(guò)氧化物等作用，是機(jī)體的防御保障，是維持氧化應(yīng)激狀態(tài)下氧化還原平衡的重要細(xì)胞因子[26]。PRDX1有強(qiáng)大的抗氧化應(yīng)激作用，并且可以充當(dāng)分子伴侶的角色，在心血管系統(tǒng)中起保護(hù)作用。Guo等[27]研究表明，PRDX1水平在心肌梗死再灌注損傷大鼠中明顯升高，其能夠抑制絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)途徑引起的心肌細(xì)胞凋亡。PRDX1還能夠抑制過(guò)強(qiáng)的血管內(nèi)皮反應(yīng)和早期的動(dòng)脈硬化[28]。Jeong等[29]研究表明，PRDX1能夠調(diào)節(jié)脂質(zhì)內(nèi)流，并維持氧化應(yīng)激下巨噬細(xì)胞膽固醇穩(wěn)態(tài)，從而發(fā)揮抗動(dòng)脈硬化和改善細(xì)胞自噬相關(guān)疾病的作用。本研究中，“無(wú)事件-潛毒-毒證”過(guò)程PRDX1表達(dá)逐漸升高，說(shuō)明該蛋白可以作為穩(wěn)定期CHD病人發(fā)生ACEs的生物標(biāo)志物。

4 小 結(jié)

本研究初步篩選到了CHD穩(wěn)定期病人“瘀毒”病機(jī)轉(zhuǎn)變的分子標(biāo)志物——KNG1和PRDX1，構(gòu)建了基于“瘀毒致變”理論識(shí)別CHD穩(wěn)定期高危病人的模型，對(duì)于早期識(shí)別CHD穩(wěn)定期高危病人、提高CHD的預(yù)防水平具有重要的意義，但還有待進(jìn)一步的驗(yàn)證和完善。