BDNF轉(zhuǎn)染干細(xì)胞治療周圍神經(jīng)損傷的研究進(jìn)展

關(guān)茗巖，劉建宇

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院骨外科，哈爾濱 150081)

周圍神經(jīng)損傷(peripheral nerve injury，PNI)的影響人群較廣泛，其中發(fā)展中國(guó)家患者的占比較高，且人數(shù)逐漸增多[1-3]，除可直接導(dǎo)致與傷害相關(guān)的功能和心理后果外，PNI還與全球社會(huì)經(jīng)濟(jì)和成本相關(guān)[4]。PNI的原因主要包括事故、穿透?jìng)?、摔傷、缺血、感染、骨折后鄰近神?jīng)損傷、醫(yī)源性損傷等[5]。

目前PNI的治療方法多樣，如在外科手術(shù)中行神經(jīng)外膜縫合，但術(shù)后神經(jīng)功能恢復(fù)情況受到炎癥、感染、手術(shù)縫線、瘢痕等的影響，修復(fù)效果不能令人滿意[6]；自體不帶血管神經(jīng)移植對(duì)于成段的神經(jīng)缺損效果最好，但可導(dǎo)致供體神經(jīng)功能缺失，故來(lái)源有限、無(wú)法滿足臨床需求；此外，中醫(yī)中藥起效慢，長(zhǎng)期服用具有肝、腎毒性，缺少更多循證醫(yī)學(xué)證據(jù)。為了解決上述難題，依據(jù)不同類型干細(xì)胞的特征研究PNI與修復(fù)的機(jī)制發(fā)現(xiàn)，神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子在PNI與其修復(fù)機(jī)制中發(fā)揮重要作用，特別是腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)[7]?，F(xiàn)就BDNF轉(zhuǎn)染干細(xì)胞治療PNI的研究進(jìn)展予以綜述。

1 PNI及修復(fù)機(jī)制

PNI后導(dǎo)致?lián)p傷平面軸突和髓鞘破壞，神經(jīng)支配的靶器官與軸突之間發(fā)生斷裂，軸漿運(yùn)輸中斷，受損神經(jīng)短時(shí)間內(nèi)自近端向遠(yuǎn)端發(fā)生變性，神經(jīng)元細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，這一系列反應(yīng)稱為沃勒變性(Wallerian degeneration)，可導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)終板乙酰膽堿酯酶活性下降。沃勒變性會(huì)引起血液-神經(jīng)屏障通透化[8]，并通過(guò)對(duì)組織損傷敏感的受體激活附近的施萬(wàn)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，施萬(wàn)細(xì)胞通過(guò)脫落髓鞘、增殖、吞噬碎屑、釋放募集血液中的單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞的細(xì)胞因子對(duì)損傷做出反應(yīng)[9]。隨后，施萬(wàn)細(xì)胞沿神經(jīng)內(nèi)膜鞘增生，通過(guò)與多種細(xì)胞外基質(zhì)相互作用穩(wěn)定髓鞘的正常狀態(tài)，并可分泌細(xì)胞因子(血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子、BDNF等)，其中BDNF可調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育和功能的幾乎所有方面，包括誘導(dǎo)、增殖及分化[7]，升高的BDNF水平通過(guò)促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路修復(fù)退化的神經(jīng)元、增強(qiáng)神經(jīng)元活動(dòng)、促進(jìn)軸突生長(zhǎng)[10]。此外，施萬(wàn)細(xì)胞還通過(guò)Ca2+/鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白等信號(hào)通路參與PNI的早期修復(fù)[11-12]。

2 BDNF的應(yīng)用研究

神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白首次由Brade等[13]通過(guò)純化豬腦發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)具有營(yíng)養(yǎng)作用，可促進(jìn)神經(jīng)元發(fā)育，且分布廣泛，對(duì)于調(diào)節(jié)神經(jīng)增殖、分化、成熟和可塑性等過(guò)程至關(guān)重要，可影響細(xì)胞的生命和死亡途徑之間的轉(zhuǎn)換，其中BDNF在大腦特別是海馬組織中呈高表達(dá)，幾乎可調(diào)節(jié)神經(jīng)元發(fā)育和功能的所有方面[14-15]。

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，BDNF在腦認(rèn)知功能(如記憶、學(xué)習(xí)、行為和情緒控制)中起重要作用[16]，BDNF還可通過(guò)Ras-促分裂原活化的蛋白激酶、磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B以及磷脂酶Cγ、Ca2+等[7]信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮多種不可或缺的作用，如保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、促進(jìn)神經(jīng)元的存活和發(fā)育繁殖、防止神經(jīng)元受損死亡，維持海馬內(nèi)突觸可塑性和促進(jìn)突觸再生，同時(shí)上述信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路還影響患者認(rèn)知功能，而認(rèn)知功能是獲取和鞏固記憶的基礎(chǔ)，表明BDNF高水平表達(dá)與言語(yǔ)記憶和識(shí)別能力相關(guān)，并可能抵消慢性壓力和認(rèn)知能力下降的影響。此外，BDNF還作用于阿爾茨海默病中耗竭的膽堿能神經(jīng)元[17]、帕金森病中丟失的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元[18]，而高水平BDNF產(chǎn)生的抗抑郁藥能夠產(chǎn)生更好的神經(jīng)塑性結(jié)果[19]，起到延緩疾病進(jìn)展的作用。因此，老年人BDNF水平降低可能導(dǎo)致記憶力減退、神經(jīng)退行性變以及其他認(rèn)知障礙[20]。

在周圍神經(jīng)系統(tǒng)中，微RNA-1與BDNF的3′非翻譯區(qū)靶向位點(diǎn)結(jié)合，抑制BDNF信使RNA的降解和翻譯，培養(yǎng)的施萬(wàn)細(xì)胞中微RNA-1的過(guò)表達(dá)或沉默分別抑制或增強(qiáng)了細(xì)胞的BDNF分泌，并分別抑制或促進(jìn)施萬(wàn)細(xì)胞的增殖和遷移[21]。BDNF通過(guò)結(jié)合軸突上原肌球蛋白受體激酶B受體增強(qiáng)神經(jīng)突伸長(zhǎng)，若BDNF再生軸突的可用性減弱，則軸突再生將受到嚴(yán)重?fù)p害[22]。Fornaro等[23]使用兩個(gè)背根神經(jīng)節(jié)外植體和背根神經(jīng)節(jié)衍生的原代細(xì)胞制作分離培養(yǎng)物的體外模型，研究BDNF對(duì)神經(jīng)突生長(zhǎng)的影響，定量數(shù)據(jù)表明，BDNF可刺激感覺(jué)纖維的曲折生長(zhǎng)和細(xì)胞簇的形成，促使軸突向周圍靶標(biāo)分布，上述發(fā)現(xiàn)對(duì)于BDNF在周圍神經(jīng)再生中的臨床應(yīng)用具有重要意義。Scheper等[24]在人骨髓中分離人間充質(zhì)干細(xì)胞，通過(guò)轉(zhuǎn)導(dǎo)和基因表達(dá)分析將人間充質(zhì)干細(xì)胞分化為過(guò)量表達(dá)BDNF的軟骨細(xì)胞，從而增加體外神經(jīng)元的存活率，證實(shí)BDNF過(guò)表達(dá)后人間充質(zhì)干細(xì)胞可進(jìn)一步對(duì)神經(jīng)產(chǎn)生保護(hù)作用。綜上所述，BDNF在中樞及外周神經(jīng)均可直接、間接(轉(zhuǎn)染、誘導(dǎo)等)促進(jìn)軸突再生，是修復(fù)損傷神經(jīng)的重要元素。

3 BDNF轉(zhuǎn)染干細(xì)胞后的治療

干細(xì)胞是一類具有自我更新能力和多向分化潛能的細(xì)胞，根據(jù)所處發(fā)育階段不同可分為胚胎干細(xì)胞(embryonic stem cells，ESCs)和成體干細(xì)胞。從胚胎分離的干細(xì)胞稱為ESCs，從成人分離的干細(xì)胞稱為成體干細(xì)胞[25]。根據(jù)干細(xì)胞發(fā)育能力的不同又可分為全能干細(xì)胞、多能干細(xì)胞和單能干細(xì)胞。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cells，iPSC)是經(jīng)細(xì)胞核重新編程為胚胎樣多能狀態(tài)的成體細(xì)胞，可通過(guò)將體細(xì)胞核轉(zhuǎn)移到卵母細(xì)胞中[26]，或通過(guò)多能轉(zhuǎn)錄因子[27]誘導(dǎo)。

3.1ESCs ESCs來(lái)源于發(fā)育中的胚泡的內(nèi)部細(xì)胞團(tuán)，通過(guò)體外或體內(nèi)形成胚狀體來(lái)評(píng)估，其可在體外維持較長(zhǎng)的時(shí)間，且不會(huì)失去自我更新或發(fā)育潛能，產(chǎn)生代表內(nèi)胚層、中胚層和外胚層的細(xì)胞類型，用于PNI修復(fù)的治療。Cui等[28]證實(shí)，經(jīng)ESCs誘導(dǎo)施萬(wàn)細(xì)胞移植入大鼠坐骨神經(jīng)后會(huì)出現(xiàn)大量的軸突再生和神經(jīng)修復(fù)。另有研究表明，基因修飾后的人ESCs過(guò)表達(dá)成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2，有助于強(qiáng)化脊髓損傷后神經(jīng)元的保護(hù)作用，并促進(jìn)BDNF等神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的分泌，表明ESCs可能通過(guò)過(guò)表達(dá)BDNF保護(hù)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元，保持突觸覆蓋并降低星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)性[29]。有實(shí)驗(yàn)證明，BDNF和綠色熒光蛋白轉(zhuǎn)染后的ESCs可使神經(jīng)元數(shù)量增加，且適用于各種神經(jīng)病理學(xué)條件下BDNF細(xì)胞移植改善作用的研究[30]。但是，ESCs源自體外受精的人類胚胎，存在倫理問(wèn)題，具有致畸胎瘤的潛在風(fēng)險(xiǎn)。目前已成功通過(guò)電穿孔法使ESCs過(guò)表達(dá)BDNF[31]，但后續(xù)對(duì)周圍神經(jīng)的修復(fù)暫無(wú)相關(guān)報(bào)道。

3.2成體干細(xì)胞

3.2.1骨髓來(lái)源干細(xì)胞 間充質(zhì)干細(xì)胞是中胚層來(lái)源的成體干細(xì)胞，具有高度的自我更新、多向分化潛能，且來(lái)源豐富，可從骨髓、脂肪組織、臍帶、羊水、肌腱、胚胎絨毛膜、乳牙和胎兒的肝臟等組織分離出來(lái)。

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是具有可塑性的多能干細(xì)胞，可被誘導(dǎo)分化為多種細(xì)胞譜系，包括成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等，易于分離，移植排斥率低。實(shí)驗(yàn)表明，用慢病毒轉(zhuǎn)染BDNF的BMSCs可在體外分化為神經(jīng)樣細(xì)胞，這與原肌球蛋白受體激酶B受體結(jié)合的表達(dá)有關(guān)，促進(jìn)未分化人間充質(zhì)干細(xì)胞發(fā)育為成熟神經(jīng)元，以治療神經(jīng)元疾病[32-33]。Li等[34]通過(guò)腺病毒方法轉(zhuǎn)染BMSCs并聯(lián)合促紅細(xì)胞生成素促進(jìn)軸突生長(zhǎng)，修復(fù)脊髓損傷后大鼠神經(jīng)，改善其后肢運(yùn)動(dòng)功能。同理，采用腺病毒方法使BMSCs過(guò)表達(dá)BDNF，并在功能化的自組裝肽水凝膠中誘導(dǎo)神經(jīng)元樣細(xì)胞治療脊髓損傷后神經(jīng)修復(fù)的效果較好[35]。將過(guò)表達(dá)BDNF和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞系神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子的BMSCs作為種子細(xì)胞引入高度定向的聚(L-乳酸)/大豆分離蛋白納米纖維神經(jīng)導(dǎo)管的方法，大幅度提高了神經(jīng)修復(fù)的效率[36]。

3.2.2脂肪來(lái)源干細(xì)胞 近年來(lái)，脂肪組織已能夠作為分化為中胚層細(xì)胞譜系的基質(zhì)細(xì)胞的替代來(lái)源，脂肪干細(xì)胞(adipose-derived stem cells，ADSCs)是具有類似于BMSCs的表型和基因表達(dá)譜的多能干細(xì)胞，具有神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)特性，能夠分化為多種細(xì)胞譜系。國(guó)內(nèi)研究已實(shí)現(xiàn)BDNF過(guò)表達(dá)慢病毒載體，并建立了穩(wěn)定表達(dá)的ADSCs株[37]。也有研究表明，ADSCs和施萬(wàn)細(xì)胞共培養(yǎng)后，ADSCs表現(xiàn)出典型的紡錘形S-100標(biāo)記細(xì)胞——施萬(wàn)細(xì)胞的特征，使用慢病毒轉(zhuǎn)染方法使ADSCs過(guò)表達(dá)BDNF，并通過(guò)對(duì)鼠損傷的坐骨神經(jīng)的電生理、步態(tài)分析獲得坐骨神經(jīng)恢復(fù)指數(shù)等證明ADSCs具有促進(jìn)神經(jīng)髓鞘再生、改善運(yùn)動(dòng)和神經(jīng)的功能[38]。Schweizer等[39]將ADSCs移植到嚙齒動(dòng)物坐骨神經(jīng)損傷模型中，證實(shí)ADSCs對(duì)神經(jīng)再生有良好的影響，另外，BDNF聯(lián)合神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)蛋白-3通過(guò)慢病毒法共轉(zhuǎn)染大鼠ADSCs后可成功向施萬(wàn)細(xì)胞方向誘導(dǎo)，對(duì)維持神經(jīng)元存活和促進(jìn)神經(jīng)元分化有促進(jìn)作用,也驗(yàn)證了雙因子比單一營(yíng)養(yǎng)因子更具有優(yōu)越性，為組織工程技術(shù)治療脊髓損傷的未來(lái)實(shí)驗(yàn)提供了堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)[40]。

3.2.3臍帶來(lái)源干細(xì)胞 臍帶是在母體和胎兒之間運(yùn)輸營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的樞紐，含有大量的間充質(zhì)干細(xì)胞即人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells，hUCMSCs)，胎兒出生后的臍帶來(lái)源豐富，不會(huì)出現(xiàn)倫理問(wèn)題，具有促血管生成、抗炎、神經(jīng)修復(fù)、免疫調(diào)節(jié)功能及非致瘤性[41-44]。hUCMSCs可通過(guò)分泌各種神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子并沉積細(xì)胞外基質(zhì)蛋白來(lái)調(diào)節(jié)施萬(wàn)細(xì)胞并促進(jìn)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)，其中旁分泌機(jī)制參與了hUCMSCs的細(xì)胞療法，在PNI治療中起重要作用。另有實(shí)驗(yàn)表明，腺病毒載體介導(dǎo)的BDNF向hUCMSCs的離體基因轉(zhuǎn)移，修飾后的hUCMSCs存活時(shí)間較長(zhǎng)，可維持神經(jīng)分化，促進(jìn)擠壓傷大鼠坐骨神經(jīng)軸突再生和功能恢復(fù)，且效果優(yōu)于未轉(zhuǎn)染組，可以用于缺氧缺血性腦損傷后神經(jīng)功能的恢復(fù)，但需要進(jìn)一步評(píng)估神經(jīng)再生的根本機(jī)制及長(zhǎng)期治療效果[45-46]。

3.2.4神經(jīng)干細(xì)胞(neural stem cells，NSCs) NSCs是一種神經(jīng)組織特異性的前體細(xì)胞，存在于腦和脊髓神經(jīng)系統(tǒng)中，具有多向分化的潛能和自我更新能力，在不同微環(huán)境中可分化為神經(jīng)元、神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞。國(guó)內(nèi)研究表明，BDNF通過(guò)非脂質(zhì)體法基因修飾大鼠胚胎NSCs后進(jìn)行體外誘導(dǎo)分化，基因轉(zhuǎn)染48 h后顯示，NSCs形成了雙極神經(jīng)元樣細(xì)胞，誘導(dǎo)7 d后獲得巢蛋白陽(yáng)性、βⅢ-微管蛋白陽(yáng)性的NSCs比例明顯高于單一NSCs組、外加BDNF誘導(dǎo)組，反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)BDNF基因表達(dá)的增強(qiáng)，證明了NSCs具有體外分泌BDNF的能力，促進(jìn)了NSCs定向分化為神經(jīng)元及突觸的發(fā)生[47]。另有研究表明，大鼠全腦輻照4周后，將慢病毒載體基因修飾的神經(jīng)干細(xì)胞移植入腦組織海馬中4周，高比例膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布于海馬內(nèi)，說(shuō)明移植海馬內(nèi)過(guò)表達(dá)BDNF的NSCs在輻射所引起惡劣的海馬環(huán)境中具有整合優(yōu)勢(shì)[48]。Kwon等[49]和Moro等[50]應(yīng)用腺病毒、慢病毒載體介導(dǎo)BDNF修飾NSCs，能夠防止中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后神經(jīng)元萎縮，并促進(jìn)再生相關(guān)基因表達(dá)。此外，神經(jīng)生長(zhǎng)因子+BDNF+堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子的聯(lián)合使用可顯著提高NSCs增殖和分化能力，大幅提高了NSCs治療效果[51]?？梢?jiàn)通過(guò)BDNF修飾NSCs用于修復(fù)神經(jīng)效果佳，基因療法對(duì)于治療中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)疾病提供了臨床思路。

3.2.5肌源干細(xì)胞(muscle-derived stem cells，MDSCs) MDSCs是從骨骼肌中分離出的細(xì)胞群體，具有成肌、成脂肪、成軟骨和成骨等多向分化能力，并有很強(qiáng)的自我更新能力，在長(zhǎng)時(shí)間連續(xù)傳代60代仍保持表型不變。MDSCs來(lái)源廣泛，代表衛(wèi)星細(xì)胞的前身，具有更高的再生能力和細(xì)胞存活率，是近年理想的種子細(xì)胞。MDSCs在體外可被誘導(dǎo)分化成施萬(wàn)細(xì)胞[52]，其與BDNF共培養(yǎng)誘導(dǎo)后[53]神經(jīng)元數(shù)量明顯增加，相關(guān)分析表明，BDNF水平與神經(jīng)元損傷之間存在顯著的相關(guān)性，有助于MDSCs發(fā)揮作用，體內(nèi)植入MDSCs后，受損神經(jīng)區(qū)域的軸突再生，神經(jīng)元的凋亡減弱，抗氧化劑的表達(dá)以及B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2和B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2相關(guān)X蛋白的比例上調(diào)，BDNF還可促進(jìn)MDSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，從而替代受損神經(jīng)，治療PNI效果佳。此外，采用脂質(zhì)體法將SMDF基因轉(zhuǎn)染小鼠MDSCs后與施萬(wàn)細(xì)胞共培養(yǎng)誘導(dǎo)分化，被誘導(dǎo)成施萬(wàn)樣細(xì)胞的陽(yáng)性率約為89%，明顯高于直接誘導(dǎo)的陽(yáng)性率63%，證實(shí)轉(zhuǎn)染可提高誘導(dǎo)效率[54]。目前，BDNF轉(zhuǎn)染MDSCs后誘導(dǎo)神經(jīng)元樣細(xì)胞用于坐骨神經(jīng)損傷修復(fù)的研究正在進(jìn)行中。

3.3iPSC iPSC是指通過(guò)不同基因直接導(dǎo)入成體干細(xì)胞，并將分化后細(xì)胞的細(xì)胞核重新編程到未分化狀態(tài)，最終獲得類似ESCs的多能干細(xì)胞。iPSC誘導(dǎo)是一種利用轉(zhuǎn)錄因子重新編程體細(xì)胞的機(jī)制[55-56]。iPSC可分化為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層三個(gè)胚層型，NSCs[57]可誘導(dǎo)干細(xì)胞中的神經(jīng)分化，并具有修復(fù)神經(jīng)系統(tǒng)的潛力，BDNF通過(guò)激活Wnt/β聯(lián)蛋白和胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶5信號(hào)通路，促進(jìn)iPSC衍生的NSCs的生長(zhǎng)，并分化成疾病特異性的細(xì)胞類型，有助于治療神經(jīng)元疾病。研究顯示，選用腺病毒法將BDNF基因修飾的真皮多能干細(xì)胞移植入脊髓損傷局部，鏡下可見(jiàn)大量BDNF陽(yáng)性細(xì)胞，3 d后過(guò)表達(dá)BDNF的iPSC組凋亡率低于單純BDNF組，根據(jù)BBB(Basso,Beattie,Bresnahan)運(yùn)動(dòng)量表神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分法，大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)效果明顯優(yōu)于單純BDNF組，能夠更大程度地改善神經(jīng)損傷修復(fù)[58]。但是，iPSC具有潛在的致瘤性，包括致畸胎瘤性和致癌性，因此有必要進(jìn)行更加高效、穩(wěn)定的重編程方案[59]。目前產(chǎn)生iPSc的源細(xì)胞、基因修飾方法及相關(guān)機(jī)制正在不斷更新，其在基因修飾層面能否對(duì)神經(jīng)產(chǎn)生更好的效果暫無(wú)相關(guān)研究。

4 小 結(jié)

隨著組織工程技術(shù)蓬勃發(fā)展，從全能干細(xì)胞ESCs到重新編程的iPSC，經(jīng)BDNF修飾的細(xì)胞大部分均已應(yīng)用于周圍神經(jīng)再生和修復(fù)，目前BDNF轉(zhuǎn)染肌源干細(xì)胞治療神經(jīng)再生和修復(fù)的研究正在進(jìn)行中。近年P(guān)NI修復(fù)的研究取得了很大進(jìn)步，但基因修飾后干細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)的機(jī)制尚不明確，相關(guān)研究仍處于臨床前研究階段，且面臨一些熱點(diǎn)問(wèn)題，如基因修飾后細(xì)胞的變異、應(yīng)用安全性、基因表達(dá)的不穩(wěn)定性、細(xì)胞致瘤性等，隨著對(duì)基因修飾干細(xì)胞研究及科研水平的提高，基因修飾后干細(xì)胞移植應(yīng)用于PNI修復(fù)將有廣闊的前景。