手持拉曼光譜快速篩查模擬保健品中10種那非類物質(zhì)的研究

摘要：基于金和銀納米溶膠的表面增強(qiáng)拉曼光譜（SERS）技術(shù)，借助手持式拉曼光譜儀建立一種保健品中非法添加10種那非類物質(zhì)的篩選方法。制備兩種常見的金和銀納米溶膠用于增強(qiáng)拉曼信號，然后對玉米淀粉和白酒模擬樣品進(jìn)行簡單的處理，探究標(biāo)準(zhǔn)溶液和模擬樣品的檢測限并對該方法的假陰性率和假陽性率、特異性等進(jìn)行了評價，均符合食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范。該方法可在現(xiàn)場對保健品中那非類物質(zhì)進(jìn)行快速、準(zhǔn)確、簡單的篩選，滿足現(xiàn)場快速檢測的需求。

關(guān)鍵詞：保健品;那非類物質(zhì);表面增強(qiáng)拉曼光譜;快速篩查

Abstract：Based on the surface enhanced Raman spectroscopy （SERS） technology with gold and silver nano-colloid， a method for screening 10 kinds of PDE-5 illegally added in health care products was established by using handheld Raman unit. Two familiar gold and silver nanoparticles were prepared to enhance Raman signal. Then the cornstarch and liquor spiked PDE-5 were pretreated simply， and then obtained the detection limits of standard solution and simulated samples. The false negative rate， false positive rate and specificity of the method were evaluated， which all accorded with the technical specification for rapid food inspection. This method can realize the rapid， accurate and simple screening of PDE-5 in health care products on site， so meet the needs of rapid detection on site.

Key words：Health products; PDE-5; Surface-enhanced Raman spectroscopy; Rapid screening

1引言

那非類物質(zhì)（Phospjodiesterase type 5， PDE-5）是一類5型磷酸二酯酶的抑制劑，可作為性增強(qiáng)劑或男性的壯陽產(chǎn)品，改善勃起功能障礙的癥狀[1]，是中成藥保健品中最常見的摻假物質(zhì)。一些不法分子為了追求高額利潤，往中成藥和酒類保健品中非法添加那非類物質(zhì)，給消費者帶來嚴(yán)重的健康風(fēng)險，如頭痛、消化不良、背痛、鼻炎、流感綜合征等。2012年3月20日，國家食品藥品監(jiān)督管理局為了嚴(yán)厲打擊保健食品生產(chǎn)中非法添加物質(zhì)的違法違規(guī)行為發(fā)布《保健食品中可能非法添加的物質(zhì)名單（第一批）》，聲稱緩解體力疲勞（抗疲勞）功能產(chǎn)品和聲稱增強(qiáng)免疫力（調(diào)節(jié)免疫）功能產(chǎn)品可能違禁添加那非類物質(zhì)。

目前，實驗室常見的檢測方法有氣質(zhì)聯(lián)用法（GC-MS）、高效液相色譜法（HPLC）和液質(zhì)聯(lián)用法等[2-4]。黃芳等[4]采用液相色譜-質(zhì)譜法對中成藥中非法添加的17種補(bǔ)腎壯陽化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行了定性和定量檢測，檢測限為0.05～1.25mg/kg。雖然這些檢測方法具有較高的靈敏度，但由于前處理繁瑣、檢測耗時、儀器不便、試劑昂貴等缺點，限制了這些方法的發(fā)展，無法滿足食品監(jiān)管部門現(xiàn)場執(zhí)法的迫切需求。國家公安機(jī)關(guān)還專門成立食藥環(huán)偵部門保障食品安全，對保健品中非法添加化學(xué)成分專項整頓和打擊，亟需要一款攜帶方便、檢測速度快、準(zhǔn)確性高的儀器，提高現(xiàn)場的應(yīng)急響應(yīng)能力，對大量樣品先進(jìn)行初步篩查，若為陽性再進(jìn)行確證性檢驗。

與上述方法相比，表面增強(qiáng)拉曼光譜技術(shù)（Surface-enhanced Raman spectroscopy， SERS）作為一種超靈敏、無標(biāo)記的化學(xué)指紋分析方法，近幾十年來受到了人們的關(guān)注[5]。SERS技術(shù)適用于吸附于金屬納米粒子表面的待測物質(zhì)的快速鑒別和篩選，提高拉曼檢測靈敏度的同時能夠猝滅熒光，很好地解決中成藥等基質(zhì)的強(qiáng)熒光干擾問題。此外SERS方法具有預(yù)處理簡單、設(shè)備小巧、檢測速度快等優(yōu)點。近幾年已有一些學(xué)者開展對那非類物質(zhì)進(jìn)行SERS檢測的研究，例如劉元瑞等[6]應(yīng)用薄層色譜表面增強(qiáng)拉曼光譜（TLC-SERS）檢測中成藥和保健品中的西地那非。鄭娟梅等[7]利用金核銀殼納米顆粒的SERS技術(shù)分析保健酒中的西地那非，檢出限為0.5 mg/kg。王紅梅等[8]發(fā)現(xiàn)11種那非類物質(zhì)可根據(jù)其結(jié)構(gòu)分為5組，利用SERS技術(shù)對其進(jìn)行快速檢測。吳國平等[9]采用自制金納米溶膠作為SERS增強(qiáng)試劑，測試21種查繳的保健品真實樣品，準(zhǔn)確度達(dá)到100%。至今還未有報道運用手持拉曼光譜結(jié)合金屬溶膠同時篩查模擬保健品中10種西地那非的研究，故本文用玉米淀粉和白酒分別模擬固體和液體保健品，建立10種那非類物質(zhì)檢測的方法，并對此方法進(jìn)行評價，為現(xiàn)場快速檢測保健品中非法添加該物質(zhì)提供新方法。

2材料與方法

2.1儀器與試劑

手持拉曼光譜儀（型號FirstDefender RM，Thermo Fisher Scientific公司）;離心機(jī)（型號CF16RXII，Hitachi公司）;渦旋振蕩器（型號SAS，Stuart公司）;超純水儀（型號A10，Milli-Q公司）;氣體揮發(fā)裝置（型號TS-18822，Thermo Fisher Scientific公司）;超聲儀（型號S300H，Elmasonic公司）

氯金酸、檸檬酸三鈉（99.99%，J&K Scientific公司）;硝酸銀（ACS，Acros Organics）;二氯甲烷（AR，上海申博化工有限公司）;鹽酸（GR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）;石油醚、氫氧化鈉、氫氧化鉀、抗壞血酸、濃硝酸、乙醇、甲醇（AR，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑公司）

2.2標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)品儲備液配置

豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非、西地那非、他達(dá)拉非、氨基他達(dá)拉非、硫代艾地那非、伐地那非、偽伐地那非、紅地那非、那紅地那非標(biāo)準(zhǔn)品由中國食品藥品檢定研究院提供。純度均≥98%。稱取上述標(biāo)準(zhǔn)品0.01g（精確至0.00001g）于10mL容量瓶中，甲醇溶解并定容，得到濃度為1000mg/L的儲備液，-20℃避光貯存，有效期3個月。臨用時配置到適當(dāng)濃度。稀釋配置各那非類物質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)溶液，濃度分別為10、1、0.5、0.1、0.05mg/L。

2.3試驗方法

2.3.1SERS增強(qiáng)基底金和銀溶膠的制備

金溶膠及濃縮金溶膠的制備[10]：參考Frens經(jīng)典方法，往煮沸的100mL0.01%的氯金酸溶液中逐滴加入1mL1%的檸檬酸三鈉水溶液，顏色呈酒紅色后即制得金納米溶膠。準(zhǔn)確量取1.5mL金溶膠于1.5mL離心管中，以10000rpm/min轉(zhuǎn)速離心10min，去除上層透明水層，渦旋混勻即得濃縮金溶膠。

銀溶膠的制備[11]：參考Lee和Meisel的經(jīng)典方法，稱取18mg硝酸銀溶于100mL超純水中，煮沸后逐滴加入2mL1%的檸檬酸三鈉水溶液，再加熱1h后即制得銀納米溶膠。

2.3.2樣品前處理和SERS檢測方法

2.3.2.1玉米淀粉模擬固體保健品前處理

準(zhǔn)確稱取1.0g樣品于5mL試管中，加入5mL石油醚，振蕩20s后離心，取上清液于另一個5mL試管中，再加入1.0mL0.1mol/L稀鹽酸，振蕩后待SERS檢測。

2.3.2.2白酒模擬液體保健品前處理

準(zhǔn)確量取0.5mL樣品于10mL試管中，依次加入2mL0.1mol/L氫氧化鉀溶液和3mL二氯甲烷，振蕩20s，靜置分層，取1mL下層溶液于玻璃瓶中，將提取液在50℃的水浴下氮吹至全干，然后用400μL0.1mol/L稀鹽酸殘留物，振蕩后待SERS檢測。

2.3.2.3SERS檢測方法

他達(dá)拉非和氨基他達(dá)拉非：取200μL樣品于拉曼測試瓶中，加入50μL濃縮金溶膠，混勻后測試。其它8種那非類物質(zhì)：取200μL樣品于拉曼樣品池中，加入100μL銀溶膠，混勻后測試。

3結(jié)果與分析

3.110種那非類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS譜圖

那非類物質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)非常相似（圖1），使用高分辨率的激光拉曼可以對其固體粉末進(jìn)行常規(guī)拉曼表征。SERS檢測時溶液分子與納米顆粒之間的吸附強(qiáng)弱使得不同官能團(tuán)的振動譜峰增強(qiáng)或減弱，并伴有峰位置不同程度的偏移[12]。以西地那非、豪莫西地那非、羥基豪莫西地那非為例，結(jié)構(gòu)中哌嗪環(huán)4位上取代基甲基和乙基的區(qū)別并不能影響SERS的特征峰位置，這可能是因為甲基和乙基并不是吸附在納米顆粒表面的官能團(tuán)。如圖1A所示，三種西地那非類在650、819、928、1234、1401和1581cm-1附近均有相同的特征峰。其中，1234cm-1譜峰對應(yīng)于芳香化合物中=C-H面內(nèi)彎曲振動與SO2的對稱和不對稱伸縮，1581cm-1處的譜峰由苯環(huán)、氮雜環(huán)的C=C與C=N伸縮振動引起[13]。相似地，伐地那非和偽伐地那非譜峰位置均在650、1235、1591cm-1（圖1B）;他達(dá)拉非和氨基他達(dá)拉非用到的增強(qiáng)試劑是濃縮金溶膠，與其它那非類使用銀溶膠不同，譜峰位置相比其他差異較大，特征峰均在576、796、814、915、1234cm-1（圖1C）;紅地那非和那紅地那非的譜峰位置均在644、822、924、1241、1566cm-1（圖1D）。硫代艾地那非與其它那非類的結(jié)構(gòu)差異較大，主要特征峰在1108、1190、1270、1395cm-1（圖1E）。

由上可知不同類型的那非類物質(zhì)（西地那非類、紅地那非類、伐地那非類、他達(dá)拉非類和硫代艾地那非）雖部分特征峰重疊，但出現(xiàn)峰偏移，且某一兩處峰存在差異，故即使手持式拉曼光譜儀的分辨率不及臺式顯微拉曼，也可以將它們的類別區(qū)分開。比如對比圖1A和1D，西地那非類和紅地那非類的特征峰極度相似，但是紅地那非類在1241和1225cm-1處有兩個峰，西地那非類在1234cm-1有一個峰;對比圖1A和1B，伐地那非類在1300～1500cm-1的弱峰較西地那非類多。此外經(jīng)實驗發(fā)現(xiàn)，他達(dá)拉非類用銀溶膠測試無信號，而用濃縮金溶膠效果較好，故他達(dá)拉非類的信號明顯與其它那非類不同。因此我們可以通過SERS方法，借助手持式拉曼光譜儀區(qū)分保健品中添加的是哪一類那非類物質(zhì)。

3.2 10種那非類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液及加標(biāo)模擬樣品的最低檢測濃度

由高濃度到低濃度測試10種那非類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液（濃度分別為10、1、0.5、0.1、0.05、0 mg/L），SERS信號隨著標(biāo)準(zhǔn)品溶液濃度的減小逐漸減弱，直至無法檢出。各那非類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液最低檢測濃度詳見表1（第一列）。

模擬樣品選用固體和液體兩種基質(zhì)進(jìn)行制備，固體基質(zhì)為玉米淀粉，液體基質(zhì)為白酒（基質(zhì)經(jīng)質(zhì)譜驗證均不含以上10種那非類物質(zhì)）。取空白基質(zhì)若干份，分別添加濃度為200、100、50、10、5、0μg/mL 那非類物質(zhì)準(zhǔn)品至空白樣本中，按照分析步驟進(jìn)行測定，觀察檢測結(jié)果，SERS信號隨著加標(biāo)濃度的減小逐漸減弱，直至無法檢出。經(jīng)實驗確定的兩種基質(zhì)的最低檢測濃度結(jié)果詳見表1（第三、四列）。玉米淀粉和白酒中10種那非類物質(zhì)檢測限濃度的SERS譜圖分別如圖2A、2B所示。

表1和圖2均說明，不同那非類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的SERS測試增強(qiáng)效果不同，這與分子與納米粒子表面的有效吸附相關(guān)[14]。即使同一類那非類物質(zhì)，功能基團(tuán)的略微差異也會影響峰的強(qiáng)弱，比如豪莫西地那非和羥基豪莫西地那非標(biāo)準(zhǔn)溶液的結(jié)構(gòu)略微差異致使最低檢測濃度不同。至于模擬樣品，液體基質(zhì)對紅地那非類影響較大，相反固體基質(zhì)對他達(dá)拉非類影響較大。但是整體來看基質(zhì)的影響使得SERS檢測限濃度相比標(biāo)準(zhǔn)品溶液提高一到兩個數(shù)量級，這是因為基質(zhì)干擾了那非類物質(zhì)在納米粒子表面的吸附，形成一種競爭吸附的模式，為此影響了分子間的應(yīng)力或氫鍵作用力、分子吸附位點等。比如圖2中兩種基質(zhì)對伐地那非的干擾小于偽伐地那非，故在相同加標(biāo)濃度下，偽伐地那非的SERS信號遠(yuǎn)弱于伐地那非。

3.3快速檢測方法評價

依據(jù)《食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范》（食藥監(jiān)辦科[2017]43號）的要求，對建立的10種那非類物質(zhì)SERS快檢方法進(jìn)行方法學(xué)考察，在檢出限水平附近設(shè)置固體/液體陰性對照樣品、0.5倍檢測限濃度水平樣品、檢測限濃度水平樣品、2倍檢測限濃度水平樣品。固體和液體基質(zhì)分開進(jìn)行評價，評價結(jié)果詳見表2。

3.3.1檢測限

由3.2可知10種那非類物質(zhì)在加標(biāo)固體和液體模擬樣品中的檢測限，詳見表1（第三、四列）。

3.3.2假陰性率和假陽性率

制備固體基質(zhì)（玉米淀粉）、液體基質(zhì)（白酒）在檢出限水平的加標(biāo)樣品，每種那非類物質(zhì)分加標(biāo)制備6份，故固體基質(zhì)陽性樣品共計60份，液體基質(zhì)陽性樣品共計60份。同時分別制備固體和液體空白樣品各5份，陰性樣品共計10份。

固體基質(zhì)陽性樣品有1份樣品未檢出，假陰性率為1.67%;固體陰性樣品均未檢出，假陽性率為0%。液體基質(zhì)陽性樣品有2份樣品未檢出，假陰性率為3.33%;液體陰性樣品檢測均未檢出，假陽性率為0%。

3.3.3特異性

在檢出限水平陰性樣品均未出現(xiàn)陽性結(jié)果，故那非類物質(zhì)在玉米淀粉和白酒模擬樣品中的特異性均為100%，如表2所示，符合食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范要求。

3.3.4與現(xiàn)有方法一致性分析

將本研究方法與市場監(jiān)管局發(fā)布的《食品中那非類物質(zhì)的測定（BJS 201805）》食品補(bǔ)充檢驗方法（超高效液相色譜-三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法）[15]所得到的陽性結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗，具體結(jié)果可見表2種顯著性差異（x2）所示，這兩種方法在5%置信區(qū)間內(nèi)沒有顯著性差異（x2=<3.84），符合食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范的要求。

4結(jié)論

本文借助手持式拉曼光譜儀對10種那非類物質(zhì)同時進(jìn)行SERS檢測，經(jīng)過篩選他達(dá)拉非類使用濃縮金溶膠作為增強(qiáng)試劑，其它那非類使用銀溶膠。隨之進(jìn)一步探究不同那非類物質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液的最低檢測濃度為0.1～1 mg/L，以及加標(biāo)玉米淀粉和白酒模擬樣品的檢測限為10～100mg/kg。在此基礎(chǔ)上，對該方法的假陰性率和假陽性率、特異性等進(jìn)行了評價，均符合食品快速檢測方法評價技術(shù)規(guī)范。該方法具備現(xiàn)場可移動、快速、準(zhǔn)確、簡單等優(yōu)點，相信未來能成為保健品中那非類物質(zhì)快速檢測的有效手段之一。

參考文獻(xiàn)

[1]Cheitlin M.D.， Hutter A.M.， Jr.， Brindis R.G.， et al. Use of sildenafil （Viagra） in patients with cardiovascular disease. Circulation. 1999; 99：168–177.

[2]Man C.N.， Nor N.M.， Lajis R.， et al. Identification of sildenafil， tadalafil and vardenafil by gas chromatography–mass spectrometry on short capillary column. J. Chromatogr. A. 2009; 1216：8426–8430.

[3]Al-Hroub H.， Alkhawaja B.， Alkhawaja E.， et al. Sensitive and rapid HPLC-UV method with back-extraction step for the determination of sildenafil in human plasma. J. Chromatogr. B Analyt. Technol. Biomed. Life Sci. 2016; 1009–1010：1–6.

[4]黃芳，吳惠勤，黃曉蘭等.高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定保健品及中成藥中非法添加的17種壯陽類化學(xué)藥[J].色譜，2016，34（3）：270-278.

[5]伍林，歐陽兆輝，曹淑超等.拉曼光譜技術(shù)的應(yīng)用及研究進(jìn)展[J].光散射學(xué)報，2015，17（2）：180-186.

[6]劉元瑞，葛海生，趙康虎等.薄層原位表面增強(qiáng)拉曼光譜法檢測中成藥和保健品中添加的西地那非[J].藥物分析雜志，2014，34（7）：1241-1246.

[7]鄭娟梅，余婉松，覃文霞等.表面增強(qiáng)拉曼光譜快速檢測保健酒中西地那非的研究[J].食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報，2018，11（9）：5659-5665

[8]王紅梅，李玲玲，陳海濱等.表面增強(qiáng)拉曼光譜對西地那非類物質(zhì)的快速檢測[J].高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2017，38（6）：1040-1045.

[9]吳國萍，周亞紅，李靜泉等.表面增強(qiáng)拉曼光譜測定保健品中非法添加西地那非[J].食品工業(yè)科技，2019，40（11）：254-259，264.

[10]G. Frens. Controlled nucleation for the regulation of the particle size in monodisperse gold suspensions[J]. Nature Physical Science， 1973， 241（1）： 20-22.

[11]Lee，P.C. & Meisel，D.Adsorption and surface-enhanced Raman of dyes on silver and gold sols. J. Phys. Chem.1982， 86： 3391-3395.

[12]Fleischmann M， Hendra P J， and Mc Quillan A J. Raman spectra of pyridine adsorbed at a silver electrode[J]. Chemical Physics Letters， 1974， 26： 163-165.

[13]王玉，曹玲，羅疆南.顯微共聚焦拉曼光譜法檢測非法添加的化學(xué)壯陽藥[J].中國藥學(xué)雜質(zhì)，2011，46（10）：789-792.

[14]R. A. Alvarez-Puebla and L. M. Liz-Marzan. Traps and cages for universal SERS detection[J].Chemical Society Reviews， 2012， 41（1）： 43-51.

[15]國家食品藥品監(jiān)督管理局.國家補(bǔ)充檢驗方法BJS201805食品中那非類物質(zhì)的測試[S].2018.

作者簡介

余婉松：1990.02，女，漢族，湖北省丹江口市人，上海海洋大學(xué)，碩士學(xué)歷，食品科學(xué)與工程專業(yè)，畢業(yè)至今一直從事手持光譜儀器在食品安全檢測中方法開發(fā)及應(yīng)用技術(shù)支持等工作。

賽默飛世爾科技（中國）有限公司 上海 201206