三維打印結(jié)合組織工程技術(shù)在下頜骨缺損重建的臨床前研究進展

劉 涵 邱 林 劉 浩 張 軍 李瑞欣

作者單位：300041天津市口腔醫(yī)院/南開大學口腔醫(yī)院，天津市口腔功能重建重點實驗室（李瑞欣、張軍為通訊作者）

三維（3D）打印技術(shù)是一系列快速成型技術(shù)的統(tǒng)稱，其原理是指在計算機控制下，根據(jù)物體的計算機輔助設(shè)計（CAD）模型或計算機斷層掃描（CT）等數(shù)據(jù)，通過材料的精確逐層3D堆積，快速制作形狀復雜的物體[1]。組織工程是近年來正在興起的一門新學科，屬于生物高技術(shù)范疇，主要是將細胞生物學和材料科學相結(jié)合，進行體外或體內(nèi)組織或器官的構(gòu)建。本文通過廣泛查閱相關(guān)文獻，總結(jié)下頜骨缺損重建中不同3D打印材料、打印工藝、打印結(jié)構(gòu)設(shè)計對修復體成骨狀況和機械性能的影響，對骨支架研發(fā)的難點和熱點進行分析，希望為新型下頜骨缺損修復支架的研發(fā)提供參考。

一、下頜骨缺損修復概況

因腫瘤或創(chuàng)傷等引起的下頜骨缺損發(fā)生率較高，下頜骨缺損會對患者的容貌、言語和咀嚼功能造成不良影響，其修復重建除了對形態(tài)的恢復要求較高外，還需要有足夠的機械強度來承擔周圍軟組織和后期義齒修復或種植體植入后的長期壓力，這在一定程度上增加了下頜骨缺損修復的難度。

目前臨床上主要采用自體腓骨、髂骨游離移植來進行下頜骨缺損區(qū)域的修復，雖然能在一定程度上恢復患者的面型和功能，但該方法既造成供區(qū)新的創(chuàng)傷，又存在手術(shù)時間長，塑性不良等缺陷[2]。近年來逐漸出現(xiàn)在傳統(tǒng)自體骨移植術(shù)基礎(chǔ)上使用3D打印技術(shù)制作下頜骨截骨導板、供區(qū)截骨及塑形導板來輔助手術(shù)進行，導板既可以簡化手術(shù)過程、降低手術(shù)并發(fā)癥，又能達到精確重建的目的，在臨床上已成功推廣應(yīng)用并取得了良好的效果[3]。

自體骨移植術(shù)因始終存在損傷供區(qū)，降低患者生存質(zhì)量等問題，難以再進一步完善。隨著3D打印技術(shù)的發(fā)展和材料學的進步，骨組織工程技術(shù)也開始逐漸應(yīng)用到骨缺損重建中，這為下頜骨缺損重建帶來了新的可能。近年來快速成型技術(shù)工藝得到進一步發(fā)展和完善，不僅可以打印解剖形態(tài)高度仿真的個性化下頜骨修復體，其所具備的數(shù)字設(shè)計和數(shù)字制造工藝還可以實現(xiàn)支架的最優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計及復合材料打印[4]，使得越來越多關(guān)于下頜骨重建的研究已經(jīng)轉(zhuǎn)向組織工程領(lǐng)域。其潛在的優(yōu)勢不僅包括減少患者損傷、縮短手術(shù)時間和精確恢復外形，還可以通過組合各種材料、干細胞、生長因子以及優(yōu)化結(jié)構(gòu)設(shè)計來更好的實現(xiàn)功能重建[5，6]。

二、骨組織工程支架材料的選擇

在運用3D打印技術(shù)制備骨組織工程支架時材料的選擇是至關(guān)重要的。組織工程的核心就是建立細胞與生物材料的三維空間復合體，即具有生命力的活體組織，用以對病損組織進行形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能的重建并達到永久性替代，所以用于骨支架制備的3D打印材料不僅應(yīng)具備良好的可打印性，還必須具備生物相容性、可成骨性及良好的降解性能。此外因支架是用于下頜骨的缺損修復，材料選擇時還必須具備足夠的機械強度用于承擔周圍軟組織和后期義齒修復或種植體植入后的長期壓力?，F(xiàn)有的單一材料往往無法滿足下頜骨復雜的性能要求，因此研究多為具備幾種不同性能的材料混合打印或負載生長因子等以提高材料的綜合性能，滿足重建需求。以下對用于骨組織工程支架制備的各種3D打印材料進行介紹。

1.金屬鈦合金材料

用于3D打印的金屬材料鈦合金因具有良好的機械性能一直是生產(chǎn)骨科植入物的最佳選擇。張慶福等[7]用3D打印鈦合金修復體進行一例下頜骨角化囊腫病例后下頜骨修復重建工作，修復體在解剖形態(tài)上完全達到仿真效果，使得解剖形態(tài)各異的下頜骨修復體的設(shè)計制作和臨床應(yīng)用成為現(xiàn)實。Peng Li[8]等制備了多孔鈦支架，通過力學性能分析發(fā)現(xiàn)其楊氏模量和抗壓強度與骨結(jié)構(gòu)相近，并且具有良好的生物相容性和骨整合能力，具有潛在的臨床應(yīng)用價值。復合其他材料及生長因子可提高鈦網(wǎng)成骨性能，例如通過噴涂羥基磷灰石（HA）對多孔鈦修復體表面進行生物活化改性可增強骨整合能力，提高植入后穩(wěn)定性；復合人骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）等生物刺激物可以加速骨重建[9]。雖然鈦合金目前仍然是骨修復植入體的主流材料，但其存在的應(yīng)力屏蔽、骨整合力不足、局部腐蝕及缺乏降解性等問題是造成植入體松動與失效的潛在風險。隨著再生醫(yī)學及材料學的進步，更多天然生物及合成高分子材料被進一步研究。

2.天然及合成高分子復合材料

天然生物材料如膠原蛋白、絲素蛋白、殼聚糖等，其本質(zhì)上是多糖或蛋白質(zhì)，類似于天然的細胞外基質(zhì)（ECM），具有良好的細胞相容性、低免疫原性及可降解性，是修復植入的理想材料[10，11]。羥基磷灰石（HA）[12]作為人體骨的主要成分，具有良好的骨傳導性，可提高復合材料的力學性能，也是骨科修復材料的理想選擇。唐鳴等[13]將預制的多孔絲素蛋白支架原位植入兔下頜骨臨界性骨缺損中，骨缺損腔表面完全被新生骨覆蓋，材料無脫出，表明多孔絲素蛋白支架用于原位組織工程修復骨缺損具有一定可行性。復合羥基磷灰石可明顯提高絲素蛋白骨修復材料的力學性能，提高成骨活性[14]。

合成材料如聚己內(nèi)酯（PCL）、聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）等用于頜面缺損修復主要歸因于其易成孔、可降解性和良好的力學性能，但是需要通過改性提高其細胞粘附性[15]。Christopher D[16]等用100%β-磷酸三鈣制成三維打印陶瓷支架并用于治療兔下頜骨節(jié)段性缺損，組織學檢測及CT成像顯示該支架適合缺損修復，具備良好的成骨能力。Po-Chun Chang等[17]將90%羥基磷灰石和10%聚乳酸-羥基乙酸組成的支架材料植入大鼠下頜的穿透性骨缺損處，發(fā)現(xiàn)支架具有可接受的尺寸穩(wěn)定性和良好的骨再生能力。Lee[18]等以犬下頜骨為模型，采用多頭沉積系統(tǒng)制備了聚己內(nèi)酯/β-磷酸三鈣（PCl/β-TcP）支架，證實了其在下頜骨重建中的潛力。Wei[19]等采用冷凍干燥法制備了鋅（Zn）摻雜羥基磷灰石微球（Zn-MHMs）的膠原支架，設(shè)計用于模擬骨小梁，顯示支架有促進骨再生的作用并且Zn-MHMs在藥物輸送方面是有效的。

以上表明將不同材料共混打印制備復合支架可以彌補單一材料的性能不足，并滿足了生物活性、機械強度、易于制造和可控降解的各種要求，是構(gòu)建新型組織工程支架的一種很有前途的途徑。

3.復合細胞或生長因子的生物材料

支架負載細胞或生長因子可提高支架的骨整合能力。Michael G[20]等采用選擇性激光燒結(jié)法打印梯形聚醚酮酮（PEKK）多孔支架并復合脂肪來源干細胞（ADSCs），然后將其植入新西蘭兔下頜骨缺損中，結(jié)果表明三維打印的PEKK支架與ADSCs結(jié)合，為下頜骨重建后改善骨-種植體界面、提高咀嚼時受力提供了一種很有前途的解決方案。Matthew K[21]等將PLGA單獨支架及與骨形態(tài)發(fā)生蛋白（BMP-2）和脂肪來源干細胞（ASCs）復合支架用于大鼠下頜骨臨界大小節(jié)段性缺損修復的比較研究，證實攜帶成骨因子的仿生支架誘導臨界大小的下頜骨節(jié)段性缺損愈合的效果最好。Nan Deng[22]等采用三維打印技術(shù)將載人骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2的殼聚糖（CS/rhBMP-2）納米緩釋載體與聚乳酸/納米羥基磷灰石（PLGA/nHA）支架復合制備組織工程化骨支架復合體，PLGA/nHA/CS/rhBMP-2支架復合物有效地控制了rhBMP-2的早期破裂效應(yīng)，具有良好的生物相容性和誘導成骨作用，成功修復了兔下頜骨實驗性骨缺損區(qū)。Wenhai Zhang[23]等制備了負載雙重生物活性小分子（白藜蘆醇和雷諾酸鍶）的三維打印PCL/水凝膠復合支架并植入到具有臨界大小的下頜骨缺損的大鼠模型中，發(fā)現(xiàn)含有雙重小分子的骨支架在促進血管生成和抑制破骨細胞活性方面具有聯(lián)合優(yōu)勢，并且它們協(xié)同促進成骨分化。

生物材料輔助的下頜骨重建能以可控和擴展的方式將抗生素局部釋放到下頜骨缺損處，以預防和治療感染，打印支架載抗腫瘤藥物、生長因子、細胞、光熱材料或其他生物材料可使其修復缺損的同時也具備一定的抗腫瘤、抑菌、成骨等功效，提高了支架的綜合性能，有望為腫瘤引起的頜骨大范圍缺損探索出一條新的理想修復途徑。

三、3D打印技術(shù)的選擇

1.常用的3D打印技術(shù)

3D打印技術(shù)的選擇依賴材料的固有特性，其中金屬粉末的熔接主要依靠選擇性激光熔化（SLM）和選擇性電子束熔化（SEBM）技術(shù)，這兩種工藝都能夠完成高精度的復雜設(shè)計，因具有尺寸精度好、構(gòu)建分辨率高、構(gòu)建環(huán)境干凈、節(jié)省材料、可定制化程度高等優(yōu)點，在金屬材料3D打印修復骨缺損方面顯示出巨大的潛力[24]，下頜骨鈦網(wǎng)打印多是應(yīng)用此技術(shù)。

非金屬材料，特別是樹脂類材料主要采用光固化成形技術(shù)（SLA）進行打印，SLA可以創(chuàng)建高分辨率和精確的幾何形狀，已被廣泛用于制作骨組織工程支架[25]；陶瓷材料打印目前主要依靠直接擠壓式的三維打印技術(shù)，該技術(shù)操作簡便且應(yīng)用廣泛[26]；熱塑性材料可采用熔融堆積成型技術(shù)（FDM）進行打印，通過對溫度的控制可對打印出的模型材料進行固定，利用FDM對PCL、聚乳酸（PLA）和聚乳酸-羥基乙酸共聚物（PLGA）等熱塑性材料進行快速成型是獲得3D頜骨模型的一種準確、可重復性和符合滅菌要求的方法，F(xiàn)DM在制作頜骨截骨導板時有較多應(yīng)用，但因為操作時的溫度相對較高，F(xiàn)DM不能支持進行細胞或?qū)囟让舾械纳锊牧线M行同時打印[27]。

復雜三維結(jié)構(gòu)產(chǎn)品的制造依賴于打印技術(shù)的進步，如何提高打印技術(shù)滿足復合材料的打印需求及實現(xiàn)高精度打印是需要進一步深入研究的。

2.優(yōu)化3D打印技術(shù)

3D生物打印是近年來的研究熱點，可用于精確分配細胞負載的生物材料，制造細胞分布可控的支架，用于構(gòu)建復雜的3D功能活組織或人工器官，目前的3D生物打印機大多采用擠壓式生物打印技，3D生物打印技術(shù)為構(gòu)建具有復雜結(jié)構(gòu)和生物活性成分的骨組織工程構(gòu)筑物提供了一種很有前途的工具[28]。

雙光子聚合（TPP）微細加工技術(shù)因其在微觀和納米尺度上具有高分辨率的制造能力，在組織工程和藥物輸送方面有很高的價值，其中三維水凝膠的設(shè)計和制備一直是TPP微細加工的一個重要研究領(lǐng)域[29]。

Alexander M等[30]將聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）生物材料進行3D打印制成體內(nèi)生物反應(yīng)器，在不添加外源生長因子或細胞的情況下，生成具有定制幾何形狀的大型自體血管化骨組織，這些組織隨后被成功地進行了外科移植用于修復綿羊下頜骨的大塊缺損，這是3D打印技術(shù)間接成功修復下頜骨缺損的成功應(yīng)用。

近年來逐漸出現(xiàn)了混合3D打印技術(shù)，這可以在一定程度上彌補單一3D打印機的技術(shù)不足[31]，通過多通道打印可以實現(xiàn)天然高分子水凝膠與合成材料的交替打印及濃度梯度打印，克服天然、合成高分子材料共混打印的不足，有望制備出具有良好力學性能和生物活性的結(jié)構(gòu)形狀可控的3D打印復合材料，滿足下頜骨修復支架打印的需求。

四、結(jié)構(gòu)設(shè)計對3D打印支架性能的影響

1.孔隙對成骨效果的影響

天然骨的內(nèi)部為松質(zhì)骨，具有相互貫通的孔隙結(jié)構(gòu)，孔隙是骨組織形成所必需的，它們允許成骨細胞和間充質(zhì)細胞的遷移和增殖，以及血管化[32]。支架的孔隙率和孔徑對骨形成起著至關(guān)重要的作用，從現(xiàn)有的研究來看，孔隙率應(yīng)滿足50%～90%，孔徑在300～500μm之間更有利于骨重建[27，33]。

通過改變打印絲條直徑，角度等參數(shù)可以調(diào)整孔隙結(jié)構(gòu)定量化的研究與力學性能及成骨效果的關(guān)系[34]。Kuboki等[35]使用大鼠異位模型，羥基磷灰石陶瓷作BMP載體誘導骨形成：結(jié)果表明無孔隙結(jié)構(gòu)上沒有新骨形成，而在多孔支架中發(fā)生了直接成骨，證明了骨再生中孔隙的必要性。Hofmann等[11]制備了不同孔徑的絲素支架，并植人HMSC，發(fā)現(xiàn)較小孔徑支架含有更多的表面積以及更多的骨小梁結(jié)構(gòu)，但孔徑較大的支架更有利于細胞的增殖。Akay等[36]研究了成骨細胞在聚羥基異丙基醚聚合物（PHP）中的行為，發(fā)現(xiàn)較大的孔隙促進細胞浸潤的能力超過了較小的孔隙提供的較大的初始細胞附著表面積的有利影響，同時較大的孔徑會促進整個支架的血管生成[37]。高孔隙率的支架在骨組織工程中具有潛在的應(yīng)用前景，但過高孔隙會降低支架的機械強度，影響后期骨形成，用具有高固有機械強度的材料可能是這一問題的一種解決方案[38]。

總之設(shè)計制造多孔結(jié)構(gòu)可提高材料的骨整合能力、提高復雜結(jié)構(gòu)植入體的加工效率、輔助實現(xiàn)高難度設(shè)計和高制造精度，對骨修復體制備是至關(guān)重要的。

2.三維結(jié)構(gòu)對力學性能的影響

三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)不僅可以模擬天然骨的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，為細胞和血管長入及營養(yǎng)物質(zhì)代謝提供空間，還可以改善植入生物材料和周圍天然骨之間的機械聯(lián)鎖，提高其機械穩(wěn)定性，已成為骨組織工程支架的基本結(jié)構(gòu)[39]。隨著打印工藝的進步，3D打印不僅可以個性化恢復下頜骨的外形，還可以通過調(diào)整支架的結(jié)構(gòu)設(shè)計，改變其力學性能，以最大限度地實現(xiàn)功能重建[40]。

通過3D打印技術(shù)，支架的內(nèi)外結(jié)構(gòu)，包括孔形狀、孔隙率和互連性，可以被嚴格控制，以實現(xiàn)高度的結(jié)構(gòu)復雜性、靈活性和患者特定的需求[41]。劉云峰[42]提出了一種基于組織工程的人體下頜骨缺損修復支架數(shù)字模型生成方法。采用基于三角網(wǎng)格的數(shù)字化設(shè)計方法進行缺損區(qū)域建模和計算，實現(xiàn)缺損區(qū)的原始形狀再現(xiàn)和支架設(shè)計和制作的微觀結(jié)構(gòu)可控。高慧[43]等制備了不同構(gòu)型和不同支柱直徑的修復體，應(yīng)用有限元分析和骨“力矩”理論進行優(yōu)化測試，結(jié)果表明結(jié)構(gòu)形式與荷載傳遞能力之間有很強的相關(guān)性。Hui Mei等[34]研究了不同打印角度的復合材料力學性能，證實[0°、45°、90°]的打印角度表現(xiàn)出最高的拉伸強度和模量。有研究表明滲透性也是顯著影響組織再生和存活的關(guān)鍵，有必要將徑向滲透率作為支架孔結(jié)構(gòu)設(shè)計的一種更現(xiàn)實的計算工具[44]。

有限元分析法自上世紀50年代誕生以來，已廣泛應(yīng)用于人體骨組織生物力學的研究，用有限元力學分析軟件對下頜骨進行生物力學分析，并根據(jù)生物力學分析結(jié)果進行網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的優(yōu)化制備梯度結(jié)構(gòu)，是提升下頜骨缺損修復效果的有效途徑[45]?？傊?D打印技術(shù)正在快速進步，其在開發(fā)具有可控孔徑、梯度孔結(jié)構(gòu)以優(yōu)化組織再生的生物支架方面有很大應(yīng)用潛力。

五、結(jié)論和展望

受目前制作工藝水平的限制，高精度的仿生設(shè)計還難以完全實現(xiàn)，且材料的安全性，在人體內(nèi)降解代謝水平還未充分證明。用于下頜骨修復的骨支架仍處于基礎(chǔ)研究水平，對生物材料、打印技術(shù)、仿生力學、計算機技術(shù)等方面都需要進一步探索，距應(yīng)用于臨床工作中還有較遠距離?？傊?，3D打印技術(shù)及骨組織工程支架是一個正在快速發(fā)展的研究領(lǐng)域，未來將出現(xiàn)更多新型快速成型技術(shù)和生物打印材料，微觀結(jié)構(gòu)也將得到進一步優(yōu)化，這一切使得3D打印技術(shù)在下頜骨缺損重建中有著廣闊的應(yīng)用前景和可能性。最終，這些3D打印的骨組織工程支架會成為給那些患有下頜骨缺損的病人提供改善生活質(zhì)量機會的關(guān)鍵。