結(jié)核分枝桿菌分子診斷方法研究進展

歐洋華，江詠梅

(四川大學華西第二醫(yī)院檢驗科 出生缺陷與相關(guān)婦兒疾病教育部重點實驗室，成都 610041)

結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis，MTB)于1882年由Robert Koch首次提出并認定為結(jié)核病的病因[1]。結(jié)核病是21世紀最重要的公共衛(wèi)生問題之一，居全球感染性疾病病死率之首[2]。世界衛(wèi)生組織報告顯示，2019年全球新發(fā)結(jié)核病1 000萬例，新增患者中約50萬例對利福平(rifampin，RIF)耐藥，其中78%為耐多藥結(jié)核病[3]。早診斷、早隔離、早治療是減少肺結(jié)核發(fā)病和死亡的關(guān)鍵。然而，兒童結(jié)核病由于臨床表現(xiàn)不典型，標本獲取困難，60%～70%的患兒無法通過傳統(tǒng)實驗室檢查得到病原學確診[4]。此外，潛伏期結(jié)核、亞臨床結(jié)核、肺外結(jié)核、獲得性免疫缺陷綜合征并發(fā)結(jié)核也是臨床診斷的重點和難點。值得警惕的是，診斷滯后可能導致個體化治療的延誤、MTB的傳播和耐藥菌株的產(chǎn)生。因此，尋找快速、高效、準確的診斷方法對結(jié)核病尤其是耐藥結(jié)核病的早期發(fā)現(xiàn)至關(guān)重要。目前，結(jié)核病的病原學診斷金標準為痰涂片抗酸染色、MTB培養(yǎng)和藥敏試驗，但因MTB生長緩慢，以上檢查存在鏡檢陽性率低、操作繁瑣、培養(yǎng)周期長、特異度差等缺點。近年來，分子生物學診斷技術(shù)的快速發(fā)展有望解決這一難題，包括實時熒光聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)、環(huán)介導恒溫擴增(loop-mediated isothermal amplification，LAMP)、線性探針(line probe assay，LPA)和全基因組測序(whole-genome sequencing，WGS)等，其優(yōu)勢在于檢測周期更短、特異度和生物安全性更高[5]。目前，正在進行臨床前研發(fā)的診斷結(jié)核分子的新技術(shù)已超過50種[6]。現(xiàn)就MTB分子診斷方法研究進展予以綜述。

1 實時熒光PCR技術(shù)

2010年，美國Cepheid公司研發(fā)推出的MTB/RIF耐藥實時熒光定量核酸擴增技術(shù)(Xpert MTB/RIF)是以MTB rpoB基因為靶基因，實現(xiàn)全自動DNA提取和擴增，同時檢測MTB及RIF的耐藥性，報告周期僅為2 h，可用于滅活或未滅活的呼吸道樣品、腦脊液、胸腹水、尿液等，具有特異度高、靈敏度高、簡便快速、安全性好等優(yōu)點[7]。2011年，世界衛(wèi)生組織(World Health Organization，WHO)推薦將Xpert MTB/RIF用于耐多藥結(jié)核及獲得性免疫缺陷綜合征并發(fā)結(jié)核的早期檢測，對于非耐藥高風險人群及未合并獲得性免疫缺陷綜合征的患者，Xpert MTB/RIF可作為涂片或胸部X線檢查之外的輔助檢測[8]。2013 年，WHO進一步擴展了Xpert MTB/RIF的適用范圍，推薦其替代涂片、培養(yǎng)等技術(shù)用于肺外結(jié)核的快速診斷[9]。

2018年，Cochrane更新了關(guān)于 Xpert MTB/RIF檢測肺外結(jié)核的系統(tǒng)評價。以細菌培養(yǎng)為金標準，Xpert MTB/RIF在不同類型肺外標本中的靈敏度存在差異(如在胸膜組織可達31%，在骨關(guān)節(jié)液可達97%)，且其特異度的變化小于靈敏度的變化，在腦脊液、胸膜液、尿液和腹膜液中，Xpert MTB/RIF特異度≥98%[10]。說明Xpert MTB/RIF的檢測結(jié)果易受樣本類型和量的影響。2019年，Cochrane更新了關(guān)于Xpert MTB/RIF診斷肺結(jié)核和RIF耐藥的系統(tǒng)評價，該方法檢測肺結(jié)核和RIF耐藥的靈敏度分別為85%和96%，特異度均為98%，對涂片陽性和陰性結(jié)核病的靈敏度分別為98%和67%，在合并人類免疫缺陷病毒(human immunodeficiency virus,HIV)感染和未合并HIV感染的患者中靈敏度分別為88%和81%，提示Xpert MTB/RIF對含菌量低標本和獲得性免疫缺陷綜合征患者的靈敏度較低[11]。對于兒童肺結(jié)核，2020年Cochrane系統(tǒng)評價顯示，Xpert MTB/RIF對胃液標本的靈敏度最高(73%)，其次為痰液(64.6%)和糞便(61.5%)，鼻咽標本的靈敏度最低(45.7%)，所有標本特異度均>98%[12]，提示Xpert MTB/RIF在兒童肺結(jié)核中具有較好的診斷價值。

為克服Xpert MTB/RIF的缺點，新一代Xpert MTB/RIF Ultra增加了兩種MTB檢測分子靶標(IS1081和IS6110)以提高檢測靈敏度，擴大了DNA擴增室以提高樣本容納量，將MTB的菌株檢測下限從112.6 CFU/mL降低至15.6 CFU/mL，大大提高了檢測效率[12]。同時改進了對沉默突變的解讀，減少了混合感染和含菌量低標本中RIF耐藥檢測的假陽性結(jié)果，因此靈敏度較第一代Xpert MTB/RIF更高，但特異度下降[13]。Dorman等[14]的一項多中心研究結(jié)果顯示，在肺結(jié)核的診斷中，Xpert MTB/RIF Ultra和Xpert MTB/RIF的總體靈敏度分別為88%和83%，特異度分別為96%和98%，其中Xpert MTB/RIF Ultra在涂片陰性結(jié)核患者和HIV陽性結(jié)核患者中的靈敏度更高。同樣，在肺外結(jié)核的診斷中，與Xpert MTB/RIF相比，Xpert MTB/RIF Ultra的總體靈敏度更高，特異度更低[15]，提示Xpert MTB/RIF Ultra在標本含菌量低、獲得性免疫缺陷綜合征并發(fā)結(jié)核和肺外結(jié)核患者中的靈敏度優(yōu)于Xpert MTB/RIF，但由于特異度降低，當核酸檢測結(jié)果為弱陽性時應結(jié)合臨床特點進行具體分析。而Xpert試劑盒的擴展版本——廣泛耐藥結(jié)核實時熒光定量核酸擴增檢測技術(shù)可同時擴增8個MTB相關(guān)基因和啟動子，檢測對異煙肼、氟喹諾酮、乙硫異煙胺和二線注射藥物的耐藥性，檢測時間縮短為90 min。與第一代測序技術(shù)相比，該方法對除乙硫異煙胺外藥物耐藥性的檢測靈敏度為94%～100%，特異度為100%[16]。

此外，還有其他商業(yè)化的檢測試劑盒，包括RealTime MTB (Abbott，美國)[17]、BD MAX MDR-TB (Beckton,Dickinson and Company，美國)[18]和FluoroType MTBDR (Hain Lifescience，德國)[19]等，對結(jié)核診斷和RIF耐藥的檢驗效能與Xpert MTB/RIF一致，但缺乏大規(guī)模研究數(shù)據(jù)，尚未得到廣泛應用。

2 恒溫擴增技術(shù)

恒溫擴增技術(shù)不依賴于熱循環(huán)擴增設(shè)備，僅需在恒定溫度下完成擴增，反應迅速，靈敏度高但特異度相對較低。

2.1LAMP 日本東京Eiken Chemical公司開發(fā)了一種基于LAMP的MTB定性檢測試劑盒，包括樣品制備、LAMP擴增和反應管紫外熒光的目視檢測 3個步驟，可在90 min內(nèi)快速檢出MTB[20]，具有特異度高、成本較低、操作簡便、安全性好等優(yōu)點。一項Meta分析顯示，LAMP對肺結(jié)核診斷的靈敏度為89.6%，特異度為94%[21]。此外，LAMP對涂片陽性標本的靈敏度高于涂片陰性標本(分別為92.0%和58.8%)[22]。

對肺外結(jié)核樣本LAMP診斷性能的Meta分析顯示，與復合參考標準相比，以MPT64為檢測靶標的LAMP靈敏度、特異度分別為86%和100%，以IS6110為檢測靶標的分別為75%和99%，提示LAMP在檢測肺外結(jié)核方面具有良好的診斷效果，且MPT64 LAMP的診斷效果優(yōu)于IS6110 LAMP[23]。Dayal等[24]研究了LAMP在兒童肺結(jié)核中的診斷性能，將痰培養(yǎng)作為金標準，結(jié)果顯示MPT64 LAMP和IS6110 LAMP的靈敏度分別為94.9%和89.8%，說明LAMP在兒童肺結(jié)核中是有效的診斷方法。因此，WHO于2016年推薦LAMP替代痰涂片鏡檢用于結(jié)核病的診斷[25]。

2.2交叉引物擴增技術(shù)(crossing priming amplification，CPA) 中國杭州優(yōu)星生物科技股份有限公司開發(fā)的EasyNAT TB診斷試劑盒是采用CPA對MTB進行定性檢測[26]，2014年被國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準用于檢測結(jié)核病。以MTB培養(yǎng)為金標準，國內(nèi)研究報道CPA檢測MTB的靈敏度為84.1%～85.5%，特異度為96.8%～97.8%[27-28]。國外研究報道其靈敏度和特異度分別為66.7%和100%，其中對于痰涂片陰性標本的檢測靈敏度較低[29]。Bholla等[30]評價了EasyNATTMTB試劑盒診斷兒童肺外結(jié)核(結(jié)核性淋巴結(jié)炎)的性能，結(jié)果顯示其靈敏度和特異度分別為19%和100%，故認為EasyNAT不適用于肺外結(jié)核的診斷。

2.3實時熒光核酸恒溫擴增檢測技術(shù)(simultaneous amplification and testing,SAT) SAT以MTB特異的16S核糖體RNA為靶點，采用閉管法結(jié)合實時熒光檢測，可有效控制氣溶膠污染，且操作簡單，對儀器的要求較低，檢測結(jié)果穩(wěn)定[31]。由于RNA只在活菌中存在，相比其他以DNA為檢測靶標的技術(shù)，SAT可用于檢測疾病活動性、監(jiān)測用藥療效和判斷治愈程度[32]。Deng等[33]評估了國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準的6種商用肺結(jié)核分子診斷方法的診斷效能，包括Xpert MTB/RIF、線性探針、LAMP、CPA、SAT和PCR，結(jié)果顯示Xpert MTB/RIF的靈敏度最高，CPA的特異度最高，而SAT的靈敏度和特異度最低。

3 LPA

LPA基于多重PCR擴增，與預先固化在試紙條上的特異性DNA探針雜交，對雜交帶進行酶聯(lián)免疫比色檢測，通過肉眼觀察條帶顯色情況即可判斷基因突變情況。目前，WHO推薦用于痰涂片陽性樣本初始耐藥性篩選的LPA包括Genotype MTBDRplus VER 1.0/2.0、Nipro NTM+MDR-TB和Genotype MTBDRsl VER 1.0/2.0。

Genotype MTBDRplus VER 1.0/2.0通過篩選rpoB、katG和inhA啟動子的突變，可同時檢測MTB RIF和異煙肼的耐藥性[34]。研究顯示，MTBDRplus VER 1.0對RIF耐藥結(jié)核的檢測準確性較高，靈敏度為98.1%，特異度為98.7%[35]。不同研究異煙肼耐藥結(jié)核檢測的結(jié)果差異較大，靈敏度為57%～100%，特異度為99.5%，其原因可能為katG、inhA突變率存在地域差異[36]。

Nipro NTM+MDR-TB通過靶向rpoB、katG和inhA啟動子檢測耐多藥結(jié)核[36]。NTM+MDR-TB對RIF耐藥檢測顯示出較高的特異度(97.45%～100%)，但對于異煙肼的耐藥檢測特異度略下降(96.43%～97.83%)，兩種藥物的檢測靈敏度在不同研究中差異較大(50%～100%)，不能得出統(tǒng)一的結(jié)論[36-38]。

Genotype MTBDRsl VER 1.0可靶向gyrA基因檢測氟喹諾酮類耐藥，靶向rrs基因檢測二線注射藥物耐藥，靶向embB基因檢測乙胺丁醇耐藥。MTBDRsl VER 2.0移除了embB的靶區(qū)，可檢測與氟喹諾酮類(gyrA和gyrB基因)和二線注射藥物(rrs和eis基因)耐藥性相關(guān)的突變，VER 1.0只適用于涂片陽性的標本，VER 2.0則適用于涂片陽性或陰性的標本。MTBDRsl是目前唯一可檢測廣泛耐藥結(jié)核的分子診斷技術(shù)，于2016年獲得WHO批準，適用于痰涂片陰性或陽性、肺結(jié)核或肺外結(jié)核的標本[39]。

Theron等[40]更新了關(guān)于MTBDRsl對氟喹諾酮類和二線注射藥物耐藥的檢測性能系統(tǒng)評價，在痰涂片陽性標本中，MTBDRsl VER 1.0檢測氟喹諾酮類耐藥的靈敏度和特異度分別為86.2%和98.6%，檢測二線注射藥物耐藥的靈敏度和特異度分別為87.0%和99.5%，檢測廣泛耐藥結(jié)核的靈敏度和特異度分別為69.4%和99.4%。MTBDRsl VER 2.0在不同地域研究中的診斷性能存在差異，在痰涂片陽性標本中檢測氟喹諾酮類耐藥的靈敏度為73.6%～100%，特異度為98%～100%，檢測二線注射藥物耐藥的靈敏度為64.7%～89.2%，特異度為90%～99.3%，對廣泛耐藥結(jié)核的檢測靈敏度為83%～87%，特異度為59%～100%[41-44]。

4 基因芯片技術(shù)

基因芯片也稱DNA微陣列，是將特定的DNA探針和寡核苷酸等有序固定于固相支持物上形成微陣列后，與熒光標記的靶分子進行PCR反向雜交，其雜交信號由熒光掃描儀自動檢測，且能夠在同一時間內(nèi)平行分析大量的基因，進行大信息量的篩選及檢測分析，但存在芯片制備復雜、儀器設(shè)備昂貴、樣品標記繁瑣、檢測成本高等缺點[45]。目前，WHO沒有批準任何基于基因芯片的檢測耐多藥結(jié)核的方法，大多數(shù)測試仍在開發(fā)中[5]。中國廣州博奧生物有限公司開發(fā)的基因芯片產(chǎn)品(GeneChip MDR試劑盒)由國家衛(wèi)生和計劃生育委員會批準上市，是市場上唯一一種基于DNA微陣列的檢測技術(shù)，該技術(shù)能夠快速檢測標本中MTB的ropB、katG和inhA等突變基因，最多可同時檢測25個基因組，現(xiàn)GeneChip MDR試劑盒已在中國多個省份廣泛應用于研究中[46]。研究顯示，基因芯片對RIF耐藥的靈敏度和特異度分別為87.56%和97.95%，對異煙肼耐藥的靈敏度和特異度分別為80.34%和95.82%[47]。

5 熔解曲線法

MeltPro TB是由中國廈門致善生物公司開發(fā)的一種基于熒光PCR熔解曲線法的新型分子檢測試劑盒，主要用于檢測一線和二線抗結(jié)核藥物的耐藥性[48]，該試劑盒采用閉管法，避免了擴增產(chǎn)物的污染，檢測可在3 h內(nèi)完成。耐藥基因的突變會打亂堿基的組成成分，導致DNA的熔解溫度降低，在PCR體系中加入兩端分別標記有熒光基團與淬滅基團的探針，計算熒光值和DNA熔解溫度的負倒數(shù)，獲得熔解曲線，從而得出靶標基因的序列信息。2013年，國家食品藥品監(jiān)督管理總局批準MeltPro TB用于對RIF和異煙肼耐藥的定性檢測。MeltPro檢測RIF耐藥的靈敏度為92%～96%，特異度為99%[49]，對異煙肼耐藥的靈敏度和特異度分別為90.8%和96.4%[50]。對于二線藥物，國內(nèi)多中心試驗評估MeltPro TB針對痰涂片陽性標本鑒別耐多藥結(jié)核和廣泛耐藥結(jié)核的性能，其靈敏度分別為86.7%和71.4%[51]。

6 WGS

上述分子檢測技術(shù)(如Xpert MTB/RIF和GenoType MTBDRplus/sl)只能識別有限數(shù)量的藥物靶基因的特異性耐藥突變，不能檢測RIF耐藥決定區(qū)外的突變或RIF耐藥決定區(qū)內(nèi)影響藥物療效的沉默突變，從而導致假陽性結(jié)果。在結(jié)核病的診斷中，識別這些類型的突變對于指導正確的臨床治療非常必要，而WGS有望解決這一問題。Cole等研究報道了MTB標準株H37Rv的完整基因組序列，其長度約為4 410 000堿基對，編碼約4 000個基因[52]。WGS通過識別MTB基因組中與表型耐藥性相關(guān)的突變，實現(xiàn)MTB及其耐藥性的精確檢測。目前，WGS已成功應用于MTB的菌種鑒定、基因分型、耐藥檢測和流行病學調(diào)查中[53]。研究顯示，WGS對異煙肼、RIF、乙胺丁醇和吡嗪酰胺耐藥的預測正確率分別為97.1%、97.5%、94.6%和91.3%[54]。盡管WSG在常規(guī)診斷和耐藥結(jié)核病管理方面有明顯優(yōu)勢，但僅在少數(shù)高收入國家和低結(jié)核病負擔地區(qū)被納入臨床診治流程，在我國多用于科學研究。因此，WGS在進入廣泛臨床應用前，還需對樣本選擇、細菌裂解、DNA提取、文庫構(gòu)建及測序平臺等環(huán)節(jié)進行深入研究。

7 小 結(jié)

分子生物學的高速發(fā)展為結(jié)核病的診斷、管理和監(jiān)測開辟了一條新的途徑。與傳統(tǒng)診斷方法相比，分子診斷技術(shù)可以減少周轉(zhuǎn)時間，提高診斷性能，有利于臨床更早進行個體化治療，但仍存在以下問題：①現(xiàn)有檢測技術(shù)對于含菌量低的標本(如痰涂片陰性肺結(jié)核、肺外結(jié)核、兒童結(jié)核、獲得性免疫缺陷綜合征并發(fā)結(jié)核)的診斷靈敏度有限；②在資源有限的國家，由于檢測費用昂貴、實驗室基礎(chǔ)設(shè)備要求高、技術(shù)人員的標準化培訓等挑戰(zhàn)，分子診斷技術(shù)的應用受限；③MTB耐藥與基因突變的確切關(guān)系仍未完全闡明，且存在未被發(fā)現(xiàn)的耐藥基因，各種檢測方法也均有缺點，分子耐藥結(jié)果與所獲得的藥敏表型的相關(guān)性并不穩(wěn)定，故聯(lián)合表型藥敏試驗量化耐藥水平仍非常必要。WGS雖具有廣闊的應用前景，但因其測序成本昂貴，數(shù)據(jù)的分析和注釋未達成共識，故目前尚未有在資源有限、結(jié)核病負擔沉重的國家常規(guī)實施WGS的計劃[3]。未來仍需致力于開發(fā)快速簡便的新型分子檢測技術(shù)，提高診斷性能的同時降低成本，以利于在資源有限但結(jié)核負擔重的國家中推廣實施。建立WGS的標準化檢測流程，進一步挖掘結(jié)核病的分型、耐藥和療效預測的生物標志物，以加快臨床轉(zhuǎn)化過程。