社區(qū)獲得性和醫(yī)院獲得性耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的差異

胡玥，劉心偉，張小倩，劉冬梅，李永偉

(河南省中醫(yī)院/河南中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院 檢驗中心，河南 鄭州 450002)

自1961年英國學者Jevons發(fā)現耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌(methicillin-resistantStaphylococcusaureus，MRSA)以來，MRSA已成為院內感染的重要病原菌之一，因此也習慣被稱為醫(yī)院獲得性MRSA(hospital acquired MRSA，HA-MRSA)[1]。近年來，MRSA感染的流行病學發(fā)生了明顯的變化。有研究發(fā)現，在相當長的一段時間內，HA-MRSA的感染能相對保持穩(wěn)定，但社區(qū)獲得性MRSA(community acquired MRSA，CA-MRSA)的感染卻在逐年增加，并超過HA-MRSA，成為常見的MRSA感染的病因，引起了全世界的廣泛關注[2]。因為一旦感染了MRSA，將對青霉素類、β內酰胺類復合藥物、頭孢烯類(具有抗MRSA活性的頭孢菌素除外)和碳青霉烯類藥物耐藥，給臨床治療帶來很大的困難。而Panton-Valentine殺白細胞素(Panton-Valentine leucocidin，PVL)基因被認為是MRSA發(fā)展成侵襲性感染的重要因素，因此也可能成為抗生素治療的潛在靶點。本文根據美國疾病預防控制中心對HA-MRSA和CA-MRSA的篩選標準，對河南省中醫(yī)院分離出的MRSA菌株進行初步篩選，并對二者的標本來源、耐藥性和PVL基因的攜帶情況進行分析，為MRSA發(fā)展成侵襲性感染的預防和精準治療提供實驗數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1菌株來源 收集2015年1月至2018年12月河南省中醫(yī)院分離的214株耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌，依據美國疾病預防控制中心對CA-MRSA的篩選標準[2]進行篩選：(1)患者在門診或入院48 h之內分離到的MRSA菌株；(2)1 a內無住院或醫(yī)療機構接觸史；(3)無留置各種導管及其他穿透皮膚的醫(yī)用裝置。結合2001年衛(wèi)生部頒布的《醫(yī)院感染診斷標準(試行)》進行診斷[3]，共篩選出116株CA-MRSA，98株HA-MRSA。所有菌株均采用VITEK2-Compact全自動微生物鑒定儀及相應的配套試劑進行鑒定和藥敏試驗。

1.1.2主要試劑與儀器 (1)試劑：VITEK2-Compact全自動微生物鑒定卡GP和藥敏卡GP67購自法國BioMérieux公司，哥倫比亞血平板、MH瓊脂平板購于安圖生物科技有限公司，頭孢西丁紙片購自英國Oxoid公司，聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)Mix、DNA Marker、4s Red plus和瓊脂糖均購自上海生工生物工程有限公司。(2)儀器：基因擴增儀、電泳儀和凝膠成像儀均購自美國Bio-Rad公司，低溫高速離心機購自德國Eppendorf公司，潔凈工作臺購自濟南鑫貝西生物技術有限公司，恒溫水浴箱購自上海一恒科學儀器有限公司。

1.1.3質控菌株 質控菌株為金黃色葡萄球菌ATCC25923和ATCC29213，購自衛(wèi)生部臨床檢驗中心。PVL基因陽性的金黃色葡萄球菌由同濟大學附屬上海市肺科醫(yī)院余方友教授惠贈，本實驗室保存。

1.2 操作方法

1.2.1菌株鑒定和藥敏試驗 采用法國生物梅里埃VITEK2-Compact全自動微生物鑒定和藥敏儀及配套的GP和GP67檢測卡進行細菌鑒定和藥敏試驗。對于MRSA菌株，用頭孢西丁紙片法進行復核。藥敏試驗的結果均根據當年最新的美國臨床和實驗室標準協(xié)會標準來判斷。

1.2.2MRSA菌株的篩選 根據美國臨床和實驗室標準協(xié)會對MRSA的定義(對苯唑西林耐藥的金黃色葡萄球菌稱為MRSA)進行篩選。

1.2.3CA-MRSA和HA-MRSA的篩選 根據美國疾病預防控制中心對CA-MRSA的篩選標準[2]和2001年衛(wèi)生部頒布的《醫(yī)院感染診斷標準(試行)》進行初步篩選[3]。

1.2.4PVL基因篩選PVL基因引物由上海生工生物工程技術服務有限公司合成，PVL基因的引物序列：PVL F為5’-ATCATTAGGTAAAATGTCTGGACATGA-3’，PVL R為5’GCATCAATGTATTGGATAGCAAAAGC-3’。細菌基因組DNA提取使用上海生工Ezup柱式細菌基因組DNA抽提試劑盒，操作按照說明書進行。反應體系為50 μL，其中Mix混合液25 μL，正向、反向引物各1 μL，模板1 μL，以ddH2O補足體積。擴增條件：預變性95 ℃，5 min，變性95 ℃，30 s，退火52 ℃，30 s，延伸72 ℃，60 s，持續(xù)35個循環(huán)，最后一步延伸，72 ℃，10 min，1%凝膠成像，拍照保存。

1.2.5數據分析方法 采用WHONET 5.6和SPSS 20.0統(tǒng)計軟件處理數據。定性資料CA-MRSA與HA-MRSA標本來源、構成比及PVL基因檢測差異的組間比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 一般資料2015年1月至2018年12月，河南省中醫(yī)院共分離出536株金黃色葡萄球菌，其中MRSA 214株，占40%。MRSA的標本來源中，膿液標本 66株(30.8%)，其次是痰液58株(27.1%)，耳分泌物42株(19.6%)，前列腺液15株(7.0%)，全血14株(6.5%)，肺泡灌洗液9株(4.2%)，引流液8株(3.7%)，尿液2株(0.9%)。

2.2 菌株來源差異分析在214株MRSA中，初步篩選出CA-MRSA 116株及HA-MRSA 98株。其中CA-MRSA主要來自于甲狀腺乳腺外科的化膿性乳腺炎、耳鼻喉科的化膿性中耳炎和泌尿系統(tǒng)的化膿性炎癥的膿液分泌物，HA-MRSA主要來自于下呼吸道感染和血流感染。二者標本來源的構成比比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.001)。標本來源的區(qū)別見表1。

表1 CA-MRSA與HA-MRSA標本來源及構成比[n(%)]

2.3 CA-MRSA與HA-MRSA對常用抗菌藥物的耐藥性CA-MRSA與HA-MRSA對常用抗菌藥物的耐藥率見表2。從表中的數據可以看出，2種MRSA均對3種以上常用抗菌藥物耐藥。2種MRSA對萬古霉素、利奈唑胺、奎奴普丁/達福普汀、替加環(huán)素和呋喃妥因均100%敏感，對紅霉素、克林霉素的耐藥率均高于80%，CA-MRSA甚至達到了100%，但是CA-MRSA對環(huán)丙沙星、左氧氟沙星和慶大霉素的耐藥率低于HA-MRSA(P<0.05)。

表2 CA-MRSA與HA-MRSA對常用抗菌藥物耐藥率的比較(%)

2.4PVL基因擴增產物電泳結果本次試驗對116株CA-MRSA和98株HA-MRSA進行了PVL基因的檢測，部分擴增產物的電泳結果見圖1。PVL基因擴增產物長度為433 bp，條帶清晰，特異性好。116株CA-MRSA中，有85株攜帶PVL基因，占73.6%；98株HA-MRSA中，有25株攜帶PVL基因，占25.5%。CA-MRSA中PVL基因的攜帶率高于HA-MRSA，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。見表3。

表3 CA-MRSA與HA-MRSA PVL基因檢測差異比較

MRSA為耐甲氧西林的金黃色葡萄球菌；PVL為Panton-Valentine殺白細胞素；PCR為聚合酶鏈反應。

圖1 部分PVL基因陽性MRSA PCR電泳圖

3 討論

抗菌藥物的大量使用導致耐藥細菌的檢出呈逐年上升趨勢，其中MRSA引發(fā)的耐藥問題尤為突出。在河南省中醫(yī)院2015—2018年分離出的214株MRSA菌株中，116株為CA-MRSA，占比54.2%，多來自耳鼻喉科和乳腺外科的皮膚軟組織感染， 98株為HA-MRSA，占比45.8%，多來自重癥醫(yī)學科和肺病科的呼吸系統(tǒng)感染和血流感染。CA-MRSA的檢出率高HA-MRSA將近10個百分點，且二者標本來源不同，說明二者引起的感染類型不同。就耐藥特點及用藥選擇而言，2種MRSA對紅霉素和克林霉素的耐藥率達80%以上，CA-MRSA甚至達到了100%，但對萬古霉素、利奈唑胺、奎奴普汀/達福普汀、替加環(huán)素和呋喃妥因100%敏感。因此，在治療由MRSA導致的全身嚴重性感染時，首選糖肽類藥物。二者耐藥特點的最大區(qū)別在慶大霉素和喹諾酮類藥物上，CA-MRSA的耐藥率遠低于HA-MRSA，這與國內外的相關報道一致[4-6]。本研究和全國細菌耐藥監(jiān)測網(Chinese Antibiotic Resistance Surveillance System，CARSS)的耐藥數據一致，在耐藥性較弱的CA-MRSA的用藥選擇上，可以選用萬古霉素以外的藥物來治療，如氨基糖苷類或喹諾酮類藥物，以減少藥物的毒副作用。而美國感染病學會(Infectious Diseases Society of America，IDSA)目前推薦克林霉素、甲氧芐啶/磺胺甲噁唑、強力霉素或利奈唑胺類藥物經驗性治療疑似CA-MRSA皮膚和軟組織感染[7]，可減輕萬古霉素的選擇壓力，延緩萬古霉素非敏感菌株的出現。鑒于二者耐藥特點的差異，在用藥選擇上也應有所區(qū)別。對CA-MRSA引起的感染，可選用氨基糖苷類或喹諾酮類作為糖肽類的替代用藥，而對HA-MRSA引起的感染，糖肽類依然是首選。

MRSA可以大量分泌破壞宿主細胞的毒力因子，介導致病性和鈍性免疫防御。其中PVL被認為是MRSA發(fā)展成侵襲性感染的重要因素，是抗菌治療的潛在靶點[8]。PVL是一種可引起白細胞破壞和組織壞死的細胞毒素，屬于synergohymenotropic毒素家族，由lukS-PV和lukF-PV這兩個基因編碼共同轉錄。PVL以八聚體形式在宿主巨噬細胞、單核細胞和多形核細胞的細胞膜上形成孔道，損傷細胞膜，導致細胞溶解死亡和炎癥[9]。因此，PVL基因陽性金黃色葡萄球菌致病能力更強，可引起嚴重的組織壞死，易出現暴發(fā)性起病，病死率高。本研究針對2種MRSA的PVL基因檢測結果顯示，近80%的CA-MRSA都攜帶有PVL基因，而HA-MRSAPVL基因攜帶率不足30%，CA-MRSA菌株PVL基因的攜帶率高于HA-MRSA，這與目前國內外相關報道一致[10-11]。CA-MRSAPVL基因的高攜帶率使PVL基因曾一度被認為是CA-MRSA的標志性毒力基因，PVL基因在CA-MRSA所導致的皮膚和軟組織感染中起重要作用，與嚴重的社區(qū)獲得性壞死性肺炎密切相關[12]。近年來一些國家的研究報告也顯示，PVL基因陽性的CA-MRSA導致的感染呈上升趨勢，與當地MRSA的社區(qū)流行和醫(yī)院感染有關。而且，PVL基因陽性的CA-MRSA感染并引起并發(fā)癥如壞死性筋膜炎、肺炎、膿毒癥甚至死亡的發(fā)生率更高[13]。因此比較2種MRSA的PVL基因攜帶情況，尤其關注CA-MRSA的攜帶情況，對于預測是否易發(fā)展成侵襲性感染具有重要意義。對于PVL基因陽性的CA-MRSA，臨床應高度重視，不可因其耐藥性弱而掉以輕心，應進行早期干預，避免局部感染的擴散，減少并發(fā)癥的發(fā)生。

綜上所述，通過對CA-MRSA與HA-MRSA的感染部位、耐藥情況及PVL基因的攜帶情況進行實驗研究和回顧性分析，可更好地讓臨床醫(yī)生掌握河南省中醫(yī)院或本區(qū)域內的流行情況，更加重視PVL基因陽性的CA-MRSA，客觀評估其感染程度。PVL基因陽性的CA-MRSA更容易發(fā)展成嚴重的侵襲性感染，可能成為抗CA-MRSA治療的潛在靶點，為抗MRSA藥物的研發(fā)提供新的思路。另外在臨床工作或是社區(qū)醫(yī)療工作中，加強宣教，對于皮膚軟組織感染要引起足夠的重視，及時處理，避免發(fā)展成侵襲性感染。