代謝組學在急性冠狀動脈綜合征早期診斷和危險分層中的應用

李菲，袁健瑛，李東澤，廖曉陽，曹鈺，萬智

(1.四川大學華西醫(yī)院 a.急診科 急診醫(yī)學研究室 國家老年疾病臨床研究醫(yī)學中心，b.全科醫(yī)學中心，成都 610041；2.四川大學 a.災難醫(yī)學中心，b.卒中中心，c.護理學院急救與創(chuàng)傷護理學教研室，成都 610041)

近年來，世界范圍內(nèi)的心血管疾病發(fā)病率逐年升高，已成為最常見的死亡原因。《中國心血管病報告2018》指出，心血管疾病所致死亡是我國居民死亡的首要原因，預計我國現(xiàn)有心血管疾病患者2.9億，其中冠心病1 100萬[1]。急性冠狀動脈綜合征(acute coronary syndrome，ACS)是冠心病的常見類型，每年發(fā)病人數(shù)超過100萬，其發(fā)病率隨年齡增大而升高，可導致嚴重的疾病負擔[2]。ACS常表現(xiàn)為總膽固醇和三酰甘油水平升高、高密度脂蛋白水平降低。ACS發(fā)病與動脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂有關(guān)，在動脈粥樣硬化斑塊的形成過程中，大多數(shù)患者無臨床癥狀，常出現(xiàn)隱匿組織損傷。因此，早期診斷ACS十分必要，可以有效預防動脈粥樣硬化斑塊的形成和破裂，改善患者預后。

ACS的常見危險因素包括糖尿病、吸煙、高血壓、高脂血癥等，根據(jù)上述危險因素評估ACS是常見策略，但缺乏特異性，且確切病理生理機制仍不清楚[3]。目前，ACS的臨床診斷主要依靠臨床癥狀、心電圖、心肌標志物和冠狀動脈造影，其中冠狀動脈造影是診斷ACS的金標準，然而冠狀動脈造影為有創(chuàng)檢查，對技術(shù)要求較高，檢查費用昂貴，且大量接受檢查的患者血管正常[4-5]。在動脈粥樣硬化斑塊形成和破裂前，其表達的特異性小分子生物標志物具有巨大的疾病診斷價值，可以實現(xiàn)疾病的早期診斷和危險分層。代謝組學是生物系統(tǒng)中迅速發(fā)展的研究領(lǐng)域，可以識別及量化細胞、器官或生物體內(nèi)分子量<1 500的小分子代謝物，有助于識別有診療價值的生物標志物，指導臨床決策干預[6]?，F(xiàn)對ACS發(fā)病涉及的病理生理機制進行初步回顧，并對代謝組學在ACS早期診斷和危險分層中的應用予以綜述。

1 ACS的病理生理及分子機制

1.1ACS與動脈粥樣硬化斑塊 動脈粥樣硬化形成的實驗模型為斑塊形成的分子機制提供了大量信息。由于缺乏反映人類疾病的動物模型，從穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊到不穩(wěn)定的動脈粥樣硬化斑塊的病理生理變化過程仍不十分清楚。臨床上，動脈粥樣硬化斑塊的形成和進展可隱匿數(shù)年、數(shù)十年甚至終生，而動脈粥樣硬化斑塊破裂往往無癥狀，可逐漸演變成突然的急性冠狀動脈事件，表明導致動脈粥樣硬化斑塊發(fā)展和不穩(wěn)定的機制可能不同，事實上，動脈粥樣硬化斑塊的形成一般無癥狀，并逐漸發(fā)展為突然的冠狀動脈阻塞。

ACS是最常見的心血管疾病，通常由動脈粥樣硬化斑塊破裂或侵蝕而加速形成。有學者認為，動脈粥樣硬化斑塊形成通常是動脈壁膽固醇、巨噬細胞和纖維蛋白組織多年積累的結(jié)果[7]。因此，一般在進入疾病晚期時，患者的癥狀才會出現(xiàn)。動脈粥樣硬化斑塊的形成與高膽固醇血癥、高血壓、糖尿病、吸煙以及心理因素等危險因素導致的血管內(nèi)皮功能受損有關(guān)[8-9]。心肌壞死標志物，特別是肌鈣蛋白I和T在ACS的診斷、危險分層和治療中起著重要作用[3,10]。然而，高敏肌鈣蛋白在ACS發(fā)病3～4 h升高，早期評估價值有限，高敏肌鈣蛋白連續(xù)檢測低于5 ng/L時，可排除ACS，其陰性預測價值較高，但陽性預測價值較低[11]。因此，有必要尋找新的特異性生物標志物對ACS進行早期診斷和風險評估，以指導臨床決策。

1.2ACS的分子機制 ACS的發(fā)病機制目前尚不完全清楚，可能與糖尿病、高血壓、高脂血癥和吸煙等危險因素損傷血管內(nèi)皮，導致內(nèi)皮功能異常有關(guān)。血管內(nèi)皮受損的特征是血管內(nèi)皮一氧化氮生物利用度降低和內(nèi)皮素-1產(chǎn)生增加，導致血管止血功能異常，黏附分子表達增加。此外，還可以增加血小板的產(chǎn)生，并通過分泌局部活性底物激活血液中的血小板，進而促進微血栓形成[12]。

動脈粥樣硬化斑塊的進展與內(nèi)皮細胞內(nèi)低密度脂蛋白(low-density lipoprotein，LDL)向動脈壁的運輸有關(guān)[12]。內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞和巨噬細胞等通過活性氧類將LDL轉(zhuǎn)化為氧化低密度脂蛋白(oxidized low-density lipoprotein，ox-LDL)，而ox-LDL可損傷內(nèi)皮細胞，誘導P-選擇素等黏附分子和單核細胞趨化蛋白-1、巨噬細胞集落刺激因子等趨化因子的表達，導致單核細胞和T淋巴細胞活化并進入內(nèi)膜[13]。單核細胞和T淋巴細胞進入內(nèi)膜，隨后單核細胞消化脂蛋白并分化為巨噬細胞。樹突狀細胞是一種抗原呈遞細胞，能夠激活輔助性T細胞產(chǎn)生γ干擾素，從而激活巨噬細胞。巨噬細胞產(chǎn)生的活性氧類將ox-LDL轉(zhuǎn)化為高氧化低密度脂蛋白，并被巨噬細胞吸收轉(zhuǎn)化為泡沫細胞，隨后泡沫細胞與白細胞結(jié)合形成脂肪條紋。隨著單核細胞和巨噬細胞的增多，血管平滑肌細胞的增殖或遷移會產(chǎn)生脂肪條紋，導致更嚴重的血管損傷，最終表現(xiàn)為突向動脈腔內(nèi)[14]。隨后脂肪條紋發(fā)生鈣化，并隨著纖維化的進展形成圍繞富含脂質(zhì)核心的纖維帽，一般認為，纖維帽厚度<55 μm是導致致命斑塊破裂的形態(tài)學指標[15]。在ACS纖維斑塊破裂時，動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)物質(zhì)的形成和釋放會導致血栓，并最終導致血管阻塞[16]。

1.3炎癥、膠原合成、斑塊破裂和血栓形成 巨噬細胞能夠產(chǎn)生3種消化細胞外基質(zhì)的基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMP)(MMP-1、MMP-8和MMP-13)，導致斑塊破裂。人巨噬細胞對MMP的調(diào)節(jié)表明，T細胞來源的CD40配體增加了人巨噬細胞間質(zhì)膠原酶的產(chǎn)生[17]。因此，獲得性免疫T細胞和巨噬細胞之間的相互作用阻止了間質(zhì)膠原的合成和降解。平滑肌細胞和巨噬細胞的比例在動脈粥樣硬化斑塊易損性和破裂傾向中起著重要作用，但大多數(shù)動脈粥樣硬化斑塊的破裂是可變、不可預測的[18]。研究表明，ACS引起全身炎癥反應，導致斑塊部位蛋白酶活性增加，進而加重炎癥反應[19]。

動脈粥樣硬化斑塊纖維帽在ACS中起重要作用，現(xiàn)已成為研究的焦點。動脈粥樣硬化斑塊纖維帽變薄與致命斑塊破裂相關(guān)，動脈粥樣硬化斑塊的膠原蛋白代謝缺陷在細胞外基質(zhì)蛋白排泄以及纖維帽形成及促進中起重要作用[20]，表明膠原代謝介質(zhì)可能參與了動脈粥樣硬化斑塊的形成過程，且動脈粥樣硬化斑塊內(nèi)膠原的斷裂可能損害了斑塊的完整性，最終導致ACS的發(fā)生。

2 代謝組學簡介及其在ACS中的應用

2.1代謝組學簡介 代謝組學是生物化學領(lǐng)域的新興學科，涉及基因組學、轉(zhuǎn)錄組學和蛋白組學，能夠?qū)毎?、器官及有機體內(nèi)的小分子代謝物進行識別、量化和表征，可用于輔助疾病的診療，因此代謝組學被廣泛應用于藥理學、臨床試驗、毒理學、新生兒篩查和臨床化學等領(lǐng)域[21]。心臟的代謝變化是生物體液中各代謝產(chǎn)物動態(tài)變化的過程，基于代謝組學技術(shù)可以用于分析ACS中生物標志物的表達水平[22-23]。與傳統(tǒng)實驗室檢查技術(shù)相比，代謝組學可同時檢測大量的代謝物，并能夠廣泛覆蓋生物過程和代謝途徑[24]。由于代謝組學與生物體基因型密切相關(guān)，故可以較為清晰地觀察基因型-表型和基因型-環(huán)境之間的相互作用關(guān)系。

代謝組分析策略通常借助質(zhì)子核磁共振(nuclear magnetic resonance，NMR)和質(zhì)譜(mass spectrum,MS)結(jié)合分離技術(shù)(如高效液相色譜、氣相色譜或毛細管電泳)實現(xiàn)[25-26]。NMR是分析尿液和血漿樣本的常用技術(shù)之一[27]，其原理為利用代謝混合物質(zhì)量的不同，通過磁共振位移將樣品中的單個分析物分離，從而產(chǎn)生光譜圖譜。NMR可以提供復雜混合物中代謝物的結(jié)構(gòu)信息和定量測定，且通常不需要化學加工制備樣品，可重復性高。與MS相比，NMR相對不敏感，只可以檢測毫米級和微米級的代謝物。

氣相色譜-質(zhì)譜(gas chromatography-MS，GC-MS)和液相色譜-質(zhì)譜(liquid chromatography-MS，LC-MS)是目前鑒定小分子代謝物最常用的技術(shù)，MS測量分子形成離子的質(zhì)量與電荷之比，通常用色譜技術(shù)將其分離，可測量任何可溶解的化合物。MS的靈敏度較核磁共振更高，因此越來越多地用于生物樣品代謝物的測定[28]。GC-MS主要用于揮發(fā)性非極性代謝物的分析，樣品在檢測時蒸發(fā)到氣相中，并通過GC色譜柱進行傳輸，要求分析物在高溫下保持穩(wěn)定，適用GC-MS的代謝物包括糖、糖醇、脂肪酸、有機酸、甾體和二甘油酯等。對于不揮發(fā)且不能衍生的代謝物，使用可選擇性分離的液相色譜技術(shù)。LC-MS可以分析多種化學物質(zhì)(極性和非極性代謝物)，具有很高的選擇性和靈敏度。與LC-MS類似，毛細管電泳可以與質(zhì)譜儀耦合，具有提高分離分辨率的獨特優(yōu)勢[29]。

通常確定代謝譜的方法有靶向和非靶向。靶向分析通常以“模塊化”形式進行，針對感興趣的分析物簇的化學性質(zhì)進行定向檢測，結(jié)果更為精確，檢測到的分析物通常只有數(shù)百種。非靶向代謝圖譜能同時測量生物樣品中大量的潛在代謝物或分析物，提供更真實的代謝組覆蓋范圍，但干擾更大，且耗時費財。因此，可以通過非靶向分析來產(chǎn)生新的假說，或在前期或其他研究的基礎(chǔ)上確定新的代謝途徑或候選生物標志物，進行針對性的檢測，提高實驗效率。

2.2代謝組學在ACS中的應用 心臟能量代謝在調(diào)節(jié)心臟功能中起著重要作用，在ACS的發(fā)生發(fā)展中，諸多代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生、調(diào)節(jié)、失衡可以提供重要的疾病信息[21,30]，尤其在無癥狀的ACS發(fā)病早期，因此借助代謝組學的技術(shù)有助于實現(xiàn)ACS的早期診斷和危險分層，便于早期干預，改善ACS患者的預后。潛在的候選生物標志物可能對無癥狀ACS患者的早期診斷和危險分層有幫助，故需要加速發(fā)現(xiàn)新的疾病特異性生物標志物、藥動學以及與疾病危險因素相關(guān)的代謝譜。

有學者采用NMR技術(shù)研究了心房顫動患者的代謝變化，以定量分析選定24種代謝物，結(jié)果顯示心房顫動患者與正常體檢健康人群的β-羥丁酸、酮體和甘氨酸水平比較差異有統(tǒng)計學意義，表明代謝譜中的酮體能夠識別超過80%的心房顫動風險患者[31]。有研究對35例非ST段抬高型ACS患者和35名健康受試者進行GC-MS和LC-MS/MS分析確定了非ST段抬高型ACS患者和健康受試者中的68種代謝物，包括丙氨酸、2-羥基丁酸和2-酮-3-甲基戊酸等[32]。使用LC-MS技術(shù)分析1 010例心臟病患者血漿的研究顯示，精氨酸及其下游代謝物與主要不良心血管事件發(fā)生存在密切聯(lián)系[33]。有學者對9例非ST段抬高型ACS患者進行代謝研究，并將其與10例穩(wěn)定動脈粥樣硬化患者和10名健康受試者進行比較發(fā)現(xiàn)，與健康受試者相比，非ST段抬高型ACS患者的代謝物(如檸檬酸、4-羥脯氨酸、天冬氨酸和果糖)水平降低，而乳酸、尿素、葡萄糖和纈氨酸的水平增加[34]。

分析27例不穩(wěn)定型心絞痛(unstable angina pectoris，UAP)和15例健康受試者的代謝圖譜研究鑒定了共91種代謝物，最終篩選出5種能夠識別UAP的代謝物，預測精準度為80%，包括D-呋喃糖、1-脫氧葡萄糖、棕櫚酸、硬脂酸和4(1H)-吡啶酮[35]。Zhao等[36]在動物模型以及UAP患者血漿中鑒定出21種代謝物，這些代謝物的表達水平與對照者差異有統(tǒng)計學意義，其中8種代謝物在心肌梗死豬標本和UAP患者中共存，包括4,1-苯二羧酸、5,1-n-羥基膠質(zhì)細胞醇、2-酮-去葡萄糖酸、壬二酸、庚酸、戊酸、核糖醇和絲氨酸。因此，這些代謝物可能是豬與UAP患者心肌梗死分子機制中的共同物質(zhì)，但需要更多研究的證實。

Li等[37]分析比較27例UAP患者以及20名健康受試者的尿樣，確定了20種可用于區(qū)分UAP的代謝物，包括肌酐、順式-烏頭酸、瓜氨酸等，表明通過代謝物的組合能夠預測UAP，靈敏度為92.6%，特異度為90%，準確度為89.1%。另有研究顯示，UAP患者體內(nèi)的乳酸、肌醇、脂質(zhì)、3-羥丁酸等水平上調(diào)，而蘇氨酸、肌酸、膽固醇和谷氨酸等水平降低，故推測UAP患者的磷脂和氨基酸代謝可能受損[38]。肌酐來自肌酸和磷酸肌酸，磷酸原系統(tǒng)對細胞能量轉(zhuǎn)移和身體穩(wěn)態(tài)非常重要，正常情況下，大多數(shù)肌酸分子被轉(zhuǎn)化成磷酸肌酸，最終通過可逆酶促反應產(chǎn)生ATP[39]。UAP患者的尿肌酐水平降低，表明這些患者不能產(chǎn)生ATP，因此需要更多的肌酸來產(chǎn)生ATP[40]，這可能是UAP患者體內(nèi)各代謝產(chǎn)物產(chǎn)生動態(tài)變化的原因。

3小 結(jié)

生物體液的代謝組學是表征心血管疾病相關(guān)代謝紊亂的有效方法，小分子代謝物的表達差異可能反映潛在的ACS疾病進展，并作為生物標志物確定病理生理機制和治療靶點。代謝組學有助于篩選ACS的早期診斷和危險分層的特異性生物標志物，但仍需要進一步對動脈粥樣硬化斑塊的發(fā)展和不穩(wěn)定性進行研究，以確定其結(jié)果的準確性和敏感性。未來的前瞻性研究有助于實現(xiàn)整合組學數(shù)據(jù)向臨床實踐的轉(zhuǎn)化，從而更好地服務于臨床ACS的診斷和管理，提高疾病的診治水平。