SNHG17對三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞體外增殖及遷移的影響

許 靜 高 琳 馬 磊 洪馬林 黃凈怡 趙 盼

乳腺癌是最常見的女性惡性腫瘤之一，占全部惡性腫瘤的12.2%。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer, TNBC)占乳腺浸潤性癌的15%～20%，發(fā)病年齡較輕，其惡性度高、侵襲性強(qiáng)、易早期轉(zhuǎn)移、預(yù)后差，在分子遺傳學(xué)、病理組織學(xué)及臨床特征方面與雌激素受體(estrogen receptor, ER)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)及人類表皮生長因子受體2(human epidermal growth factor receptor-2, HER-2)陽性的乳腺癌相比存在顯著差異。有證據(jù)顯示，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和微小RNA(microRNA，miRNA)等生物活性分子參與乳腺癌的發(fā)展過程，但目前在三陰性乳腺癌中未見報道。lncRNA是長度大于200個核苷酸的非編碼RNA，包括癌基因和抑癌基因，在腫瘤中存在差異性表達(dá)，能夠通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、凋亡及促進(jìn)血管新生，影響腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移。小核RNA宿主基因17(small nucleolar RNA host gene 17，SNHG17)貯存于lncRNA和非蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)，是蛋白質(zhì)合成機(jī)制中關(guān)鍵的組成部分，在消化系統(tǒng)結(jié)直腸癌的進(jìn)展和侵襲等方面起決定性作用。本研究旨在研究SNHG17在三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系及癌組織中的表達(dá)情況，構(gòu)建SNHG17高表達(dá)細(xì)胞模型，探討對細(xì)胞增殖、克隆、遷移及侵襲等的影響，為探究三陰性乳腺癌新的診療靶標(biāo)提供研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 組織來源 收集2018年1月至2019年12月深圳市人民醫(yī)院病理科經(jīng)手術(shù)切除并通過免疫組化驗證均為ER/PR/HER-2陰性的三陰性乳腺癌組織標(biāo)本40例為研究對象，患者年齡35～56歲，平均(41.95±4.79)歲，患者術(shù)前均未接受放化療，同時將同一患者的癌旁組織標(biāo)本作為對照組，所有病例經(jīng)病理科主任醫(yī)師復(fù)核診斷結(jié)果。本研究由我院醫(yī)學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，患者簽署知情同意書。

1.1.2 細(xì)胞與試劑 人三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系購于中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物所；聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerase chain reaction，PCR)引物購于上海吉瑪公司；探針由上海生工有限公司構(gòu)建合成；提取總RNA試劑、Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒及qRT-PCR試劑盒均購自Invitrogen公司；胎牛血清及DMEM培養(yǎng)基購自HyClone公司；Transwell遷移小室購于德國Merck Millipore公司；Transwell侵襲小室購自美國康寧公司。

1.2 方法

1.2.1 SNHG17RNA原位雜交 將癌旁正常組織和癌組織經(jīng)4%多聚甲醛固定，組織經(jīng)脫水、包埋、制片。使用上海生物工程公司合成的地高辛標(biāo)記DNA探針，探針序列為(5’-3’)：AGTCTCCCATGTCTGGACCCCGAATCTTG。在組織切片滴加100 μL DNA探針雜交液，37℃預(yù)雜交2 h，85℃變性5 min，冷卻，37℃雜交過夜。加入抗地高辛-抗血清堿性磷酸酶復(fù)合物(以抗體稀釋液1∶1 000稀釋)，4℃孵育過夜，硝基四氮唑藍(lán)/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸鹽(nitrotetrazolium blue/chloride5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate，NBT/BCIP)避光顯色4 h。磷酸甘油封片，顯微鏡下觀察。堿性磷酸酶標(biāo)記的原位雜交(in situ hybridization，ISH)顯色藍(lán)紫色為陽性。結(jié)果判斷：于200倍光鏡下觀察計數(shù)，ISH使用堿性磷酸酶標(biāo)記后顯色陽性為藍(lán)色。原位雜交的染色評分：每個樣本隨機(jī)選擇4～6張切片中10個視野，評分標(biāo)準(zhǔn)按照，①密度評分。無為0分；弱為1分；中等為2分；強(qiáng)為3分；②比例評分。0%為0分，1%～25%為1分，26%～50%為2分，51%～5%為3分，76%～100%為4分。最后按照密度評分×比例評分計算染色評分。

1.2.2 構(gòu)建SNHG17過表達(dá)質(zhì)粒 將pHBLV-CMV-MCS-EF1-Zsgreen1-T2A-puro質(zhì)粒作為空載體為陰性對照組，將SNHG17 DNA片段與pHBLV-CMV-MCS-EF1-Zsgreen1-T2A-puro質(zhì)粒連接，進(jìn)行基因重組。構(gòu)建SNHG17過表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)行一代測序驗證質(zhì)粒(LV012-h-SNHG17)是否構(gòu)建成功。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染 在含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于37℃、5%CO環(huán)境內(nèi)，培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，24孔板內(nèi)接種細(xì)胞數(shù)2×10個/孔，根據(jù)LipofectamineM 2000試劑盒說明書轉(zhuǎn)染LV012-h-SNHG17質(zhì)粒及pHBLV-CMV-MCS-EF1-Zsgreen1-T2A-puro質(zhì)粒到細(xì)胞中，6 h后換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，使用eppendorf 高速離心機(jī)，800 g離心力，室溫離心3～5 min，收集細(xì)胞。

1.2.4 qRT-PCR實驗 MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染LV012-h-SNHG17質(zhì)粒48 h后，按照TRIzol試劑盒提取各組細(xì)胞的總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。hSNHG17引物序列：上游5’-TTCTCACCGTGAATCTCTTGG-3’，下游5’-AGATTGAACAGTGGATCCGG-3’。hβ-ACTIN引物序列：上游5’-ACCTTCTACAATGAGCTGCG-3’，下游5’-CCTGGATAGCAACGTACATGG-3’。按照qRT-PCR說明書進(jìn)行PCR反應(yīng)，條件為：95℃預(yù)變性10 min，95℃ 35 s，62℃ 35 s，72℃ 5 min，連續(xù)40個循環(huán)，每組均設(shè)置4個平行反應(yīng)復(fù)孔。分析qRT-PCR的擴(kuò)增及熔解曲線，計算目的基因的相對表達(dá)量=2。

1.2.5 CCK-8法檢測細(xì)胞增殖能力 設(shè)空白對照組、陰性對照組及SNHG17過表達(dá)組，陰性對照組MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒，SNHG17過表達(dá)組MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染SNHG17過表達(dá)質(zhì)粒，每組5個復(fù)孔，37℃，5%CO培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，使用Lipofectamine 2000進(jìn)行轉(zhuǎn)染24 h后收集細(xì)胞，取每孔4×10個細(xì)胞接種于96孔板內(nèi)同時每孔加入10 μL CCK-8試劑，在12、24、48、72小時分別觀察MDA-MB-231細(xì)胞的增殖能力，用酶標(biāo)儀檢測450 nm的吸光度(A)值并記錄。

1.2.6 平板克隆形成 MDA-MB-231細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染空質(zhì)粒和SNHG17質(zhì)粒48 h后取各組細(xì)胞，離心后分別接種每孔3×10個細(xì)胞于6孔細(xì)胞板內(nèi)，每組3個復(fù)孔，于37℃、5%CO培養(yǎng)14 d，每隔3 d更換培養(yǎng)液，觀察細(xì)胞克隆數(shù)量，以PBS洗滌細(xì)胞，4%甲醛15 min，加入0.1%結(jié)晶紫20 min，雙蒸水漂洗并干燥，鏡下計數(shù)>50個克隆并記錄，克隆形成率=(有效克隆數(shù)/接種細(xì)胞數(shù))×100%，重復(fù)實驗3次。

1.2.7 Transwell細(xì)胞遷移實驗 用0.25%胰蛋白酶消化轉(zhuǎn)染24 h后的各組MDA-MB-231細(xì)胞，每孔加入1×10個/400 μL細(xì)胞于DMEM無血清培養(yǎng)基中，把Transwell小室放入24孔板，Transwell小室上室中加入100 μL懸液，下室中加入500 μL 10% FBS DMEM，每組3個復(fù)孔，培養(yǎng)于37℃、5%CO環(huán)境中24 h。取出小室，PBS清洗2次，用棉棒擦去未遷移的上層細(xì)胞，使用4%多聚甲醛將遷移細(xì)胞固定30 min，滴加0.1%的結(jié)晶紫染液，PBS漂洗，干燥后，取5個高倍視野觀察并計數(shù)，結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)即遷移細(xì)胞數(shù)，實驗重復(fù)3次取平均數(shù)。

1.2.8 Transwell細(xì)胞侵襲實驗 把Matrigel基質(zhì)和DMEM培養(yǎng)液按1∶5比例混合，加于Transwell上室，制做人工基底膜，滴加DMEM培養(yǎng)液，37℃、5%CO濕度溫箱培養(yǎng)，后續(xù)步驟按照細(xì)胞遷移實驗操作，顯微鏡下計數(shù)遷移到小室底面的細(xì)胞，計數(shù)結(jié)晶紫染色細(xì)胞數(shù)(侵襲細(xì)胞數(shù))，實驗重復(fù)3次取平均數(shù)。

2 結(jié)果

2.1 SNHG17在40例TNBC患者腫瘤組織中的表達(dá)情況 與癌旁正常組織相比，在乳腺癌組織中SNHG17的表達(dá)水平(3.455±0.249)較癌旁正常組織(1.104±0.157)升高(藍(lán)紫色顆粒所示)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=31.103，

P

<0.001)。見圖1。

注：A為癌旁正常乳腺組織(原位雜交)，B為乳腺癌組織(原位雜交);箭頭為SNHG17陽性表達(dá)。

2.2 成功構(gòu)建SNHG17過表達(dá)質(zhì)粒 一代測序堿基序列完全匹配。見圖2。

注：A為陰性對照組過表達(dá)質(zhì)粒示意圖，B為SNHG17過表達(dá)質(zhì)粒示意圖，C為一代測序圖譜。

2.3 qRT-PCR檢測 實驗分3組，每組均設(shè)4個復(fù)孔，使用qRT-PCR方法分別檢測MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)染SNHG17過表達(dá)質(zhì)粒和陰性對照組質(zhì)粒后，SNHG17 RNA的差異性表達(dá)情況。與陰性對照組和空白對照組相比，SNHG17過表達(dá)組的SNHG17的表達(dá)水平(23.394±3.469)較陰性對照組(1.000±0.000)和空白對照組(1.000±0.000)升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=7.708，

P

=0.008)，空白對照組與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。2.4 CCK-8檢測SNHG17過表達(dá)對MDA-MB-231細(xì)胞增殖的影響 各組細(xì)胞在加入CCK8試劑后第12、24、48和72小時分別測量吸光度值記錄，SNHG17過表達(dá)組、陰性對照組和空白對照組數(shù)據(jù)滿足球形假設(shè)檢驗(

P

=0.694)，采用重復(fù)測量方差分析結(jié)果顯示，與陰性對照組和空白對照組相比，SNHG17過表達(dá)組的MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性升高，兩組間比較MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)，空白對照組與陰性對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。不同檢測時間之間MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)；組間與時間之間存在交互作用，組間差異隨時間變化而增加，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.05)。見表1。

表1 CCK8檢測不同時間各組MDA-MB-231細(xì)胞增殖情況

2.5 克隆形成率的情況比較 SNHG17過表達(dá)組MDA-MB-231細(xì)胞的克隆細(xì)胞數(shù)[(291.401±29.282)個]較陰性對照組的克隆細(xì)胞數(shù)[(22.601±2.701)個]和空白對照組的克隆細(xì)胞數(shù)[(20.402±2.913)個]增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

F

=5.162，

P

<0.001)；空白對照組與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。見圖3。

注：A為空白對照組，B為陰性對照組，C為SNHG17過表達(dá)組。

2.6 SNHG17促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞遷移及侵襲 與陰性對照組和空白對照組比較，SNHG17過表達(dá)組MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目均增加，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(

P

<0.001)，空白對照組與陰性對照組相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義(

P

>0.05)。結(jié)晶紫染色細(xì)胞顯示紫色，見圖4和表2。

注：A為陰性對照組細(xì)胞遷移情況，B為空白對照組細(xì)胞遷移情況，C為SNHG17過表達(dá)組細(xì)胞遷移情況，D為陰性對照組細(xì)胞侵襲情況，E為空白對照組細(xì)胞侵襲情況，F(xiàn)為SNHG17過表達(dá)組細(xì)胞侵襲情況。

表2 各組MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目比較

3 討論

目前研究發(fā)現(xiàn)在基因組轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中l(wèi)ncRNA大約占98%，其中包括癌基因和抑癌基因，在不同腫瘤的發(fā)病過程中，對其下游基因發(fā)揮調(diào)控作用，lncRNA表達(dá)失調(diào)能夠調(diào)節(jié)腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移，如HOTAIR、LINC00152、H19、HULC、GHET1、MALAT1和GACAT3等已被證實在三陰性乳腺癌中表達(dá)下調(diào)，與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。深入探索和開發(fā)可用的lncRNA生物標(biāo)志物對腫瘤患者的診斷及治療具有重要意義。

小核RNA(snoRNAs)貯存于lncRNA和非蛋白編碼基因的內(nèi)含子區(qū)。研究表明,snoRNAs的宿主基因在調(diào)控細(xì)胞命運(yùn)和腫瘤發(fā)生方面發(fā)揮關(guān)鍵作用，lncRNA SNHG17就是宿主基因中重要的一員，儲存于核內(nèi)20號染色體p12。一項研究提示，高表達(dá)SNHG17的胃癌患者60個月內(nèi)總生存期和無病生存期均降低。Zhang等研究表明，SNHG17通過對p15和p57進(jìn)行表觀遺傳沉默來促進(jìn)胃癌的進(jìn)展,在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，SNHG17可促進(jìn)GC細(xì)胞增殖、侵襲、遷移，并抑制細(xì)胞凋亡，從而發(fā)揮癌基因作用。另有研究發(fā)現(xiàn)，SNHG17能夠被STAT3誘導(dǎo)上調(diào)表達(dá)，以促進(jìn)黑色素瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移，最終通過PI3K-AKT信號傳導(dǎo)促進(jìn)腫瘤的發(fā)展；同時基因擴(kuò)增驅(qū)動的lncRNA SNHG17可促進(jìn)非小細(xì)胞肺癌(non-small-cell carcinoma, NSCLC)細(xì)胞的增殖活性和遷移能力，表明其作為NSCLC中生物標(biāo)志物的潛在價值。

本研究通過對40例三陰性乳腺癌患者腫瘤組織進(jìn)行堿性磷酸酶標(biāo)記的原位雜交檢測發(fā)現(xiàn)，SNHG17在三陰性乳腺癌組織中的表達(dá)水平明顯高于癌旁正常組織。將SNHG17 DNA片段與pHBLV-CMV-MCS-EF1-Zsgreen1-T2A-puro質(zhì)粒連接，構(gòu)建SNHG17過表達(dá)質(zhì)粒模型，并進(jìn)行一代測序驗證堿基序列完全匹配，質(zhì)粒構(gòu)建成功。通過轉(zhuǎn)染SNHG17過表達(dá)質(zhì)粒于MDA-MB-231細(xì)胞內(nèi)，并進(jìn)行qRT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)SNHG17過表達(dá)組與對照組相比，細(xì)胞中SNHG17RNA的表達(dá)量升高。利用CCK8細(xì)胞增殖實驗并經(jīng)重復(fù)測量資料的方差分析得出，轉(zhuǎn)染SNHG17過表達(dá)質(zhì)粒組MDA-MB-231細(xì)胞增殖活性較陰性對照組和空白對照組都有顯著升高。平板克隆形成實驗結(jié)果也表明SNHG17過表達(dá)后，克隆細(xì)胞數(shù)較對照組明顯增加。上述實驗表明，SNHG17在三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖中發(fā)揮促進(jìn)作用。Shao等的研究報道顯示，lncRNA可以與miRNA形成分子海綿，競爭結(jié)合靶基因而發(fā)揮作用。通過調(diào)控miRNA的表達(dá)，使miRNA與其下游靶基因的結(jié)合受到干擾，從而使可能的靶基因得到表達(dá)，相當(dāng)于發(fā)揮了“競爭性內(nèi)源RNA”的作用。同時本研究發(fā)現(xiàn)，將IncRNA SNHG17過表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，進(jìn)行Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實驗，結(jié)果顯示SNHG17過表達(dá)組MDA-MB-231細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)目較陰性對照組和空白對照組增加，表明SNHG17在乳腺癌中發(fā)揮癌基因的作用。因此需要進(jìn)一步通過生物信息學(xué)技術(shù)，推測SNHG17與miRNA互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)，從而探討其下游靶基因的調(diào)控作用。

綜上所述，SNHG17在三陰性乳腺癌組織和MDA-MB-231細(xì)胞系中高表達(dá)，并可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，SNHG17所涉及的分子信號通路有待進(jìn)一步探討。