肝臟再生動物模型研究進展

李嘉興，李明意

(1.廣東醫(yī)科大學，廣東 湛江 524023； 2.廣東醫(yī)科大學附屬醫(yī)院肝膽外科，廣東 湛江 524001)

肝臟由肝細胞、膽管上皮細胞、庫普弗細胞和淋巴細胞等組成，是機體最重要的實質(zhì)性器官之一，具有代謝脂類蛋白質(zhì)、調(diào)節(jié)血容量和維持水電解質(zhì)平衡等生理功能[1]。肝炎、脂肪肝、肝硬化和肝癌等肝臟相關疾病的發(fā)病率逐漸升高，已成為世界范圍內(nèi)導致患者死亡的主要原因之一。2010年，全球超過200萬人死于肝臟疾病(包括急性肝炎、肝硬化和肝癌)，約占全球死亡人數(shù)的4%[2-3]。導致肝臟損傷的因素較多，包括藥物性肝損傷、化學損傷、病毒性肝炎、肝硬化和肝癌等。肝臟再生潛能巨大，根據(jù)不同損傷方式和程度肝臟表現(xiàn)出不同的再生方式[4]。因此，有效激發(fā)正常肝細胞的再生潛能、促進肝損傷的修復、維持肝臟正常的生理功能是治療肝臟疾病的關鍵。目前研究者對肝臟再生機制的認識和理解均來自實驗動物，因此研究肝臟再生動物模型有助于了解肝損傷后再生的調(diào)控機制，指導臨床肝臟疾病的治療?，F(xiàn)就肝臟再生動物模型的研究進展予以綜述。

1 部分肝切除模型

1.170%肝切除模型 最經(jīng)典的肝切除模型是大鼠70%肝切除模型，該模型將大鼠肝臟的左外葉和中葉切除，相當于切除大鼠70%的肝臟[5]。正常情況下，大多數(shù)肝細胞處于靜止期，只有不到1%的肝細胞進入增殖期以更新衰老的肝細胞[6]，維持肝臟正常的生理功能。70%肝切除模型只切除了部分肝臟，且不會對剩余肝細胞造成任何損傷，因此是研究肝細胞正常增殖調(diào)控的良好模型。K?hler等[7]通過研究大鼠肝切除模型發(fā)現(xiàn)，門靜脈周圍肝細胞中的Notch-1和齒狀蛋白1表達升高，同時Notch胞內(nèi)結(jié)構域的核易位在肝切除后增加并于15 min內(nèi)達峰值；而使用干擾小RNA沉默Notch-1和齒狀蛋白1則可導致肝細胞增殖減少，從而減緩肝臟再生。另有研究發(fā)現(xiàn)，Notch信號可通過Notch胞內(nèi)結(jié)構域/蛋白激酶B/缺氧誘導因子-1α通路調(diào)節(jié)肝臟再生，抑制Notch信號通路可阻礙肝細胞由S期向M期轉(zhuǎn)化，從而影響肝臟再生[8]。Grijalva等[9]通過研究70%肝切除模型發(fā)現(xiàn)，Yes相關蛋白的活化和核定位在肝臟再生的早期即開始增加，且術后前3天增加最顯著，并隨著肝臟恢復到原來的體積而逐漸降至正常水平。還有研究發(fā)現(xiàn)，Yes相關蛋白過表達可直接促進肝細胞增殖或通過Notch-2轉(zhuǎn)錄調(diào)控使成熟的肝細胞去分化為肝祖細胞，從而增加肝臟體積或促進肝損傷修復[10-11]。有研究顯示，Yes相關蛋白和轉(zhuǎn)錄共刺激因子缺失的肝切除模型突變體小鼠的肝細胞不能有效進入細胞周期，導致肝臟完全再生受阻[12]。以上研究表明，Notch和Hippo信號通路可通過激活DNA復制促進正常肝細胞增殖或去分化為肝祖細胞，參與肝部分切除后的肝臟再生。

1.2極限肝切除模型 臨床上，對于巨大肝癌或肝臟腫物的患者通常采取擴大肝切除術，對肝臟進行較大范圍切除。由于切除的肝臟較大，患者剩余肝臟功能儲備不足，患者術后易發(fā)生急性肝衰竭。研究術后肝衰竭的病理生理機制、促進術后肝臟再生、提高術后存活率是臨床肝膽外科面臨的主要問題。在不同的部分肝切除術中，肝細胞均出現(xiàn)肥大，僅在70%肝切除和90%肝切除術中出現(xiàn)肝細胞增殖[13]。因此，促進行擴大肝切除術患者的肝臟再生、減少肝癌患者圍手術期肝衰竭的發(fā)生，對于提高中晚期肝癌患者的預后具有重要意義。Zhai等[14]發(fā)現(xiàn)，CXC趨化因子受體4拮抗劑AMD3100聯(lián)合小劑量免疫抑制劑FK506可誘導內(nèi)源性骨髓干細胞分化，促進行擴大肝切除術后小鼠的肝臟再生，并改善其肝功能。Kim等[15]研究表明，血管升壓素可顯著提高90%肝切除大鼠的存活率，表明生長抑素對術后肝臟再生有一定促進作用。

1.3反復肝切除模型 反復肝切除模型由Simpson和Finckh[16]于1963年建立，吳毅平和吳在德[17]在此基礎上嘗試以不同的切肝量反復切除大鼠肝臟，旨在闡述反復肝切除的可行性。Saito等[18]通過建立連續(xù)兩次70%肝切除大鼠模型發(fā)現(xiàn)，二次肝切除后肝細胞仍具有較大的再生潛能。肝臟部分切除術是肝癌治療的首選方法，但肝癌術后5年腫瘤復發(fā)轉(zhuǎn)移率仍高達40%～70%[19]。Li等[20]發(fā)現(xiàn)，二次手術切除肝復發(fā)腫瘤的療效良好，術后5年存活率為54.4%，與初次手術的療效相近。有報道稱，肝切除后會出現(xiàn)術后粘連，從而增加術中出血量和手術時間，因此反復肝切除會增加手術的病死率[21]。Arima等[22]研究發(fā)現(xiàn)，接受二次肝切除與單次肝切除肝癌患者的白蛋白等生化指標比較差異無統(tǒng)計學意義，且兩組患者的肝臟再生能力相似。此外，Wicherts等[23]通過比較1990—2010年接受手術治療的肝結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移患者發(fā)現(xiàn)，重復肝切除患者首次肝切除術后3年和5年的總生存率分別為76%和54%，而僅行一次肝切除術患者3年和5年的總生存率分別為58%和45%，表明重復肝切除可提高復發(fā)性肝癌患者的生存率。以上研究表明，復發(fā)性肝癌患者仍可從二次肝部分切除術中受益。一項回顧性分析研究顯示，重復肝切除與單次肝切除患者在肝功能不全、膽漏和瘺管方面具有可比性，兩組病死率和總病死率比較差異無統(tǒng)計學意義[24]。由于肝源短缺，臨床挽救性肝移植治療復發(fā)性肝癌存在局限性，而二次肝切除術可作為復發(fā)性肝癌的重要治療手段。

2 門靜脈結(jié)扎模型

家兔門靜脈結(jié)扎實驗表明，將部分門靜脈分支結(jié)扎后，家兔肝葉出現(xiàn)萎縮，而未結(jié)扎的肝葉則出現(xiàn)代償性增生肥大[25]。有研究通過比較80%門靜脈結(jié)扎大鼠模型和80%肝切除大鼠模型發(fā)現(xiàn)，細胞周期蛋白D1對兩種不同模型的肝細胞增殖均具有重要作用，而80%門靜脈結(jié)扎大鼠模型的存活率更高[26]。因此，門靜脈結(jié)扎模型作為肝臟再生動物模型，具有更方便、穩(wěn)定、可靠等特點。Lauber等[27]將大鼠分為3組，分別行70%、80%和90%門靜脈結(jié)扎，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，不同程度的門靜脈結(jié)扎后門靜脈壓均相應升高；同時還發(fā)現(xiàn)，90%門靜脈結(jié)扎模型未結(jié)扎肝葉大鼠的有絲分裂肝細胞增加，且其有絲分裂細胞計數(shù)更早達到峰值，同時有絲分裂細胞數(shù)目顯著高于70%門靜脈結(jié)扎模型和80%門靜脈結(jié)扎模型大鼠。自噬是指細胞受到自噬信號誘導后在胞質(zhì)中形成自噬泡將待降解物包裹，并與溶酶體融合形成自噬溶酶體，從而將包裹的物質(zhì)降解的過程。研究發(fā)現(xiàn)，門靜脈結(jié)扎模型大鼠的自噬被激活，且自噬活性微管相關蛋白輕鏈3Ⅱ/Ⅰ與Beclin1和細胞周期蛋白D1水平均呈正相關[28]。門靜脈栓塞或結(jié)扎是臨床治療肝癌的手段之一。對于需要行肝癌擴大根治術的患者，由于切除的肝臟體積較大，且患者常伴有肝炎、肝硬化等肝臟疾病，導致術后剩余肝臟功能儲備不足以維持人體正常生理活動，引起肝衰竭甚至死亡，因此限制了肝切除術的應用。有報道稱，在肝癌擴大切除術前行門靜脈結(jié)扎術，可增加剩余肝臟的體積，提高手術的安全性，減少術后并發(fā)癥的發(fā)生[29]。聯(lián)合肝臟離斷和門靜脈結(jié)扎的分階段肝切除術最早用于肝門部膽管癌的治療[25]。Schnitzbauer等[30]分析行聯(lián)合肝臟離斷和門靜脈結(jié)扎的分階段肝切除術的肝癌患者的臨床資料發(fā)現(xiàn)，術后5～28 d(中位時間9 d)殘余肝臟體積迅速增生，且殘余肝臟體積的中位增長率達74%。不同程度門靜脈結(jié)扎可誘發(fā)不同強度的肝臟再生反應，且自噬參與這一過程。肝部分切除術是治療肝癌的首選方法，但對于不適宜立即行肝部分切除術的患者，可以先行門靜脈結(jié)扎術，誘導肝臟再生，提高肝部分切除術耐受性，減少術后并發(fā)癥的發(fā)生。門靜脈結(jié)扎模型的建立及研究可為肝癌患者提供更多的治療選擇。

3 化學損傷模型

肝臟再生是一個病理生理過程，臨床上許多肝病患者均存在不同程度的肝損傷。四氯化碳(CCl4)、D-半乳糖胺(D-galactosamine，D-GaIN)、酒精、硫代乙酰胺等均具有肝毒性，長期過量應用可導致肝臟損害、肝實質(zhì)細胞死亡，從而引起肝細胞再生。構建化學藥物肝損傷再生模型，模擬肝臟的再生過程，對研究肝臟不同性質(zhì)病變的再生調(diào)控機制、指導臨床肝臟疾病診治均具有重要意義。

3.1CCl4損傷模型 CCl4是建立化學藥物肝損傷動物模型最常用的藥物之一，主要機制是CCl4進入機體后，經(jīng)過肝臟代謝產(chǎn)生三氯甲基和氧自由基，這些自由基與肝細胞及線粒體膜上的磷脂分子共價結(jié)合，從而引發(fā)脂質(zhì)過氧化，導致膜的結(jié)構和功能破壞[31]。此外，自由基還可抑制細胞膜和線粒體膜鈣泵的活性，導致大量鈣離子內(nèi)流，進而導致肝細胞壞死[32]。Foroutan等[33]通過單次腹腔注射CCl4構建大鼠急性肝損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，大鼠天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和堿性磷酸酶水平均升高，肝細胞凋亡和炎癥增加?；ㄉ南┧嵝盘栟D(zhuǎn)導通路是炎癥過程的重要組成部分，有研究報道，在大鼠急性肝損傷模型中，CCl4可誘導花生四烯酸參與的c-Jun氨基端激酶/胞質(zhì)磷脂酶-2/12-脂肪氧化酶炎癥信號通路的激活，從而導致肝細胞炎癥的發(fā)生[34]。朱安妮等[35]分別通過單次腹腔注射0.1%、0.2%和0.3%的CCl4建立小鼠急性肝損傷模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，CCl4造成的急性肝損傷呈劑量依賴性；進一步分析血漿轉(zhuǎn)氨酶水平變化發(fā)現(xiàn)，0.1% CCl4是建立小鼠急性輕度肝損傷模型的適宜濃度，有利于肝臟再生藥物的研究。長期持續(xù)存在的肝損傷會導致肝臟發(fā)生纖維化，而肝星狀細胞的活化是肝纖維化的重要環(huán)節(jié)。Duan等[36]在CCl4致大鼠肝纖維化模型中發(fā)現(xiàn)，Notch通過激活內(nèi)皮型一氧化氮合酶/可溶性鳥苷酸環(huán)化酶信號通路導致肝竇內(nèi)皮細胞去分化和肝纖維化，從而影響肝細胞增殖和肝臟再生。Delta樣配體4(Delta-like ligand 4，DLL4)是Notch信號通路的配體，主要在內(nèi)皮細胞中表達并維持肝竇穩(wěn)態(tài)。Chen等[37]發(fā)現(xiàn)，在人和CCl4誘導的鼠纖維化肝臟的肝竇內(nèi)皮細胞中DLL4表達上調(diào)，這與肝竇內(nèi)皮細胞的毛細血管化和肝纖維化一致，而體內(nèi)沉默DLL4則可減輕肝竇內(nèi)皮細胞毛細血管化和CCl4誘導的肝纖維化。CCl4損傷模型是常用的藥物性肝損傷模型，可用于急性肝損傷甚至肝臟纖維化的研究，該模型可準確反映肝臟的結(jié)構、功能和代謝變化，是研究肝損傷病理機制和篩選護肝藥物的經(jīng)典模型。

3.2D-GaIN損傷模型D-GaIN是常見的引起肝損傷的肝毒性藥物[38]。D-GaIN造成肝損傷的主要機制是D-GaIN進入肝細胞后與葡萄糖焦磷酸化酶結(jié)合，阻礙糖原合成，導致肝細胞的功能和結(jié)構受損，甚至引起肝細胞壞死[39]。此外，D-GaIN還可通過增加氧化應激，產(chǎn)生活性氧類，引起線粒體功能障礙，破壞細胞的結(jié)構和功能，導致肝細胞凋亡[32]。Yu等[40]發(fā)現(xiàn)，成纖維細胞生長因子21可通過激活核因子紅系2相關因子2觸發(fā)磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路，減輕D-GaIN誘導的氧化應激對小鼠肝臟造成的損傷，促進肝臟再生。Wang等[41]發(fā)現(xiàn)，山楂酸可抑制脂多糖/D-GaIN誘導的急性肝損傷模型小鼠血清和肝組織中炎癥細胞因子腫瘤壞死因子-α和白細胞介素6-水平升高，上調(diào)肝組織中丙二醛和髓過氧化物酶活性；此外，山楂酸還可下調(diào)核因子κB的表達，上調(diào)核因子紅系2相關因子2和血紅素加氧酶1的表達。表明山楂酸通過抑制核因子κB和核因子紅系2相關因子2信號通路激活，保護脂多糖/D-GaIN誘導的肝損傷。有研究發(fā)現(xiàn)，乳桿菌R005通過下調(diào)肝臟和腸道中的Toll樣受體、腫瘤壞死因子-α和核因子κB轉(zhuǎn)錄，降低促炎細胞因子的血漿濃度而表現(xiàn)出抗炎特性，可在一定程度上緩解D-GaIN造成的急性肝損傷[42]。總之，D-GaIN所致的肝臟損傷的病理變化與病毒性肝炎相近，故D-GaIN損傷模型是研究病毒性肝炎較理想的動物模型。

3.3酒精性肝損傷模型 酒精性肝病是臨床肝膽外科常見的一類疾病，可誘發(fā)肝脂肪變性、肝進行性纖維化、肝硬化甚至肝癌。因乙醇消費導致的死亡約占全球總死亡人數(shù)的3.8%[43]。人體攝入乙醇后，首先在肝臟中通過乙醇脫氫酶系統(tǒng)、乙醇氧化酶系統(tǒng)和過氧化氫酶系統(tǒng)氧化代謝為乙醛，然后再進一步轉(zhuǎn)化為乙酸。乙醛代謝過程中的氧化應激和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)生大量活性氧類，可造成肝細胞線粒體損傷或誘導肝細胞凋亡，是導致酒精性肝病的主要原因。Lieber-DeCarli模型是目前研究慢性肝損傷應用最廣泛的動物模型，該模型在液體飲食中添加高濃度的酒精，連續(xù)喂養(yǎng)大鼠4～12周，模擬人類肝臟慢性酒精中毒的病理改變[44]。Bertola等[45]通過Lieber-DeCarli流質(zhì)飲食4～6周以及在喂養(yǎng)期間多次單劑量酒精(5 g/kg)灌胃喂養(yǎng)小鼠，模擬臨床上有長期慢性飲酒史的患者暴飲暴食后誘發(fā)的急性肝損傷，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與Lieber-DeCarli模型相比，慢性和暴飲暴食酒精除可導致小鼠血清丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶和天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶升高外，還可導致肝臟廣泛脂肪變性。有學者在酒精流質(zhì)飲食喂養(yǎng)小鼠4周的基礎上，再通過腹腔向小鼠體內(nèi)注射CCl4(每周2次，持續(xù)4周)，利用CCl4對肝細胞的損傷作用誘發(fā)肝臟炎癥和肝纖維化[46]。理想的酒精性肝損傷模型對于研究和闡明酒精性肝損傷的病理機制以及促進酒精性肝病的防治均具有重要意義。

4 小 結(jié)

不同類型的肝臟損傷應采用不同的造模方法。良好的動物模型可通過完整模擬疾病的發(fā)病特點、組織損傷和病理變化，為疾病病理機制的研究、診治以及藥物的研發(fā)等提供堅實的基礎。肝臟損傷導致的肝臟疾病是影響人類健康的常見疾病。引起肝臟損傷的因素主要包括化學性、藥物性、酒精性及環(huán)境因素等，長期肝臟損傷可誘發(fā)肝炎、脂肪肝、肝硬化甚至肝癌等疾病。因此，應用不同的造模方式模擬不同肝臟疾病的病理特點，有助于促進肝臟再生的研究，也可為相關肝損傷治療藥物及治療方法的研究提供實驗基礎和理論依據(jù)。