弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)在微生物感染宿主中的作用

高明燕 姜 逸 程 旭 俞 燕 范建華 孟 闖

1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院家禽研究所，江蘇揚(yáng)州 225125；2.江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/江蘇省高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇揚(yáng)州 225009

弗林蛋白酶（Furin）裂解位點(diǎn)廣泛存在于微生物前體蛋白中，如綠膿桿菌外毒素A、白喉毒素和炭疽毒素等細(xì)菌外毒素以及人免疫缺陷綜合征病毒、埃博拉病毒、麻疹病毒、乙肝病毒、流感病毒等很多病毒的囊膜糖蛋白。這些病原前體蛋白需要宿主細(xì)胞中的Furin 裂解成成熟蛋白才能在感染宿主的進(jìn)程中進(jìn)一步發(fā)揮作用。微生物前體蛋白上Furin 裂解位點(diǎn)的作用關(guān)鍵而重要，故本文將從Furin裂解位點(diǎn)的特點(diǎn)、病毒囊膜蛋白Furin裂解位點(diǎn)與病原感染宿主過(guò)程中毒力、宿主和細(xì)胞嗜性的相關(guān)性及其對(duì)微生物傳播效率和規(guī)模的影響等方面進(jìn)行詳細(xì)綜述。

1 弗林蛋白酶及其裂解位點(diǎn)特點(diǎn)

Furin 是真核動(dòng)物體內(nèi)一種高度特異性的絲氨酸內(nèi)切蛋白酶，屬于前體蛋白轉(zhuǎn)化酶家族，能識(shí)別切割前體蛋白進(jìn)而激活其活性。其廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中，主要定位于細(xì)胞高爾基體反面膜囊上。它作用的底物不僅包括宿主肽類激素和神經(jīng)肽、生長(zhǎng)因子、血清蛋白、基質(zhì)金屬蛋白酶、受體等，還包括細(xì)菌外毒素和很多囊膜病毒的糖蛋白[1]。

Furin 能識(shí)別切割的最短序列特點(diǎn)是R-X-XR↓；其核心序列包括8 個(gè)氨基酸，順序?yàn)镻6-P5-P3-P4-P3-P2-P1↓P1’P2’。裂解位點(diǎn)P1 和P4 位必須為R(精氨酸，Arg)；X 為任意氨基酸；若P2位為堿性的K（賴氨酸，Lys）或R 時(shí)，其切割效率能提高10 倍左右；此外P4 位不是R 時(shí)，P1 位必須是R，P2和P6 位是堿性氨基酸才能保證切割效率[2-3]。P2’位常可找到脂肪族氨基酸V（纈氨酸，Val）和I（異亮氨酸，Ile）。研究發(fā)現(xiàn)Furin 底物中裂解位點(diǎn)類型統(tǒng)計(jì)百分比：R-X-R–R↓為41%，R-X- K–R↓占31.5%，R-X-X-R ↓為11%，其他特殊位點(diǎn)占16.4%[4]。前體蛋白Furin 裂解位點(diǎn)可以在the ProP server上進(jìn)行預(yù)測(cè)評(píng)分。

2 弗林蛋白酶裂解位點(diǎn)在微生物感染宿主中的作用

微生物前體蛋白上的Furin 裂解位點(diǎn)主要作用是被宿主Furin 識(shí)別并裂解活化，從而使病原微生物進(jìn)入細(xì)胞并發(fā)揮致病作用，但不同微生物中Furin裂解位點(diǎn)的作用和影響并不完全相同。宿主Furin參與識(shí)別切割HIV-1 囊膜糖蛋白gp160 的裂解位點(diǎn)；而Furin 抑制劑可以抑制gp160 裂解成gp41 和gp120，從而阻止HIV-1的感染[5]。

禽流感病毒（avian influenza virus，AIV）血凝素HA 和新城疫病毒（newcastledisease virus，NDV）融合蛋白F Furin 酶切位點(diǎn)不僅能夠被宿主細(xì)胞識(shí)別切割，還與病毒毒力高度相關(guān)。H5 和H7 高致病性AIV HA 切割位點(diǎn)上游均含有多個(gè)堿性氨基酸，其最小結(jié)構(gòu)正是Furin 識(shí)別的R-K-K-R↓；而低致病性AIV HA 裂解位點(diǎn)上游只有一個(gè)堿性氨基酸R[6-7]，只能被部分組織中的堿性蛋白酶切割，從而影響病毒毒力。NDV 典型強(qiáng)毒株融合蛋白F 的裂解位點(diǎn)也存在多個(gè)堿性氨基酸R/KRQR/KR↓，而所有弱毒株F 蛋白位點(diǎn)具有共性的序列RQGR↓，它符合Furin 底物特性，但其酶切效率可能較低，從而影響了病毒的毒力[8]。

在病毒組裝過(guò)程中，由于部分β 屬和所有γ 屬冠狀病毒S蛋白上存在Furin 裂解位點(diǎn)，因此能被宿主細(xì)胞高爾基體Furin 識(shí)別裂解為S1/S2。此外，MERS-Cov、SARS-Cov2 和IBV 等冠狀病毒S 蛋白Furin 裂解位點(diǎn)變異和宿主與細(xì)胞嗜性相關(guān)。Yang等[9]發(fā)現(xiàn)MERS-Cov S 蛋白在748 位存在Furin 酶切位點(diǎn)（RSVR），而從蝙蝠上分離的與其同源性最高的HKU-4 S 蛋白缺失相應(yīng)的酶切位點(diǎn)；人為引入突變S746位R 構(gòu)成相應(yīng)位置的酶切位點(diǎn)后，在無(wú)外源蛋白酶作用下H-Cov-HKU4 假病毒可以感染人體細(xì)胞；同時(shí)將MERS-Cov的Furin酶切位點(diǎn)突變替換成H-Cov-HKU4 S 蛋白相應(yīng)的氨基酸后，MERSCov 的S 蛋白則完全失去活性。同樣有研究發(fā)現(xiàn)，SARS-Cov2 S 蛋白上Furin 酶切位點(diǎn)PRRAR↓的引入可能成為其跨宿主傳播的關(guān)鍵因素[10]。Yamada等[11]研究發(fā)現(xiàn)，IBV Beaudette vero 細(xì)胞適應(yīng)株在S1/S2 之間Furin 裂解位點(diǎn)RRFRR↓下游產(chǎn)生了第2 個(gè)Furin 裂解位點(diǎn)HRRR↓；將S1/S2 之間的Furin 酶切位點(diǎn)缺失和突變?yōu)锳AFAA 后，S1/S2 不能裂解，但病毒仍然能夠在Vero 細(xì)胞中增殖并形成合胞體，細(xì)胞適應(yīng)株產(chǎn)生的第2 個(gè)Furin 裂解位點(diǎn)可能與病毒適應(yīng)Vero 細(xì)胞從而發(fā)生變異有關(guān)；目前雞體天然分離IBV毒株不存在第二個(gè)Furin酶切位點(diǎn)，一般也不能在Vero細(xì)胞上生長(zhǎng)。

Furin 裂解位點(diǎn)類型可能是病毒傳播效率和規(guī)模影響因素之一。筆者通過(guò)對(duì)GenBank 中國(guó)內(nèi)外400多個(gè)IBV 毒株S 蛋白的Furin 裂解位點(diǎn)統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)：IBV 的裂解位點(diǎn)類型有40 多種；但分離數(shù)量多，流行規(guī)模大的優(yōu)勢(shì)毒株裂解位點(diǎn)主要有3個(gè)，包括RRFRR↓、RRSRR↓和HRRRR↓；而且這幾種裂解位點(diǎn)類型符合Furin高效的切割規(guī)律。

3 總結(jié)與展望

雖然現(xiàn)有研究已經(jīng)明確了部分病原Furin 裂解位點(diǎn)在微生物感染宿主的過(guò)程中的作用，如參與囊膜糖蛋白的裂解活化和病毒宿主膜融合、影響病毒毒力和跨宿主傳播等。但不同病毒囊膜蛋白Furin裂解位點(diǎn)的作用和功能不完全相同，如AIV HA 蛋白和ND F蛋白與毒力相關(guān)，但I(xiàn)BV強(qiáng)毒分離株雞胚傳代致弱后，其S蛋白裂解位點(diǎn)類型沒(méi)有發(fā)生變化，IBV 毒力與其S 蛋白裂解位點(diǎn)類型關(guān)系以及其他作用并沒(méi)有明確。這有待于進(jìn)一步深入研究，從而為揭示IBV 以及其他病毒入侵宿主細(xì)胞的致病機(jī)制、研制相應(yīng)的阻斷藥物奠定基礎(chǔ)[12]。