云芝糖肽化學(xué)成分的研究進展*

張 圓，孫玉娣，劉 璇，石蓓佳，陸益紅**

（1.江蘇省食品藥品監(jiān)督檢驗研究院生物技術(shù)藥品檢驗一室，江蘇 南京 210019；2.中國藥科大學(xué)藥學(xué)院，江蘇 南京 210000）

云芝（Trametes versicolor） 又名彩絨革蓋菌、雜色云芝、彩紋云芝、黃云芝、灰芝、瓦菌、千層蘑、云蘑等，隸屬真菌門（Eumycota） 擔(dān)子菌亞門（Basidiomycotina） 多孔菌科（Polyporaceae） 栓菌屬（Trametes）[1]。具有增強免疫、抑制腫瘤等功效[2]。對云芝化學(xué)成分的研究主要集中在云芝子實體中提取的子實體多糖（糖肽）、從液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體中提取的胞內(nèi)糖肽和從液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的發(fā)酵液中提取的胞外糖肽[3]。通過分析云芝糖肽的理化性質(zhì)、一級結(jié)構(gòu)的化學(xué)成分（單糖組成、多糖含量、氨基酸含量、肽含量、核苷和核堿組成、指紋圖譜）、二級結(jié)構(gòu)（糖苷鍵分析、糖肽鍵的研究）、立體結(jié)構(gòu)（分子量、糖肽蛋白結(jié)合態(tài)）的研究以及相關(guān)化學(xué)計量學(xué)等方面近年的相關(guān)文獻，對云芝糖肽的化學(xué)成分和研究方法進行綜述，為其更廣泛的應(yīng)用提供參考和依據(jù)。

1 理化性質(zhì)

PSP（polysaccharopeptide） 和 PSK（polysaccharide-krestin）是由云芝的液態(tài)發(fā)酵培養(yǎng)的菌絲體中提取的2種商品化糖肽類物質(zhì)[2]。PSP是上海師范大學(xué)楊慶堯教授于1983年，由菌株Cov-1發(fā)酵64 h的菌絲體中通過水提醇沉的方式提取出來[4]；PSK是日本吳羽化學(xué)工業(yè)公司于1966年，由菌株CM-101發(fā)酵10 d的菌絲體中通過水提鹽（硫酸銨）析的方式提取出來[4]，二者均具有提高機體免疫功能和抑制腫瘤的活性。

PSK含有氧47.5%、碳40.5%、氫6.2%、氮5.2%[2]，含碳水化合物34%～35%、蛋白質(zhì)28%～35%、灰分6%～7%和水分7%，其余是還原糖和氨基酸[2]。PSP含有可溶性碳水化合物46%、蛋白質(zhì)31%、不可燃物質(zhì)15%[4]。PSP和PSK易溶于水，不溶于甲醇、吡啶、氯仿、苯和正己烷[2]，二者無固定的熔點，加熱至120℃以上后會焦化[4]。

2 一級結(jié)構(gòu)化學(xué)成分研究

2.1 單糖組成

應(yīng)用于云芝糖肽單糖組成的分析方法主要有衍生化氣相色譜法、柱前衍生化-高效液相色譜法/液質(zhì)聯(lián)用法，高效液相色譜-蒸發(fā)光散射法（HPLCELSD）、高效液相色譜-示差折光法（HPLC-RI）、薄層色譜法（TLC） 等方法[5-8]。目前柱前衍生化-高效液相色譜法是在多糖分析中最常用的手段，反應(yīng)操作簡便可控，無干擾峰，重現(xiàn)性好，利于定量分析，且衍生產(chǎn)物在質(zhì)譜檢測器中響應(yīng)較高且穩(wěn)定，提高了檢測的靈敏度和專屬性[5]。

李娟等[5]將糖肽經(jīng)三氟乙酸酸解后，用1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP） 柱前衍生，建立云芝糖肽單糖對照HPLC特征圖譜，測得含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、巖藻糖 （82.4∶6.3∶193.3∶100.0∶5.3∶4.0∶42.9） 7種單糖；并從單糖相似度、單糖組成摩爾比方面進行研究，結(jié)果表明，云芝糖肽與云芝胞內(nèi)糖肽有明顯差異，云芝胞內(nèi)糖肽的葡萄糖含量遠大于云芝糖肽。鄒巧根等[6]采用氫氧化鈉水解、硼氫化鈉還原、還原產(chǎn)物與吡啶-醋酐（1∶1） 發(fā)生衍生化反應(yīng)，得到糖醇乙酰酯衍生物，并進行氣相色譜分析，檢測得到云芝糖肽（PSP） 中含有6種單糖：葡萄糖、半乳糖、甘露糖、巖藻糖、木糖、鼠李糖（0.544∶0.188 ∶0.180 ∶0.062 ∶0.018 ∶0.009）。張喆等[7]采用HPLC-ELSD和TLC法對云芝糖肽的單糖組成進行測定，結(jié)果表明云芝糖肽由葡萄糖、甘露糖、半乳糖和木糖 （1.000∶0.074∶0.067∶0.017 8） 組成，未檢出巖藻糖。Lin等[8]采用ddH2O為流動相，利用HPLC-RI法對云芝菌提取的糖肽粗品進行了單糖組成研究，葡萄糖、半乳糖、木糖和阿拉伯糖的比例為 49.21∶17.06∶1.33∶32.40。

2.2 多糖含量測定

目前，云芝糖肽的國家標(biāo)準(zhǔn)采用無水葡萄糖為對照品，用硫酸-苯酚比色法測定總糖[9]。該方法專屬性不強，尤其樣品中單糖或小分子寡糖會影響多糖含量測定，使測定結(jié)果偏高[10]。

由于比色法測定多糖含量易造成結(jié)果偏差，李京等[10]采用高效陰離子交換-脈沖安培法測定云芝對照品胞內(nèi)糖肽中的游離糖含量，從而排除比色法總糖測定中游離糖的干擾，結(jié)果未檢出游離糖。陳露等[11]采用DNS法，測得云芝胞內(nèi)糖肽中還原糖的總量，結(jié)果高壓均質(zhì)法提取得到的產(chǎn)物還原糖含量為0.4%，而熱水提取法未檢出。

2.3 氨基酸組成

PSP和PSK均含有18種氨基酸，目前一般采用水解后OPA/AQC衍生化-HPLC測定和氨基酸分析儀2種方法進行氨基酸組成分析[5，12]。

李娟等[5]將云芝糖肽經(jīng)140℃，4 mol·L-1鹽酸溶液酸解2 h后，進行在線OPA衍生化，HPLCUV檢測后測得云芝胞內(nèi)糖肽中含有16種氨基酸，天冬氨酸∶谷氨酸∶絲氨酸∶組氨酸∶甘氨酸∶蘇氨酸∶精氨酸∶丙氨酸∶酪氨酸∶胱氨酸∶纈氨酸∶甲硫氨酸∶苯丙氨酸∶異亮氨酸∶亮氨酸∶鹽酸賴氨酸（物質(zhì)的量之比） 為 204.6∶145.6∶137.2∶28.6∶218.7∶63.8∶78.0∶100.0∶12.7∶5.3∶29.2∶5.7∶10.1∶15.0∶35.4∶116.2。Jeong等[12]采用氨基酸分析儀對云芝中的糖肽提取物CV-S2進行氨基酸分析，測得11種氨基酸，不同云芝糖肽柱層析分離產(chǎn)物的肽含量在4.1%～18.5%不等。

2.4 肽含量測定

目前，云芝糖肽的國家標(biāo)準(zhǔn)采用牛血清白蛋白為對照品，用福林酚法測定肽[9]，標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定云芝糖肽蛋白質(zhì)含量以牛血清白蛋白計，不得少于11.5%。但該方法的缺點是還原性物質(zhì)（如葡萄糖、寡糖等）易干擾測定[13]。有文獻采用考馬斯亮藍法進行肽含量測定，測得云芝糖肽蛋白含量在約6%[6]?？捡R斯亮藍試劑與蛋白質(zhì)中的堿性氨基酸（特別是精氨酸）和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合，由于云芝糖肽主要含酸性和中性氨基酸（占比70%），可能造成蛋白含量偏低[13]。為更準(zhǔn)確地反應(yīng)糖肽中的肽含量，可考慮采用測定各氨基酸組成的方法，間接測定肽的含量。

2.5 核苷和核堿組成

云芝糖肽中含有多種核苷和核堿，尤以腺苷具有明顯的藥理作用，如改善心腦血液循環(huán)、防止心律失常、抑制神經(jīng)遞質(zhì)釋放和調(diào)節(jié)腺苷酸環(huán)化酶活性等[5]。

李娟等[5]采用超聲法提取云芝糖肽30 min，HPLC法測定出8種核苷的含量，胞嘧啶∶尿嘧啶∶胞苷∶次黃嘌呤∶尿苷∶腺嘌呤∶鳥苷∶腺苷（物質(zhì)的量之比） 為 147.0∶73.1∶68.0∶100.0∶62.9∶135.4∶42.5∶60.5。楊豐慶等[14]利用毛細管電泳-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)測定靈芝藥材中8種核苷類成分，可為云芝糖肽的核苷成分測定提供技術(shù)參考。

2.6 指紋圖譜分析

由于云芝糖肽結(jié)構(gòu)復(fù)雜，分子量較大，需要建立分離效率較高的指紋圖譜，區(qū)分力更強的化學(xué)計量學(xué)手段，識別共有峰和共有模式，以加強質(zhì)控[15-20]。

袁萍等[15]建立了毛細管電泳分析云芝糖肽的方法，采用低波長和硼酸鹽緩沖液，檢測出15個指紋峰，將云芝糖肽與牛血清白蛋白分離。朱麗玢等[16]利用毛細管區(qū)帶電泳方法將云芝糖肽與市售糖肽類藥物進行區(qū)分。

目前用質(zhì)譜法對云芝糖肽進行指紋圖譜的分析測定還未報道，相關(guān)多糖和糖肽的質(zhì)譜研究報道可以為云芝糖肽的指紋圖譜研究提供有益的參考。

張洪濤等[17]采用快速蛋白液相色譜（fast protein liqiud chromatography，F(xiàn)PLC） 法分離香菇（Lentinus edodes）多糖，對于聚合度高于4的香菇多糖寡糖用電噴霧離子化-碰撞誘導(dǎo)解離質(zhì)譜（electro-spray ionization-collision induced dissociation-mass spectrometer/mass spectrometer， ESI-CID-MS/MS） 法 測定其分子量，并對其多糖水解機制進行解析。王志軍等[18]利用TMS衍生化技術(shù)，建立了靈芝GC-MS指紋圖譜，檢出有機酸、多醇、氨基酸、腺苷、單糖、雙糖、糖醇、甾醇等多種物質(zhì)。張順偉等[19]將此信息進行化學(xué)計量學(xué)分析，進行模式識別。楊秋霞等[20]運用傅立葉變換離子回旋共振質(zhì)譜法（FTICR-MS）對赤靈芝的化學(xué)成分進行鑒定，采用ESI負離子模式，建立指紋圖譜分析方法，發(fā)現(xiàn)萜烯醛、糖、三萜醇、有機酸和三萜酸類成分。這些對于真菌類藥物化學(xué)成分的研究，可為云芝糖肽的化學(xué)組成的進一步探索提供技術(shù)支持。

3 二級結(jié)構(gòu)研究

3.1 糖苷鍵分析

β-1,3/1,6-葡聚糖可通過與免疫系統(tǒng)信號蛋白進行識別進而激活免疫系統(tǒng)實現(xiàn)其生物學(xué)功能，故對糖肽進行糖苷鍵分析具有重要意義[17]。PSP和PSK的多糖部分含α-1,4和β-1,3糖苷鍵[2]。

目前對于糖苷鍵的研究，主要分為化學(xué)方法（高碘酸氧化、Smith 降解、甲基化分析等）[6，8，12]和儀器分析（飛行時間質(zhì)譜）[17，21-22]兩類。

鄒巧根等[6]將云芝糖肽高碘酸氧化產(chǎn)物還原后酸水解，再鑒定水解產(chǎn)物，根據(jù)高碘酸的消耗量和甲酸的釋放量，從而推知云芝糖肽中可能含有1→4、1→6糖苷鍵，無1→3糖苷鍵。

鄒巧根等[6]對氫譜和碳譜（1HNMR和13CNMR）進行分析，表明云芝糖肽中含有α-糖苷鍵和β-糖苷鍵。Lin等[8]利用傅里葉變換紅外光譜（FTIR） 的特征波數(shù)，提示PSP中含有β（1→3） 糖苷鍵。Jeong等[12]運用甲基化-GLC-MS技術(shù)，對云芝提取物進行糖苷鍵分析，測得1→4、1→6糖苷鍵和1→3糖苷鍵。

Rau等[22]將云芝糖肽經(jīng)0.5 mol·L-1的TFA水解后，利用微流四級桿飛行時間質(zhì)譜（μQTOF/MS）技術(shù)測定，表明云芝胞外多糖中1→4糖苷鍵或1→6糖苷鍵的存在。高效液相色譜-電噴霧離子化-四級桿飛行時間質(zhì)譜（high performance liquid chromatography-electro-spray ionization-collision-Q-time-offlight mass spectrometer,HPLC-ESI-QTOF）[17]和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization,MALDI-TOF）[21]技術(shù)也成熟應(yīng)用于糖苷鍵的研究。

3.2 糖肽鍵分析

目前，蛋白質(zhì)糖基化分析分為化學(xué)方法和質(zhì)譜方法[6，23-25]?；瘜W(xué)方法是指利用PNGaseF酶（N-糖肽）或β消除反應(yīng)（O-糖肽）等方法將蛋白質(zhì)和糖鏈解離后分別鑒定[24]。利用質(zhì)譜方法進行完整糖肽分析可以更好地還原生物樣品的真實狀態(tài)。

鄒巧根等[6]對β-消除反應(yīng)前后氨基酸分析結(jié)果顯示，絲氨酸和蘇氨酸的相對含量無明顯變化，說明云芝糖肽糖肽鍵的連接方式不是O-連接[23]。

完整糖肽質(zhì)譜解析近年來多用于進行糖基化位點的確認、肽段序列分析以及糖鏈結(jié)構(gòu)分析、蛋白質(zhì)與糖鏈之間連接方式的分析[24]。其要求對糖肽片段進行富集，方法包括親水相互作用色譜（HILIC）、凝集素（lectin） 親和以及硼酸親和[25]。質(zhì)譜檢測器一級和二級質(zhì)量分析器均要有足夠?qū)挼馁|(zhì)量范圍；其次，低質(zhì)量區(qū)的特征碎片離子是糖肽結(jié)構(gòu)研究的重要參照，二級質(zhì)譜質(zhì)量分析器需要覆蓋低質(zhì)量區(qū)的特征碎片離子質(zhì)量數(shù)[24]。

4 立體結(jié)構(gòu)研究

4.1 分子量

云芝糖肽的重均分子量在100 kDa左右，其分子量分布隨測定條件、發(fā)酵條件、提取工藝等因素而變化，不是一個絕對值[26]。目前絕大多數(shù)文獻采用分子排阻色潽法-示差折光檢測器（SEC-RI）[26]進行相對分子量的測定。該方法的原理為對照品右旋糖酐保留時間不隨流動相鹽濃度改變，但結(jié)合蛋白多糖的構(gòu)型及分子形態(tài)大小受流動相中電解質(zhì)（鹽）濃度的影響，故云芝糖肽的保留時間會隨之改變。從標(biāo)準(zhǔn)曲線上測得云芝糖肽主要組分的分子量大于50萬道爾頓。

也有文獻嘗試利用SEC-示差-激光光散射-黏度檢測器（SEC-RI-LLS-DP）[27]測定多糖的重均相對分子質(zhì)量、回旋半徑及含量和多分散系數(shù)，或利用分子排阻色譜法-示差-激光光散射檢測器（SEC-RILLS）[28]進行絕對分子量的測定，可為云芝糖肽的絕對分子量測定提供參考。

4.2 糖肽蛋白結(jié)合態(tài)的研究

云芝糖肽中，多糖和蛋白質(zhì)共價緊密結(jié)合，使PSP與云芝子實體多糖或菌絲體胞外多糖中存在非結(jié)合蛋白質(zhì)/肽的混合體系區(qū)分開來[29]。多種方法可以驗證這一結(jié)合態(tài)，包括凝膠色譜法、二乙氨基乙基纖維素（DEAE）陰離子交換色譜法以及電泳法[6，9，29]。

楊曉彤等[30]利用凝膠色譜法將糖肽進行液相分離，洗脫液用示差檢測器和紫外檢測器串聯(lián)檢測，若示差檢測器（多糖響應(yīng)）與紫外檢測器（蛋白質(zhì)響應(yīng)）同時出峰且峰位完全吻合，則認為糖肽處于緊密結(jié)合的狀態(tài)。

云芝糖肽國家藥品標(biāo)準(zhǔn) [標(biāo)準(zhǔn)文號WS3-228（Z-047） -2003(Z)]的鑒定項目，主要采用二乙氨基乙基纖維素（DEAE）陰離子交換色譜法，分段收集洗脫液，分別加入茚三酮和苯酚-硫酸溶液進行驗證，鑒定糖肽聯(lián)結(jié)[9，29]。

鄒巧根等[6]將云芝糖肽經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后，結(jié)果既呈現(xiàn)出多糖顯色特征又呈現(xiàn)蛋白顯色特征，而作為對照用的標(biāo)準(zhǔn)多糖樣品，只呈現(xiàn)出多糖的顯色特征，說明云芝糖肽中有結(jié)合態(tài)的蛋白。

5 結(jié)論

云芝糖肽作為商品化的免疫增強藥物和抗腫瘤藥物已經(jīng)使用多年，通過對云芝糖肽的理化性質(zhì)、化學(xué)成分、結(jié)構(gòu)等進行了綜述，并對分析方法做出總結(jié)。隨著對云芝糖肽的研究的不斷深入，云芝糖肽的組成、結(jié)構(gòu)和性質(zhì)會被進一步揭示，統(tǒng)計學(xué)方法對復(fù)雜藥材成分的進一步歸納分析，從而提供對其生產(chǎn)加工各環(huán)節(jié)更有益的幫助，并對了解云芝糖肽的藥理作用提供了化學(xué)基礎(chǔ)。云芝糖肽必將會有更好的應(yīng)用前景。