抗M3R抗體在干燥綜合征發(fā)病機(jī)制及治療中的研究進(jìn)展

劉麗，吳斌，曹文富，李延萍

(1.重慶醫(yī)科大學(xué)中醫(yī)藥學(xué)院，重慶 400016； 2.重慶市中醫(yī)院風(fēng)濕病科，重慶 400021)

干燥綜合征(Sj?gren′s syndrome，SS)是一種病因不明的慢性淋巴細(xì)胞增生性疾病，典型特征是淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)唾液腺和淚腺，主要表現(xiàn)為口眼干燥[1]。SS的分泌功能障礙除與淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)腺體、促炎癥細(xì)胞因子引起的上皮細(xì)胞凋亡相關(guān)外，還與自身抗體對(duì)抗毒蕈堿型3型乙酰膽堿受體(muscarinic type 3 acetylcholine receptor,M3R)的抑制有關(guān)，抗M3R抗體可作為M3R的拮抗劑抑制后者分泌[2]。毒蕈堿受體在副交感神經(jīng)系統(tǒng)中具有神經(jīng)遞質(zhì)的功能，在非神經(jīng)組織如平滑肌中也具有激素樣功能[3]。毒蕈堿受體共有5種亞型：M1R～M5R。在淚腺中，乙酰膽堿結(jié)合M3R促進(jìn)腺體分泌；在肌上皮細(xì)胞中，M3R促進(jìn)淚液在淚腺管中的流動(dòng)；在結(jié)膜杯狀細(xì)胞中，M2R和M3R參與黏蛋白的分泌；在瞼板腺中，毒蕈堿受體可調(diào)節(jié)瞼板的分泌[4-5]。此外，乙酰膽堿參與M3R的副交感神經(jīng)遞質(zhì)的釋放，是胃腸道和內(nèi)臟平滑肌收縮的關(guān)鍵介質(zhì)。研究已證實(shí)，SS患者攜帶抗M3R的自身抗體，且抗M3R抗體在SS患者中具有較高的靈敏度和陽(yáng)性率，但現(xiàn)有的檢測(cè)方法仍需優(yōu)化[6-7]。原發(fā)性SS(primary Sj?gren′s syndrome，pSS)患者的抗SSA/Ro抗體、抗SSB/La抗體或唾液流速測(cè)試陰性，抗M3R抗體陽(yáng)性，提示抗M3R抗體檢測(cè)可用于pSS診斷[2，8]?，F(xiàn)就外分泌腺功能受損機(jī)制、腺外機(jī)制及基于抗M3R抗體的治療予以綜述。

1 抗M3R抗體誘發(fā)SS的機(jī)制

1.1外分泌腺受損機(jī)制

1.1.1針對(duì)M3R第二細(xì)胞外環(huán)的抗體減少唾液分泌 M3R具有4個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域，即N端區(qū)域、第一細(xì)胞外環(huán)、第二細(xì)胞外環(huán)和第三細(xì)胞外環(huán)，其中第二細(xì)胞外環(huán)是激動(dòng)劑激活受體的關(guān)鍵。研究顯示，在SS少年患者中，第二細(xì)胞外環(huán)的自身抗體陽(yáng)性率較高[9]。M3R的第二細(xì)胞外環(huán)是毒蕈堿受體的免疫優(yōu)勢(shì)功能區(qū)，可被抗M3R抗體識(shí)別[6]，并在SS致病中起作用[10]；針對(duì)M3R第二細(xì)胞外環(huán)的抗體可以抑制M3R激動(dòng)劑誘導(dǎo)的Ca2+增加，抑制Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致SS患者唾液分泌減少。Sumida等[9]研究顯示，只有針對(duì)M3R第二細(xì)胞外環(huán)的自身抗體才能抑制唾液腺細(xì)胞系Ca2+內(nèi)流。此外，抗M3R抗體與SS干眼有關(guān)[11]，M3R第二細(xì)胞外環(huán)抗體抑制一氧化氮合酶的激活和環(huán)磷酸鳥苷的產(chǎn)生，并通過免疫刺激后釋放一氧化氮導(dǎo)致淚腺組織損傷[9]。Chen等[12]用由自身B細(xì)胞表位和非自身T細(xì)胞表位組成的合成肽在小鼠中誘導(dǎo)了針對(duì)M3R第二細(xì)胞外環(huán)肽的自身抗體的免疫反應(yīng)，結(jié)果顯示該抗體能夠結(jié)合外分泌腺，但不損害腺體分泌功能，提示針對(duì)M3R第二細(xì)胞外環(huán)肽的自身抗體在體內(nèi)無致病性。然而，此結(jié)果不能排除M3R作為pSS致病性的自身抗原的可能性，因?yàn)榫€性或環(huán)狀的M3R第二細(xì)胞外環(huán)的合成肽可能不足以模仿M3R的多個(gè)構(gòu)象表位，且抗M3R抗體對(duì)唾液分泌的影響可能取決于不同表位，不能排除致病性表位位于受體的第二細(xì)胞外環(huán)之外。在所有M3R細(xì)胞外部分中，M3R抗體的抗第二細(xì)胞外環(huán)陽(yáng)性最為常見[13]?？梢姡槍?duì)M3R第二細(xì)胞外環(huán)之外的自身抗體可能參與SS的發(fā)病機(jī)制，但詳細(xì)的機(jī)制還有待深入研究。

1.1.2干擾離子通道導(dǎo)致腺體分泌受損 M3R在外分泌中起關(guān)鍵作用[7]，尤其在唾液的分泌中[11]。研究顯示，M3R基因敲除的小鼠唾液腺M(fèi)3R信號(hào)功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致唾液分泌顯著減少[14]。已知乙酰膽堿結(jié)合并激活唾液腺細(xì)胞的M3R，通過肌醇1，4，5-三磷酸及其受體引起細(xì)胞內(nèi)Ca2+升高，進(jìn)而激活頂膜的Cl-通道，誘導(dǎo)唾液分泌[9]。研究顯示，SS患者的免疫球蛋白G(immunoglobulin G，IgG)抗體可抑制卡巴膽堿對(duì)細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+的誘導(dǎo)，降低腺泡細(xì)胞的Ca2+內(nèi)流；抗M3R抗體通過減少Ca2+內(nèi)流和結(jié)合唾液腺上皮細(xì)胞的M3R分子導(dǎo)致唾液功能障礙[9]。使用人類下頜下腺細(xì)胞系的功能分析表明，針對(duì)M3R第二細(xì)胞外環(huán)的抗體可抑制細(xì)胞Ca2+內(nèi)流，抑制唾液分泌[15]。此外，SS衍生的IgG能夠抑制毛果蕓香堿誘導(dǎo)的大鼠腮腺腺泡細(xì)胞中水通道蛋白5轉(zhuǎn)運(yùn)，Lee等[15]研究證實(shí)抗M3R抗體與受體的結(jié)合可抑制水通道蛋白5轉(zhuǎn)運(yùn)至質(zhì)膜，導(dǎo)致SS中液體分泌受損?？筂3R抗體同時(shí)也干擾唾液腺腺泡膜中副交感神經(jīng)遞質(zhì)對(duì)離子通量的調(diào)節(jié)，一方面充當(dāng)促炎分子前列腺素E2的誘導(dǎo)劑，進(jìn)而抑制Na+，K+-ATP酶的活性；另一方面廢除細(xì)胞膜上Na+，K+-ATP酶的作用，使凈K+流出增加，減少唾液生成而出現(xiàn)口干的癥狀[16]。在SS外分泌障礙中，抗M3R抗體對(duì)離子轉(zhuǎn)運(yùn)的調(diào)節(jié)具有重要作用，其可通過減少Ca2+內(nèi)流、抑制水通道蛋白5轉(zhuǎn)運(yùn)、干擾Na+/K+交換從而減少唾液的生成。

1.1.3T細(xì)胞受體免疫應(yīng)答介導(dǎo)唾液腺炎癥 SS患者唾液腺中M3R反應(yīng)性T細(xì)胞和B細(xì)胞可誘導(dǎo)唾液腺炎。Iizuka等[17]研究顯示，在40%的SS患者循環(huán)單核細(xì)胞中可檢測(cè)到M3R反應(yīng)性T細(xì)胞，且可鑒定出一些細(xì)胞表位，如M3R的4個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域。T細(xì)胞的抗原特異性由T細(xì)胞受體決定，CD4+T細(xì)胞構(gòu)成SS患者唾液腺和淚腺的大部分浸潤(rùn)細(xì)胞[13]。研究顯示，自身反應(yīng)性CD3+T細(xì)胞對(duì)M3R在唾液腺炎的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮關(guān)鍵作用[18]，其可導(dǎo)致唾液腺中的細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮細(xì)胞破壞，引發(fā)自身免疫性唾液腺炎[11]。將M3R肽免疫的M3R-/-中的CD3+T細(xì)胞轉(zhuǎn)移到Rag1-/-小鼠中，可導(dǎo)致小鼠唾液腺的淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)和上皮細(xì)胞破壞，證明M3R反應(yīng)性CD3+T細(xì)胞的免疫損害作用[17]。涎腺炎中的M3R分子有兩個(gè)主要的T細(xì)胞表位，即N端區(qū)域肽和第一細(xì)胞外環(huán)肽[19]；其中，最主要的T細(xì)胞表位可能是M3R的第一細(xì)胞外環(huán)，因?yàn)門細(xì)胞可以識(shí)別M3R的第一細(xì)胞外環(huán)并同時(shí)產(chǎn)生γ干擾素和白細(xì)胞介素-17(interleukin 17,IL-17)，γ干擾素和IL-17是涎腺炎發(fā)病機(jī)制中的關(guān)鍵細(xì)胞因子[20]。Iizuka等[21]研究顯示，M3R反應(yīng)性T細(xì)胞中的Th17細(xì)胞產(chǎn)生的IL-17可以激活小鼠唾液腺中滲入的B細(xì)胞，從而誘發(fā)SS樣涎腺炎。抗M3R抗體在M3R的細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域上具有多個(gè)B細(xì)胞表位，且部分SS患者攜帶了識(shí)別M3R的多個(gè)細(xì)胞外結(jié)構(gòu)域的抗M3R抗體。Th17細(xì)胞可促進(jìn)M3R抗體沉積于腺泡細(xì)胞，并抑制M3R介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致唾液腺功能障礙[14]；且M3R反應(yīng)性Th17細(xì)胞與pSS疾病活性評(píng)分和抗M3R抗體滴度呈正相關(guān)，篩選出M3R特異性Th17細(xì)胞并針對(duì)其進(jìn)行靶向治療是pSS潛在的有效治療策略[13]。研究證實(shí)M3R反應(yīng)性Th1細(xì)胞促進(jìn)自身免疫涎腺炎的發(fā)展，抑制γ干擾素和IL-17的產(chǎn)生可有效減輕唾液功能障礙，提示IL-17和γ干擾素可作為SS治療的潛在靶標(biāo)[18]。由此可見，CD4+T細(xì)胞和M3R反應(yīng)性CD3+T細(xì)胞浸潤(rùn)并破壞唾液腺，Th17細(xì)胞通過分泌γ干擾素、IL-17并促進(jìn)抗M3R抗體的產(chǎn)生以抑制M3R的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，從而引發(fā)唾液腺功能障礙，IL-17又可激活B細(xì)胞促發(fā)炎癥，以上研究均表明T細(xì)胞和B細(xì)胞在靶向治療SS中的潛力。

1.2腺體外機(jī)制

1.2.1自主神經(jīng)功能障礙 膽堿能功能障礙是pSS自主神經(jīng)功能異常的標(biāo)志，在pSS患者中，抗M3R抗體可介導(dǎo)與pSS相關(guān)的腺體和自主神經(jīng)功能障礙[22]。Kovács等[23]研究顯示，多數(shù)pSS患者有胃腸道和泌尿系統(tǒng)的自主神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙。有研究使用復(fù)合自主神經(jīng)癥狀量表進(jìn)行問卷調(diào)查，結(jié)果顯示，pSS患者心率變異性降低與分泌功能障礙、膀胱障礙、胃輕癱和便秘等自主神經(jīng)癥狀的嚴(yán)重性存在密切聯(lián)系[24]?？筂3R抗體陽(yáng)性與某些臨床癥狀(如輕度的認(rèn)知障礙和膀胱過度反應(yīng))顯著相關(guān)，可抑制神經(jīng)遞質(zhì)誘發(fā)的膀胱平滑肌收縮[25]。Lee等[25]研究顯示，pSS患者患膀胱刺激性疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加，觀察到抗M3R抗體誘導(dǎo)的炎癥細(xì)胞因子增加可驅(qū)動(dòng)肥大細(xì)胞進(jìn)入逼尿肌膀胱固有層，致使逼尿肌細(xì)胞的炎癥細(xì)胞因子分泌增加，促進(jìn)膀胱疼痛綜合征的發(fā)生?？筂3R抗體參與神經(jīng)免疫，有研究發(fā)現(xiàn)免疫球蛋白輸注4周后抗M3R抗體活性被中和，而特異性自身抗體水平未發(fā)生改變，此結(jié)果為靜脈輸注免疫球蛋白治療抗M3R抗體陽(yáng)性患者的副交感神經(jīng)功能障礙提供了理論依據(jù)[26]。自主神經(jīng)功能障礙在pSS患者中較常見，提示pSS的另一種發(fā)病機(jī)制，可加重總體癥狀，并與全身性疾病活動(dòng)度有關(guān)。

1.2.2胃腸道功能障礙 胃排空延遲和結(jié)腸運(yùn)動(dòng)障礙是pSS的常見特征。M3R在結(jié)腸和胃平滑肌收縮中發(fā)揮主要作用，抗M3R抗體對(duì)M3R神經(jīng)傳遞信號(hào)的干擾和對(duì)平滑肌收縮的抑制可導(dǎo)致與SS患者胃腸道不適相關(guān)的癥狀[27-28]。研究顯示，在缺乏M3R的小鼠體內(nèi)，自身抗體并無以上作用，提示抗M3R抗體具有介導(dǎo)pSS胃腸道多種功能障礙的潛力，可抑制胃腸道中神經(jīng)元介導(dǎo)的平滑肌收縮[29]，非競(jìng)爭(zhēng)性抑制卡巴膽堿引起的結(jié)腸收縮[30]。由上可知，抗M3R抗體抑制M3R導(dǎo)致的平滑肌細(xì)胞收縮，并阻斷神經(jīng)元誘導(dǎo)的間接肌反應(yīng)，進(jìn)而引起一系列胃腸道不適癥狀，提示抗M3R抗體在pSS患者消化道癥狀方面的潛在治療作用。

1.2.3干擾造血系統(tǒng) 抗毒蕈堿受體多肽抗體可通過阻斷乙酰膽堿信號(hào)，在突觸后水平阻礙副交感神經(jīng)信號(hào)傳遞，使神經(jīng)遞質(zhì)(如乙酰膽堿)分泌減少，導(dǎo)致造血系統(tǒng)功能障礙(如白細(xì)胞減少、血小板減少和血紅蛋白減少)[10]。有報(bào)道稱，SS中抗M3R抗體陽(yáng)性患者的白細(xì)胞減少癥發(fā)生率高于陰性患者，且抗SS-A抗體和IgG陽(yáng)性率更高，病程更短[7]。He等[10]也證明抗M3R抗體與貧血、白細(xì)胞減少、血小板減少、類風(fēng)濕因子和抗核抗體陽(yáng)性呈正相關(guān)。關(guān)于白細(xì)胞減少的機(jī)制，一方面抗M3R抗體可誘導(dǎo)白細(xì)胞中質(zhì)膜儲(chǔ)留的M3R和主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類分子下調(diào)，隨后通過自然殺傷細(xì)胞介導(dǎo)白細(xì)胞死亡；另一方面抗M3R抗體破壞T淋巴細(xì)胞上M3R的生理功能，進(jìn)而降低對(duì)自分泌乙酰膽堿的刺激，逐漸抑制白細(xì)胞的增殖和存活[31]?？梢奙3R抗體可干擾血液系統(tǒng)，尤其是在SS患者的白細(xì)胞減少癥中發(fā)揮作用，但仍需進(jìn)一步研究揭示抗M3R抗體與造血系統(tǒng)功能障礙的其他機(jī)制。

2 基于抗M3R抗體的治療

目前針對(duì)SS患者腺體分泌障礙的療法分為局部替代療法(人工淚液、人工唾液)和M3R的化學(xué)激動(dòng)劑，對(duì)M3R激動(dòng)劑的研究新進(jìn)展為認(rèn)識(shí)免疫系統(tǒng)與神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)之間的聯(lián)系提供了重要依據(jù)。研究表明，口服30 mg的西維美林可引起持續(xù)增加的唾液流動(dòng)，持續(xù)流動(dòng)時(shí)間較毛果蕓香堿長(zhǎng)4～6 h，且不良反應(yīng)較毛果蕓香堿輕[32]。此外，pSS IgG可增加膜M3R與主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ類的相互作用，并誘導(dǎo)下頜下腺細(xì)胞的內(nèi)化(受體的單體與二聚體發(fā)生相互轉(zhuǎn)換可阻礙受體的內(nèi)吞)，減少信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，導(dǎo)致M3R功能逐步喪失，阻礙唾液腺的分泌。Kim等[33]研究表明，pSS IgG誘導(dǎo)的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ對(duì)M3R的內(nèi)化作用可被膽固醇替代藥物抑制，即通過富含膽固醇的微域與抗M3R自身抗體的內(nèi)在結(jié)合，使帶有M3R的主要組織相容性復(fù)合體Ⅰ膜顯著下調(diào)，提示了pSS的潛在治療方向。Asashima等[19]基于CD4+M3R反應(yīng)性T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17和γ干擾素，T細(xì)胞表位主要來自N1和1st肽區(qū)域這一理論進(jìn)行研究，在設(shè)計(jì)的肽配體中，N端1-肽配體7(氨基酸15處的N→S)顯著抑制γ干擾素的產(chǎn)生，且抑制涎腺炎的產(chǎn)生，可作為降低SS中病原性T細(xì)胞浸潤(rùn)唾液腺的潛在有用策略。Kudo等[34]研究證實(shí)，靜脈注射M3R的T細(xì)胞，其表位N端1區(qū)域改變的肽配體可以抑制涎腺炎；口服使用表達(dá)N端1-肽配體7的水稻種子可通過抑制M3R特異性γ干擾素和IL-17的產(chǎn)生以及增強(qiáng)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞，顯著恢復(fù)已減少的唾液流量，抑制涎腺炎。研究顯示，視黃酸相關(guān)的孤兒受體γt的拮抗劑可抑制M3R特異性T細(xì)胞產(chǎn)生IL-17和γ干擾素，改善涎腺炎的預(yù)后，表明小分子抑制劑可以靶向治療M3R相關(guān)的涎腺炎[18]。Kumar等[26]研究證實(shí)，靜脈注射免疫球蛋白可逆轉(zhuǎn)抗體對(duì)乙酰膽堿釋放的抑制作用，但對(duì)乙酰膽堿的基礎(chǔ)釋放并無顯著影響，表明靜脈注射免疫球蛋白可能逆轉(zhuǎn)抗體介導(dǎo)的膽堿能功能障礙，從而逆轉(zhuǎn)神經(jīng)和肌源性M3R失活。以上研究表明，針對(duì)抗M3R抗體致病的不同機(jī)制，存在不同系列的有效治療方法。

3 展 望

抗M3R抗體存在于SS患者中并參與SS的發(fā)病機(jī)制。隨著SS的進(jìn)展，患者體內(nèi)抗M3R抗體濃度或親和力越來越高，這可能與病灶數(shù)量增加、唾液腺分泌功能受到抑制以及炎性損害有關(guān)。除在SS中作為病原學(xué)抗體外，抗M3R抗體也可能成為潛在的診斷標(biāo)記和治療靶標(biāo)。在外分泌障礙方面，M3R的第二細(xì)胞外環(huán)被視為受體上的免疫優(yōu)勢(shì)功能區(qū)，抗M3R抗體與M3R結(jié)合可抑制水通道蛋白5轉(zhuǎn)運(yùn)，干擾Ca2+內(nèi)流，發(fā)揮M3R拮抗作用；并可下調(diào)M3R的表達(dá)導(dǎo)致唾液分泌減少。M3R反應(yīng)性T細(xì)胞通過分泌IL-17和γ干擾素誘導(dǎo)自身免疫性唾液腺炎，進(jìn)而導(dǎo)致腺體功能的障礙。此外，抗M3R抗體還可介導(dǎo)與SS相關(guān)的自主神經(jīng)功能障礙，減少神經(jīng)遞質(zhì)的分泌，引起胃腸道及血液系統(tǒng)等腺外表現(xiàn)。對(duì)M3R及其抗體的研究可為SS的診斷及治療提供新視角，已有研究證明毒蕈堿M3激動(dòng)劑有助于SS的治療，未來仍需深入探索以提高SS的診療水平。