殼聚糖促進口腔軟組織修復(fù)的研究進展

齊遠(yuǎn)征 焦俊杰 李永麗 楊詩卉 張靜潔 周延民 趙靜輝

作者單位：130021長春，吉林大學(xué)口腔醫(yī)院 吉林省牙發(fā)育及頜骨重塑與再生重點實驗室（趙靜輝為通訊作者）

殼聚糖（chitosan，CS），又名脫乙酰甲殼素，是一種由β-（1，4）-2-乙酰氨基-D-葡萄糖和β-（1，4）-2-氨基-D-葡萄糖為單體組成的天然高分子聚合物[1]，也是自然界中目前發(fā)現(xiàn)的唯一帶有正電荷的堿性多糖，廣泛存在于甲殼類動物、真菌的外骨骼中，年產(chǎn)量大約為一萬億噸[2，3]。作為僅次于纖維素的第二大類天然高分子化合物，CS具有多種生物學(xué)性能，如優(yōu)異的生物相容性、可靠的生物安全性和可降解性等，在骨組織工程、牙周組織工程、生物載體等領(lǐng)域得到了廣泛的研究和應(yīng)用[4～6]。近年來，外傷、炎癥、腫瘤等因素常常對口腔軟組織造成不同程度的損傷，嚴(yán)重影響患者的張口、咀嚼、發(fā)音、吞咽等基本功能。帶蒂瓣軟組織技術(shù)、游離軟組織移植術(shù)可在一定程度實現(xiàn)軟組織重建，局限性在于增加新的創(chuàng)面且供區(qū)有限[7]。因此，開發(fā)不同類型支架材料使之替代軟組織移植成為當(dāng)下研究熱點。本文就CS促進口腔軟組織修復(fù)的研究進展作一綜述。

一、CS的基本性質(zhì)及對軟組織修復(fù)的意義

1.抗菌性：作為天然抗菌劑，CS具有廣譜抗菌作用，抗菌效果與CS的劑型、相對分子質(zhì)量、脫乙酰度、溫度、pH值以及微生物類型等因素有關(guān)[8，9]。CS的抗菌作用與其所帶的正電荷密切相關(guān)，氨基質(zhì)子化的CS可與革蘭陽性細(xì)菌表面帶負(fù)電荷的磷壁酸發(fā)生靜電作用，導(dǎo)致細(xì)胞表面通透性增加，細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)滲漏，細(xì)菌形態(tài)明顯變化，引起細(xì)胞死亡。此外，CS也可與革蘭陰性細(xì)菌表面的脂多糖，真菌細(xì)胞表面的磷脂發(fā)生靜電作用，達到抑菌效果[10]。CS還可以通過干擾微生物DNA表達，螯合金屬離子，形成致密聚合物薄膜阻止微生物營養(yǎng)物質(zhì)交換等方式發(fā)揮抗菌作用[11]。在軟組織修復(fù)過程中，防止微生物感染是手術(shù)成功和愈后效果滿意的關(guān)鍵。人類口腔生態(tài)系分布著許多正常菌叢，這種有菌環(huán)境增加了傷口感染的風(fēng)險，傷口感染會造成軟組織延遲愈合，甚至引發(fā)敗血癥導(dǎo)致病人死亡[12]。CS作為理想的抗菌材料，可以減少傷口部位的致病菌數(shù)量，為受損組織提供穩(wěn)定的修復(fù)環(huán)境。

2.止血性：CS止血作用與其結(jié)構(gòu)表面攜帶的高密度正電基團有關(guān)，人體中紅細(xì)胞和血小板表面均帶有不等量的負(fù)電荷，CS能夠通過靜電作用增強紅細(xì)胞和血小板的黏附和聚集，進而形成血凝塊封閉破裂血管，從而達到止血效果[13]。眾多學(xué)者發(fā)現(xiàn)[14，15]，不同脫乙酰度CS均可促進紅細(xì)胞和血小板的聚集。目前，研制的CS基止血材料已取得滿意效果。Radwan-Praglowska等[16]成功開發(fā)一種新型CS基止血劑，可促進紅細(xì)胞在生物材料表面黏附，加速血凝塊的形成。Yuan等[17]開發(fā)的CS基納米復(fù)合材料，對紅細(xì)胞和血小板的黏附性更強，止血效果優(yōu)于商用止血產(chǎn)品Surgicel紗布。止血是軟組織修復(fù)過程的首要階段，迅速控制出血能加速軟組織修復(fù)從止血階段向炎癥反應(yīng)階段過渡[18]，從而縮短治療時間，提高軟組織修復(fù)的愈合效率。

3.促愈合性：CS是一種線狀的天然碳水化合物，與細(xì)胞外基質(zhì)的結(jié)構(gòu)相似，細(xì)胞外基質(zhì)在協(xié)調(diào)和引導(dǎo)細(xì)胞表型、黏附、遷移和增殖方面起著關(guān)鍵作用。CS表面具有游離的氨基和羥基等親水基團，可以把組織液和細(xì)胞吸引到軟組織損傷部位，促進細(xì)胞黏附、增殖和分化[19，20]。基于自身良好的促愈合性能，CS可參與受損皮膚、黏膜等部位軟組織修復(fù)的各個階段，在皮膚燒傷[21]、口腔黏膜缺損修復(fù)[22，23]等領(lǐng)域有著廣泛的研究。此外，Ducret等[24]發(fā)現(xiàn)CS還可以在不改變牙髓細(xì)胞的活力、形態(tài)的前提下，促進牙髓組織再生。

二、CS促進軟組織修復(fù)的機制

軟組織修復(fù)是一個涉及多種細(xì)胞和細(xì)胞因子的復(fù)雜而連續(xù)的動態(tài)過程，包括止血、炎癥反應(yīng)、細(xì)胞增生和組織重塑四個階段[18]，正常軟組織修復(fù)依賴角質(zhì)形成細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、生長因子、炎癥因子等的相互協(xié)調(diào)。在止血階段，受損軟組織發(fā)生反射性血管收縮，同時，活化凝血因子Ⅹ與Ca2+、PF3、AFV形成凝血酶原激活劑，受激活的凝血酶可以將纖維蛋白原轉(zhuǎn)化為纖維蛋白，從而凝聚紅細(xì)胞和血小板。血小板的黏附、聚集與其表面特異性糖蛋白GPⅠa-Ⅱa、GPⅥ、GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ、GPⅡb-Ⅲa有關(guān)。Periayah等[25]發(fā)現(xiàn)CS可增強血小板GPⅡb-Ⅲa的表達從而加速血小板的凝聚。Hou等[26]發(fā)現(xiàn)CS納米顆粒可增強血小板源性生長因子-BB的表達，對毛細(xì)血管周細(xì)胞的聚集起重要作用。當(dāng)軟組織修復(fù)進入炎癥反應(yīng)階段，受損軟組織中會產(chǎn)生活性氧（reactive oxygen species，ROS）。作為氧化應(yīng)激誘導(dǎo)劑，少量ROS對軟組織修復(fù)有益，大量ROS累積會導(dǎo)致傷口持續(xù)保持炎癥狀態(tài)，阻礙軟組織愈合。ROS可激活核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）/Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1（Keap1）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，加強Nrf2及下游調(diào)控的抗氧化酶的表達，包括血紅素氧合酶1、NAD（P）H醌氧化還原酶1和谷胱甘肽等[27]。研究發(fā)現(xiàn)[28]，低聚CS能夠顯著促進Nrf2和血紅素氧合酶1的表達，通過激活抗氧化防御系統(tǒng)減輕氧化應(yīng)激。Zhang等[29]報道，殼寡糖通過激活p38和JNK-MAPK介導(dǎo)的Nrf2/ARE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路預(yù)防阿霉素誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激。細(xì)胞增生和組織重塑階段以肉芽組織的形成、膠原蛋白沉積、廣泛的再上皮化為特征。CS可以在生物體內(nèi)酶的作用下降解生成CS單體，逐漸釋放N-乙酰-D-葡萄糖胺，從而刺激軟組織損傷區(qū)域成纖維細(xì)胞增殖與黏附，促進Ⅲ型膠原的產(chǎn)生，幫助膠原蛋白有序沉積，并刺激傷口部位天然透明質(zhì)酸水平的提高，加速肉芽組織的形成，促進軟組織再上皮化[20，30，31]。此外，CS對軟組織修復(fù)過程中相關(guān)生長因子、炎癥因子的表達具有重要作用。據(jù)報道[32]，CS能調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)化生長因子-β、血小板衍生生長因子和白介素-1等因子的分泌，這些細(xì)胞因子能夠誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管膠質(zhì)細(xì)胞等進一步發(fā)生級聯(lián)反應(yīng)，加速軟組織修復(fù)過程。Venkataprasanna等[20]利用CS制備的復(fù)合貼片可刺激多形核細(xì)胞和單核細(xì)胞的遷移，刺激嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞吞噬并產(chǎn)生白細(xì)胞B4和白介素-1（IL-1），促進上皮再生。XU等[33]研制了負(fù)載人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞的功能性可注射溫敏性CS水凝膠，可增加膠原蛋白沉積和角質(zhì)形成標(biāo)志物K1的表達，抑制傷口過度炎癥，加速軟組織愈合。Chen等[34]研制了基于乙二醇-CS的抗菌性凍凝膠，通過激活C3a和C5a，增加基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1和轉(zhuǎn)化生長因子-β1的分泌。

三、CS在口腔軟組織修復(fù)中的應(yīng)用類型

1.膜型：CS作為一種天然高分子化合物對口腔軟組織的修復(fù)有著積極的作用。局部應(yīng)用CS或其復(fù)合材料促進口腔軟組織修復(fù)的試驗?zāi)壳罢粐鴥?nèi)外學(xué)者探討和研究。Lotfi等[22]使用蒸發(fā)溶劑和冷凍干燥法制備CS薄膜，在雜交犬雙側(cè)上頜尖牙、上頜第二前磨牙和下頜第二前磨牙牙齦區(qū)域建立口腔黏膜缺損模型。結(jié)果顯示，CS薄膜組和負(fù)載牙齦成纖維細(xì)胞CS薄膜組均具有增加犬角化齦寬度的效果，且具有良好的生物安全性。K?l??等[23]制備單純CS薄膜和谷胱甘肽（GSH）：CS=1：1（w/w）的薄膜，在新西蘭兔下頜門齒和磨牙之間建立寬度為15mm的黏膜缺損。研究發(fā)現(xiàn)單純CS組和CS+GSH薄膜組均可以幫助軟組織愈合，CS+GSH薄膜組的軟組織中丙二醛（MDA）水平低于其他組。Choi等[35]采用靜電紡絲法制備了基于CS、Eudragit?L（EL）的納米纖維膜，結(jié)果證實了含有人生長激素（hGH）的基于CS、EL的納米纖維膜對酸性口腔黏膜潰瘍部位具有良好的軟組織修復(fù)效果，0.5% CS/EL/hGH纖維膜能夠使口腔黏膜潰瘍完全愈合。另外，有學(xué)者專門報道了CS復(fù)合膜組織相容性的研究。張開潤等[36]運用冰浴超聲破碎技術(shù)制成CS-氧化石墨烯復(fù)合膜，證明其有利于人牙齦成纖維細(xì)胞（HGF）增殖和黏附，具有良好的組織相容性。

2.凝膠型：水凝膠比任何其他類型的合成聚合物材料更像天然軟組織，這使得與細(xì)胞的黏附變得更容易，這些特性有助于維持細(xì)胞形態(tài)并促進細(xì)胞增殖?；贑S水凝膠擁有良好的生物學(xué)性能，凝膠型CS及其復(fù)合材料促進軟組織修復(fù)的作用已被證實[37，38]。Miranda等[5]采用CS、改性透明質(zhì)酸（HA）制備CS-HA復(fù)合水凝膠，Alamar Blue測試顯示此水凝膠內(nèi)細(xì)胞活力增強和CD44表達明顯增加，證明該水凝膠良好的細(xì)胞相容性，可促進成纖維細(xì)胞黏附。Huang等[21]開發(fā)的羧甲基CS-醛改性碳納米管可注射納米復(fù)合自愈水凝膠，可完全覆蓋損傷面積較大和不規(guī)則形狀的創(chuàng)面，在軟組織愈合中表現(xiàn)出更高的創(chuàng)面愈合率，創(chuàng)面膠原纖維密集且排列平行，創(chuàng)面瘢痕較少。Ji等[39]首次將基于CS、聚谷氨酸（PG）的聚電解質(zhì)復(fù)合物（PEC）水凝膠與羥基磷灰石（HA）復(fù)合作為真皮充填劑，體內(nèi)實驗表明，此真皮充填劑具有良好的生物相容性，可促進成纖維細(xì)胞分泌膠原蛋白。Jaikumar等[40]研制的海藻酸鈉/納米纖維蛋白/O-羧甲基CS可注射性水凝膠彈性模量約2kPa，接近天然脂肪組織，并且支持人脂肪干細(xì)胞（hADSCs）黏附、增殖和分化，是軟組織修復(fù)的理想材料。Luo等[41]成功開發(fā)了一種CS基熱凝膠，研究結(jié)果表明，該熱凝膠在體外能抑制革蘭氏陽性和革蘭氏陰性細(xì)菌，并促進牙齦成纖維細(xì)胞的增殖，有望成為治療口腔黏膜潰瘍的一種有前途的注射型治療劑。

3.海綿型:CS海綿是一種有效的止血敷料，具有相互連通的多孔結(jié)構(gòu)、高溶脹能力、良好的抗菌活性和快速止血能力。Cheng等[42]采用共價偶聯(lián)和冷凍干燥法制備了羧甲基CS接枝膠原肽海綿（CMC-COP），皮膚燒傷實驗發(fā)現(xiàn)，第7天可實現(xiàn)表皮再生，膠原纖維沉積，第14天表皮完全愈合，第21天創(chuàng)面完全愈合。Varoni等[43]運用冷凍干燥法、電化學(xué)沉積法開發(fā)了一種基于CS的三層海綿狀多孔支架，該支架不僅可以促進口腔牙齦組織修復(fù)，也可促進牙周骨骼和牙周韌帶的再生，具有很高的生物相容性。研究發(fā)現(xiàn)[44]，負(fù)載姜黃素或PRP-Exos的CS/絲素水凝膠海綿，在修復(fù)糖尿病小鼠皮膚軟組織損傷中發(fā)揮良好的作用。無論單獨或聯(lián)合治療均顯著加速了糖尿病大鼠傷口的收縮、再上皮化、膠原合成和沉積，以及真皮血管的生成，從而使糖尿病傷口更快的愈合。Hu等[45]將羥丁基CS與CS物理混合，通過真空冷凍干燥形成多孔復(fù)合海綿，復(fù)合海綿的保水性和紅細(xì)胞聚集性分別優(yōu)于CS海綿和羥丁基CS海綿，大鼠創(chuàng)面愈合實驗表明，與CS海綿和羥丁基CS海綿相比，復(fù)合海綿能支持上皮細(xì)胞的爬行生長，促進創(chuàng)面愈合。海綿的三維多孔結(jié)構(gòu)具有較高的吸水率和穩(wěn)定性，有利于保存軟組織所需的營養(yǎng)物質(zhì)和保持傷口濕潤，從而促進上皮細(xì)胞在復(fù)合海綿中的爬行生長，加速傷口愈合。

4.其他:近年來，一些學(xué)者嘗試開發(fā)新型CS復(fù)合物。Park等[46]研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)水溶性甲殼素（WSC）處理人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（hBMSCs）植入小鼠體內(nèi)后，能夠顯著增加膠原蛋白、透明質(zhì)酸合成酶和賴氨酰氧化酶家族的表達。據(jù)Kalyoncuoglu等[47]報道，HGF在CS包被的Al2O3和ZrO2表面具有良好的黏附和增殖作用。當(dāng)下，CS常被制成膜型、凝膠型、海綿型復(fù)合材料應(yīng)用于受損軟組織修復(fù)的研究，有望作為新型軟組織修復(fù)材料，解決天然牙、種植修復(fù)義齒周圍軟組織輪廓缺損、角化齦不足、鄰間隙齦乳頭喪失等臨床問題，代替?zhèn)鹘y(tǒng)的軟組織移植術(shù)。此外，基于良好的止血性、抗菌性、促愈合性，CS有望在治療口腔黏膜潰瘍疾病方面發(fā)揮重要作用。

綜上所述，CS因其豐富的生物學(xué)性能，不僅可以與眾多材料復(fù)合被加工成不同類型，也能夠攜帶種子細(xì)胞、生長因子，作為生物支架協(xié)同促進軟組織修復(fù)。然而，關(guān)于CS促進口腔軟組織修復(fù)的研究尚有不足。①研究尚處于起步階段，細(xì)胞研究以HGF、hBMSCs為主，CS對牙齦上皮細(xì)胞、齦溝上皮細(xì)胞、結(jié)合上皮細(xì)胞的影響未見報道。②動物實驗以研究皮膚損傷居多，缺乏口腔內(nèi)軟組織缺損動物模型。③關(guān)于口腔軟組織缺損模型的建立，國內(nèi)尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)。④不同類型的CS復(fù)合材料在軟組織修復(fù)中的作用機制仍需進一步研究。