• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    黑皮油松松針精油的超聲波輔助-鹽析-水蒸氣蒸餾法提取及其抑菌效果和穩(wěn)定性1)

    2018-10-23 11:26:08包怡紅劉文麗
    關(guān)鍵詞:黑皮松針油松

    包怡紅 劉文麗

    (東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040)

    Ultrasonic-assisted salting-out hydrodistillation extraction method was used to extract essential oil of Pinus tabulaeformis needles. By using single factor experiment, the extraction conditions of P. tabulaeformis needles oil were optimized by orthogonal method. Combined with the disc diffusion method and microatmosphere test the antibacterial activity of essential oil of P. tabulaeformis needles were determined. Double dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC). The effects of pH, temperature and ultraviolet on the antibacterial effect of essential oil of P. tabulaeformis needles were studied. The optimum extraction conditions of essential oil of P. tabulaeformis needles are ultrasonic power of 240 W, ultrasonic time of 60 min, NaCl of 4%, and extraction time of 5 h. Three times of verification experiments show that the yield of P. tabulaeformis needles oil is 0.388 2%. P. tabulaeformis needles oil has inhibitory effects on all three strains of bacteria, and has little antibacterial effect on Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus oryzae. MICs of essential oil to Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Escherichia coli are 5, 10 and 20 μL/mL, respectively. The essential oils has good stability to temperature and ultraviolet radiation, and their antibacterial activity was unstable under different pH conditions. Antibacterial activity was strong in acid and weak in base solution.

    黑皮油松(Pinustabulaeformis)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物,其葉為松針,常被用于醫(yī)藥以及食品添加劑領(lǐng)域,具有活血安神、消炎止癢之功效[1],主要分布在中國(guó)東北地區(qū)。經(jīng)查閱文獻(xiàn),對(duì)松針的研究集中在化學(xué)成分[2]、黃酮提取[3]、藥理[4]、莽草酸提取及腫瘤治療[5]等幾個(gè)方面,而在松針精油提取和抑菌活性方面的研究報(bào)道很少。王得道[2]運(yùn)用了水蒸氣蒸餾法提取黑皮油松松針精油,并且測(cè)得了主要成分是烯烴類(lèi)和芳香類(lèi),其中石竹烯含量最高。超聲波輔助處理可以產(chǎn)生空化效應(yīng)和機(jī)械剪切效應(yīng),加快分子的運(yùn)動(dòng),使萃取成分與溶劑充分混合,有助于內(nèi)容物的溶出[6-7]。鹽析效應(yīng)是為了強(qiáng)化有機(jī)物的分離效果,在水蒸氣蒸餾中加入某種無(wú)機(jī)鹽,在含水體系中,鹽可以通過(guò)親和力“氫鍵”離子的靜電等作用與溶液中某種組分發(fā)生優(yōu)先溶劑化反應(yīng),形成難揮發(fā)的化合物,從而減少了該組分與另一組分之間的吸引作用[8]。

    植物精油具有良好的抑菌抗炎活性[9],由于現(xiàn)有的化學(xué)抑菌劑副作用較大,精油作為天然成分更適合用于食品的保鮮防腐。本試驗(yàn)采用超聲波鹽析輔助的方法提取黑皮油松松針中的精油,且以精油得率為指標(biāo),采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),進(jìn)行最佳工藝條件的確定,并對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等微生物的抑制作用進(jìn)行了研究,此外,還探討了熱處理、pH值和紫外線照射條件對(duì)精油抑菌穩(wěn)定性的影響,對(duì)開(kāi)發(fā)天然食品防腐劑及保鮮劑具有重大的意義,為黑皮油松松針精油的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供新途徑。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    黑皮油松松針采于東北林業(yè)大學(xué)校園,將其晾干后用萬(wàn)能粉碎機(jī)打碎;NaCl固體購(gòu)于天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;牛肉膏、蛋白胨、營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;吐溫-80購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供;葡萄糖購(gòu)于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、金黃色葡萄球菌(S.auTeus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、米曲霉(Aspergillus),所有供試菌種均來(lái)源于東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

    水蒸氣蒸餾裝置實(shí)驗(yàn)室自備;電子天平購(gòu)于常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司;高速多功能粉碎機(jī)購(gòu)于上海市頂帥工貿(mào)有限公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)于昆山市超聲儀器有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于天津市泰斯特儀器有限公司;恒溫水浴鍋購(gòu)于上海一恒科技有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    黑皮油松松針精油的提取:稱(chēng)取50 g粉碎后的黑皮油松松針置于圓底燒瓶中,加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl溶液在不同的超聲功率下處理一定的時(shí)間,回流后收集稱(chēng)其質(zhì)量,重復(fù)3次,精油提取率按(1)式計(jì)算。

    (1)

    式中:E為精油得率(%);m1為精油質(zhì)量(g);m2為松針質(zhì)量(g)。

    超聲功率的影響:稱(chēng)量粉碎后的黑皮油松松針?lè)?0 g,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的條件下,分別在180、210、240、270、300 W超聲功率下處理30 min,水蒸氣蒸餾3 h后,計(jì)算得率。

    超聲時(shí)間的影響:稱(chēng)量粉碎后的黑皮油松松針?lè)?0 g,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,超聲功率為270 W的條件下,分別處理15、30、45、60、75 min,水蒸氣蒸餾3 h后,計(jì)算得率。

    NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響:稱(chēng)量粉碎后的黑皮油松松針?lè)?0 g,超聲功率為270 W的條件下,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%,超聲處理30 min,水蒸氣蒸餾3 h后,計(jì)算得率。

    蒸餾時(shí)間的影響:稱(chēng)量粉碎后的黑皮油松松針?lè)?0 g,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,超聲功率為270 W的條件下,分別進(jìn)行水蒸氣蒸餾1、2、3、4、5 h后,計(jì)算得率。

    正交試驗(yàn):在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)超聲功率、超聲時(shí)間、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蒸餾時(shí)間4因素的L9(34)正交實(shí)驗(yàn),確定黑皮油松松針精油最佳提取工藝條件。

    1.3 精油抑菌試驗(yàn)

    菌懸液的制備:取活化之后的菌體于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中,細(xì)菌于37 ℃中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用平板計(jì)數(shù)法將菌懸液調(diào)整濃度為每毫升106~107個(gè)菌落群,真菌于28 ℃中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,并用血球計(jì)數(shù)法調(diào)整菌的濃度至每毫升106~107個(gè)菌落群,備用[10]。

    黑皮油松松針精油的制備:將精油溶于滅菌后的吐溫-80溶液中制備成體積分?jǐn)?shù)為10%的精油溶液,置于4 ℃中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

    黑皮油松松針精油液相抑菌活性的測(cè)定:根據(jù)文獻(xiàn)[11],測(cè)定黑皮油松松針精油對(duì)5種供試菌的抑菌活性。在無(wú)菌條件下,將培養(yǎng)基倒入滅過(guò)菌的平板后冷卻凝固,取100 μL菌懸液于培養(yǎng)基上并涂布均勻,取4片滅好菌的濾紙片(直徑為6 mm)放置于含菌平板上,其中3片滴加10 μL體積分?jǐn)?shù)為10%的精油溶液,另外1片以10 μL吐溫-80溶液作為對(duì)照,細(xì)菌放置于37 ℃中培養(yǎng)24 h,真菌放置于28 ℃中培養(yǎng)48 h。多次試驗(yàn)后用交叉法測(cè)得抑菌圈的直徑大小。

    最低抑菌體積分?jǐn)?shù)測(cè)定:根據(jù)文獻(xiàn)[12],取4 mL液體培養(yǎng)基加入滅完菌的試管中,再加入1 mL用吐溫-80溶液倍比稀釋過(guò)的黑皮油松松針精油溶液,使得精油的體積分?jǐn)?shù)為0.625~40 mL/L,以1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫-80溶液作為對(duì)照,每支試管中加入菌懸液100 μL,振蕩搖勻后將其置于37 ℃中恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。從各試管中分別取100 μL于平板上并涂布均勻,放于37 ℃培養(yǎng)24 h。

    黑皮油松松針精油氣相抑菌活性的測(cè)定:根據(jù)文獻(xiàn)[13],取100 μL菌液于培養(yǎng)基上并涂布均勻,取一片直徑大小為25 mm的濾紙片置于培養(yǎng)皿蓋中央,向?yàn)V紙片中滴加50 μL的純精油,以50 μL無(wú)菌水作為對(duì)照,將培養(yǎng)皿密封置于37 ℃中培養(yǎng)24 h。

    溫度對(duì)黑皮油松松針精油抑菌效果的影響:將體積分?jǐn)?shù)10%的精油置于20、40、60、80、100 ℃處理15 min,空白組不進(jìn)行處理,進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

    pH值對(duì)黑皮油松松針精油抑菌效果的影響:用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaOH溶液和體積分?jǐn)?shù)50%的檸檬酸將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80的pH值分別調(diào)為4、5、6、7、8、9、10,再將精油稀釋至體積分?jǐn)?shù)10%,空白組不進(jìn)行處理,同時(shí)設(shè)置不同pH值的吐溫-80溶液為對(duì)照組,進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

    紫外線對(duì)黑皮油松松針精油抑菌效果的影響:將體積分?jǐn)?shù)為10%的精油分別在紫外燈(功率為20 W,垂直距離35 cm)下處理10、20、30、40、50、60 min,空白組不進(jìn)行處理,進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

    數(shù)據(jù)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有數(shù)據(jù)利用Word2016、Excel2016、SPSS 22.0、Origin 8.0統(tǒng)計(jì)和繪圖,進(jìn)行數(shù)據(jù)方差顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素對(duì)黑皮油松松針精油提取率的影響

    超聲功率對(duì)黑皮油松松針精油得率的影響:由表1可知,隨著超聲功率的改變,精油得率先上升后下降。其原因可能是超聲功率增大導(dǎo)致空化作用也逐漸增強(qiáng),加速了細(xì)胞的破碎速度,使得精油有效成分加快滲出,精油得率提高;但當(dāng)超聲功率過(guò)大時(shí)則空化效應(yīng)增強(qiáng)的幅度過(guò)大,使得精油更多得損失于水介質(zhì)中。

    表1 超聲功率對(duì)精油得率的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

    超聲時(shí)間對(duì)黑皮油松松針精油得率的影響:由表2可知,隨著超聲時(shí)間的增加,精油的得率也相對(duì)增加,當(dāng)超聲時(shí)間到達(dá)45 min時(shí),黑皮油松的得率基本趨于穩(wěn)定并且有所下降。這與李敏杰等[14]使用超聲波輔助提取葛縷子精油的結(jié)果一致,這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的增加,細(xì)胞的破碎程度增加,有助于精油進(jìn)入溶劑中,隨著時(shí)間的增長(zhǎng),超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)加速升高溫度,使得精油中易揮發(fā)氧化的物質(zhì)損失,因此精油得率開(kāi)始下降。

    表2 超聲時(shí)間對(duì)精油得率的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

    NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黑皮油松松針精油得率的影響:由表3可知,精油的得率隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加也相對(duì)增加,但是當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)4%,精油得率就開(kāi)始減少。這與閆旭宇等[15]鹽析輔助提取靈香草精油結(jié)果一致,精油得率隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加,超過(guò)4%時(shí),精油得率開(kāi)始下降。這可能是由于加入無(wú)機(jī)鹽可增大細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓,更易于精油的溶出,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)精油提取率下降主要是因?yàn)辂}濃度升高,水蒸汽沸點(diǎn)升高而蒸餾溫度升高,導(dǎo)致精油損失增加[16]。

    蒸餾時(shí)間對(duì)黑皮油松松針精油得率的影響:由表4可知,當(dāng)蒸餾時(shí)間從1 h到4 h時(shí),隨著時(shí)間的增長(zhǎng),精油的得率不斷升高,當(dāng)?shù)竭_(dá)4 h之后精油得率趨于平穩(wěn)并且開(kāi)始有所下降,原因是隨著時(shí)間的增長(zhǎng),精油中不穩(wěn)定的成分發(fā)生損失,使得精油得率下降。

    表3 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)精油得率的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

    表4 蒸餾時(shí)間對(duì)精油得率的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

    2.2 超聲波鹽析輔助提取黑皮油松松針精油的條件優(yōu)化

    結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,以超聲功率、超聲時(shí)間、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蒸餾時(shí)間為影響因素,以提取率為考察指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),因素水平見(jiàn)表5。

    9組正交試驗(yàn)獲得的精油得率分別為0.293 2%、0.321 8%、0.337 4%、0.385 9%、0.359 7%、0.368 9%、0.352 6%、0.366 1%、0.382 6%。由各因素極差R的大小可知,RA>RC>RB>RD,影響得率的因素由大到小是超聲功率、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、蒸餾時(shí)間,超聲功率為主要影響因素,蒸餾時(shí)間為不重要因素。由k值可得,最佳水平為A2B3C2D3,即超聲功率為240 W,超聲時(shí)間為60 min,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%,蒸餾時(shí)間為5 h,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),設(shè)置3組平行試驗(yàn),最終得到黑皮油松松針精油得率為0.388 2%(n=3)。本試驗(yàn)優(yōu)化提取的黑皮油松松針精油得率高于王得道[2]研究的得率0.254%,這說(shuō)明超聲波和鹽析輔助有助于精油得率的提高。

    表5 正交試驗(yàn)因素水平

    2.3 黑皮油松松針精油抑菌活性

    黑皮油松松針精油的液相抑菌活性:黑皮油松松針精油對(duì)5種微生物的液相抑制作用結(jié)果見(jiàn)表6,對(duì)3種細(xì)菌均表現(xiàn)出抑菌效果,對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng),對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用居中,抑制作用最弱的為大腸桿菌,這可能是由于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁較革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁更為復(fù)雜,能夠阻止精油的抑菌成分進(jìn)入細(xì)胞中,起到保護(hù)的作用;對(duì)釀酒酵母和米曲霉的抑菌效果較差,幾乎沒(méi)有檢測(cè)到抑菌圈。

    表6 黑皮油松松針精油的液相抑菌生物活性測(cè)定結(jié)果

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;“—”表示無(wú)抑菌效果。

    黑皮油松松針精油的最低抑菌體積分?jǐn)?shù):由于抑菌圈試驗(yàn)表明黑皮油松松針精油對(duì)酵母菌和米曲霉抑菌效果不明顯,因此選取了對(duì)精油較敏感的3種細(xì)菌進(jìn)行了最低抑菌濃度的測(cè)定,后面試驗(yàn)均以這3種菌作為研究對(duì)象。

    由表7可以看出,黑皮油松松針精油對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌最低抑菌體積分?jǐn)?shù)分別是5、10、20 mL/L,可見(jiàn)精油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好。

    表7 黑皮油松松針精油對(duì)供試菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)

    黑皮油松松針精油的氣相抑菌活性:結(jié)果見(jiàn)表8,黑皮油松松針精油對(duì)3種供試菌均具有抑菌效果,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng),枯草芽孢桿菌次之,作用最弱的為大腸桿菌。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌作用比革蘭氏陰性菌強(qiáng),但抑制金黃色葡萄球菌的作用強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。這種差異可能是由于液相抑菌法是直接接觸測(cè)定法,其主要取決于擴(kuò)散性和溶解度,而氣相抑菌則主要依賴于精油化合物的揮發(fā)性[17]。

    表8 黑皮油松松針精油的氣相抑菌生物活性測(cè)定結(jié)果

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;“—”表示無(wú)抑菌效果。

    溫度對(duì)黑皮油松松針精油抑菌活性的影響:由表9可見(jiàn),在20,40,60,80,100 ℃下處理后,與對(duì)照組相比,黑皮油松松針精油的抑菌活性基本維持穩(wěn)定。這與王步江等[18]人的研究結(jié)果一致。這表明加熱并沒(méi)有使精油中的抑菌成分發(fā)生改變,黑皮油松松針精油的有效成分對(duì)溫度的耐受性較好。

    表9 溫度對(duì)黑皮油松精油抑菌活性的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

    酸堿環(huán)境對(duì)黑皮油松松針精油抑菌活性的影響:由表10可見(jiàn),pH值的改變會(huì)影響黑皮油松松針精油對(duì)細(xì)菌的抑制作用。在pH值<8時(shí),隨著pH值的降低,抑菌圈增大,在pH值>8時(shí),隨著pH值的增大,抑菌圈稍有增大。對(duì)照組在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿時(shí)表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌的抑制作用。這與劉玉民等[19]人的試驗(yàn)結(jié)果一致。精油在低pH條件下抑菌活性增強(qiáng)是由于在酸性條件下細(xì)菌自身的生理活性降低,同時(shí)精油的活性成分的結(jié)構(gòu)形式也發(fā)生改變,即pH值的降低能夠使精油中酚類(lèi)化合物上所帶羥基的電離度降低,疏水性增強(qiáng),更易于與細(xì)菌的細(xì)胞膜和脂蛋白相結(jié)合,從而提高抑菌活性[20]。pH值>8時(shí),細(xì)菌在堿性條件下不易于生長(zhǎng)導(dǎo)致抑菌能力的增強(qiáng)。因此,在酸性條件下精油的具有更好的抑菌作用。

    表10 pH值對(duì)黑皮油松松針精油抑菌活性的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

    紫外線照射對(duì)黑皮油松松針精油的抑菌活性的影響:由表11可見(jiàn),紫外線分別照射10,20,30,40,50,60 min之后,與對(duì)照組相比,黑皮油松松針精油的抑菌活性并未發(fā)生顯著的變化。這與李婭男等[21]人研究的紫外線對(duì)4種精油穩(wěn)定性的影響的結(jié)果一致。這表明黑皮油松松針精油對(duì)紫外線具有較高的穩(wěn)定性,紫外線對(duì)精油的成分及其結(jié)構(gòu)沒(méi)有產(chǎn)生影響。

    表11 紫外線對(duì)黑皮油松松針精油抑菌活性的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

    3 結(jié)論

    黑皮油松松針精油的最優(yōu)提取條件是:超聲功率240 W,超聲時(shí)間60 min,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%,蒸餾時(shí)間5 h,選用50 g粉碎完成的黑皮油松松針,按照試驗(yàn)得出的條件,重復(fù)3次試驗(yàn)得出精油平均得率為0.388 2%。

    黑皮油松松針精油抑菌活性試驗(yàn)得出,黑皮油松精油在液相和氣相方面均表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌較好的抑制作用,且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陰性菌,對(duì)釀酒酵母和米曲霉的抑菌效果不明顯。

    黑皮油松松針精油對(duì)溫度和紫外線的耐受性較好,這種較好的穩(wěn)定性有利于精油的開(kāi)發(fā)利用。而pH值對(duì)其的抑菌效果產(chǎn)生了影響,在pH值較小的環(huán)境中抑菌效果較好,隨著pH值的增大效果減弱,因此在酸性食品的加工中有很好的應(yīng)用前景。

    猜你喜歡
    黑皮松針油松
    松針
    都市(2023年6期)2023-12-28 07:56:52
    油松容器育苗技術(shù)
    松針掃把
    雪天
    北方油松育苗技術(shù)
    闖禍的車(chē)
    黑皮系列
    油松種植技術(shù)及主要病蟲(chóng)害的防治對(duì)策
    松針入藥驗(yàn)方選
    中老年健康(2015年5期)2015-05-30 06:21:18
    都是話多惹的禍
    成人国语在线视频| 久久久久久久精品精品| 国产精品一区二区在线不卡| 99久久精品一区二区三区| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 久久精品国产亚洲网站| 欧美日韩综合久久久久久| 熟女电影av网| 国产在线一区二区三区精| 中国三级夫妇交换| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 免费观看的影片在线观看| 国产欧美另类精品又又久久亚洲欧美| www.av在线官网国产| 在现免费观看毛片| 男女啪啪激烈高潮av片| 欧美日本中文国产一区发布| 成人午夜精彩视频在线观看| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 大话2 男鬼变身卡| 国产一区有黄有色的免费视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 日日啪夜夜爽| 午夜福利视频精品| 制服诱惑二区| 久久这里有精品视频免费| 午夜福利影视在线免费观看| 精品久久蜜臀av无| 国产熟女欧美一区二区| 中文字幕久久专区| 国产精品嫩草影院av在线观看| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 少妇被粗大猛烈的视频| 三上悠亚av全集在线观看| 国产精品偷伦视频观看了| 久久精品国产亚洲av天美| 中文字幕最新亚洲高清| 国产免费一级a男人的天堂| 乱人伦中国视频| av国产久精品久网站免费入址| 街头女战士在线观看网站| 久久久久国产网址| 成年av动漫网址| 日韩视频在线欧美| 国产女主播在线喷水免费视频网站| 一区二区av电影网| 久久韩国三级中文字幕| 亚洲人成网站在线播| 欧美激情 高清一区二区三区| 国产成人精品久久久久久| 亚洲美女视频黄频| 最近中文字幕高清免费大全6| 久久久久国产精品人妻一区二区| 黄色欧美视频在线观看| 久久99一区二区三区| 国产成人91sexporn| 久久97久久精品| 国产乱来视频区| 日韩电影二区| 精品人妻偷拍中文字幕| 午夜久久久在线观看| 亚洲欧美清纯卡通| 又黄又爽又刺激的免费视频.| 国产精品.久久久| 欧美精品一区二区免费开放| 日本av手机在线免费观看| 97精品久久久久久久久久精品| 男人添女人高潮全过程视频| 欧美精品一区二区大全| 亚洲av.av天堂| 日韩成人av中文字幕在线观看| 最近2019中文字幕mv第一页| kizo精华| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 亚洲欧洲日产国产| a级毛色黄片| 国产又色又爽无遮挡免| 国产黄频视频在线观看| 一区二区三区四区激情视频| 亚洲精品一区蜜桃| 欧美日韩一区二区视频在线观看视频在线| 亚洲av福利一区| 国产亚洲精品久久久com| 极品少妇高潮喷水抽搐| 永久免费av网站大全| 久久人人爽人人爽人人片va| av女优亚洲男人天堂| 日韩电影二区| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲色图综合在线观看| 亚洲精品中文字幕在线视频| 成人免费观看视频高清| 国产国语露脸激情在线看| 高清不卡的av网站| 国产日韩欧美亚洲二区| 日本黄大片高清| 777米奇影视久久| 99久国产av精品国产电影| 免费黄频网站在线观看国产| 边亲边吃奶的免费视频| 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 免费av中文字幕在线| 久久久久人妻精品一区果冻| 国产黄片视频在线免费观看| 夜夜骑夜夜射夜夜干| 久久精品久久精品一区二区三区| 一区二区三区四区激情视频| 中文字幕最新亚洲高清| 2018国产大陆天天弄谢| 97在线视频观看| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 久久综合国产亚洲精品| 亚洲av电影在线观看一区二区三区| 中文字幕最新亚洲高清| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 视频中文字幕在线观看| 日本av手机在线免费观看| 中文字幕av电影在线播放| 丝袜美足系列| 一区二区三区免费毛片| 卡戴珊不雅视频在线播放| 少妇的逼水好多| 99精国产麻豆久久婷婷| 国产精品一国产av| 日韩av免费高清视频| 久久青草综合色| 国内精品宾馆在线| 91精品国产九色| 考比视频在线观看| 人妻夜夜爽99麻豆av| 美女主播在线视频| 十分钟在线观看高清视频www| 美女xxoo啪啪120秒动态图| 99久久精品国产国产毛片| 91精品国产九色| 欧美97在线视频| 看十八女毛片水多多多| 午夜激情久久久久久久| 欧美丝袜亚洲另类| 久久鲁丝午夜福利片| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 18禁裸乳无遮挡动漫免费视频| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 午夜免费观看性视频| av在线观看视频网站免费| av一本久久久久| 日韩一区二区三区影片| 国产成人精品在线电影| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 一级黄片播放器| 不卡视频在线观看欧美| 亚州av有码| 精品人妻熟女av久视频| 国产成人freesex在线| 亚洲av成人精品一二三区| 高清欧美精品videossex| 午夜免费观看性视频| 中文欧美无线码| 国产高清有码在线观看视频| 日本欧美视频一区| 国产一区二区三区av在线| 观看美女的网站| 久久久久久久久久久丰满| 在线看a的网站| 男女国产视频网站| 如何舔出高潮| 国产成人精品久久久久久| 亚洲欧洲精品一区二区精品久久久 | 老司机影院成人| 国产又色又爽无遮挡免| 国产 一区精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 亚洲精品av麻豆狂野| 国产探花极品一区二区| 91国产中文字幕| 成人18禁高潮啪啪吃奶动态图 | 中文字幕精品免费在线观看视频 | 内地一区二区视频在线| 夜夜爽夜夜爽视频| 人妻一区二区av| 日本-黄色视频高清免费观看| 视频在线观看一区二区三区| 2022亚洲国产成人精品| 成人午夜精彩视频在线观看| 欧美变态另类bdsm刘玥| 女人久久www免费人成看片| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 蜜臀久久99精品久久宅男| 成人国产麻豆网| 欧美少妇被猛烈插入视频| 欧美 亚洲 国产 日韩一| 久久精品国产a三级三级三级| 国产精品人妻久久久久久| 成人毛片60女人毛片免费| 午夜激情久久久久久久| 老司机影院成人| 国产在线一区二区三区精| 国产 一区精品| xxxhd国产人妻xxx| 美女视频免费永久观看网站| 久久婷婷青草| 中文天堂在线官网| 国产精品人妻久久久影院| 日韩欧美精品免费久久| 午夜精品国产一区二区电影| 欧美人与善性xxx| 亚洲色图 男人天堂 中文字幕 | 免费观看a级毛片全部| 国产精品一区二区在线不卡| 国内精品宾馆在线| 久久久久久久久久久丰满| 91成人精品电影| 99re6热这里在线精品视频| 亚洲欧美精品自产自拍| 日韩精品有码人妻一区| 亚洲国产精品一区三区| 少妇人妻精品综合一区二区| av在线app专区| 国产成人freesex在线| 视频在线观看一区二区三区| 精品久久久久久久久av| 人妻人人澡人人爽人人| 国产精品蜜桃在线观看| 赤兔流量卡办理| 永久免费av网站大全| 中国三级夫妇交换| av天堂久久9| 国产一区二区三区综合在线观看 | 晚上一个人看的免费电影| 一个人免费看片子| 欧美激情国产日韩精品一区| 男的添女的下面高潮视频| 日日撸夜夜添| 日本av手机在线免费观看| 天堂俺去俺来也www色官网| 99热这里只有精品一区| 久久这里有精品视频免费| 欧美三级亚洲精品| 亚洲国产av新网站| 精品国产国语对白av| 女的被弄到高潮叫床怎么办| 国产探花极品一区二区| av免费观看日本| 久久青草综合色| 亚洲av成人精品一区久久| 亚洲熟女精品中文字幕| 麻豆精品久久久久久蜜桃| av.在线天堂| 国产av国产精品国产| 国产av一区二区精品久久| 亚洲av男天堂| 自线自在国产av| 这个男人来自地球电影免费观看 | 精品人妻偷拍中文字幕| 99九九在线精品视频| 另类亚洲欧美激情| 亚洲精品色激情综合| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产永久视频网站| 99久国产av精品国产电影| 女性生殖器流出的白浆| 中国三级夫妇交换| 91精品伊人久久大香线蕉| 亚洲精品久久久久久婷婷小说| 欧美bdsm另类| 日日爽夜夜爽网站| 少妇 在线观看| 亚洲第一av免费看| 国产精品久久久久久久电影| 97超视频在线观看视频| 不卡视频在线观看欧美| 男女啪啪激烈高潮av片| 久久久久视频综合| 视频中文字幕在线观看| 婷婷色av中文字幕| 欧美三级亚洲精品| 亚洲精品久久午夜乱码| 久久久久精品性色| 伊人久久精品亚洲午夜| 精品午夜福利在线看| 国内精品宾馆在线| 国产免费又黄又爽又色| 男女啪啪激烈高潮av片| 日本爱情动作片www.在线观看| 中文字幕人妻熟人妻熟丝袜美| 国产永久视频网站| 亚洲精品久久午夜乱码| 国产亚洲精品第一综合不卡 | 午夜免费男女啪啪视频观看| 成人毛片60女人毛片免费| 成人国语在线视频| 热99国产精品久久久久久7| 51国产日韩欧美| 男女无遮挡免费网站观看| 寂寞人妻少妇视频99o| 久久久久精品久久久久真实原创| 97在线视频观看| 菩萨蛮人人尽说江南好唐韦庄| 成人黄色视频免费在线看| 男人爽女人下面视频在线观看| 99久久精品一区二区三区| 国产免费视频播放在线视频| 日韩三级伦理在线观看| 少妇的逼好多水| 少妇猛男粗大的猛烈进出视频| 美女内射精品一级片tv| 国产 精品1| 亚洲人成网站在线观看播放| 国产免费现黄频在线看| 国产熟女午夜一区二区三区 | 国产无遮挡羞羞视频在线观看| 另类亚洲欧美激情| 人人妻人人爽人人添夜夜欢视频| 国产有黄有色有爽视频| 亚洲精品色激情综合| 亚洲色图综合在线观看| 久久99热6这里只有精品| 99久久人妻综合| 男女无遮挡免费网站观看| 天天操日日干夜夜撸| 亚洲国产av新网站| 观看av在线不卡| 桃花免费在线播放| 亚洲欧美日韩卡通动漫| 国产精品久久久久成人av| 久久久久久久亚洲中文字幕| 国产日韩欧美亚洲二区| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 国产成人一区二区在线| 我的老师免费观看完整版| 成人黄色视频免费在线看| 天美传媒精品一区二区| 内地一区二区视频在线| 伦理电影大哥的女人| 欧美日韩精品成人综合77777| 18禁在线无遮挡免费观看视频| 97超碰精品成人国产| 日韩制服骚丝袜av| 久久久久久久精品精品| 男人添女人高潮全过程视频| 亚洲第一区二区三区不卡| 国产一区二区在线观看av| 亚洲av福利一区| 国产精品一区www在线观看| 少妇的逼水好多| 夫妻性生交免费视频一级片| 国产一区二区在线观看日韩| 久久久久久久精品精品| 少妇 在线观看| 免费黄网站久久成人精品| 日韩在线高清观看一区二区三区| 日韩中字成人| 王馨瑶露胸无遮挡在线观看| 久久精品国产鲁丝片午夜精品| 国产精品 国内视频| 一级a做视频免费观看| 男男h啪啪无遮挡| 久久久久久久大尺度免费视频| 五月开心婷婷网| 搡女人真爽免费视频火全软件| 国产精品女同一区二区软件| 在现免费观看毛片| 超碰97精品在线观看| 狠狠婷婷综合久久久久久88av| 自拍欧美九色日韩亚洲蝌蚪91| 3wmmmm亚洲av在线观看| 一区二区av电影网| 黄色毛片三级朝国网站| 高清毛片免费看| 日韩一本色道免费dvd| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国语对白做爰xxxⅹ性视频网站| 亚洲精品456在线播放app| 国产伦理片在线播放av一区| 精品国产露脸久久av麻豆| av有码第一页| 亚洲熟女精品中文字幕| 国产成人精品婷婷| 国产老妇伦熟女老妇高清| 欧美成人精品欧美一级黄| 国产成人freesex在线| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 国产成人精品婷婷| 九色亚洲精品在线播放| 赤兔流量卡办理| 99久久中文字幕三级久久日本| 精品人妻熟女av久视频| 久久久国产精品麻豆| 精品久久久久久电影网| 男人爽女人下面视频在线观看| 一级毛片aaaaaa免费看小| 天天躁夜夜躁狠狠久久av| 亚州av有码| 国产免费视频播放在线视频| 蜜桃久久精品国产亚洲av| 国产成人一区二区在线| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 男女边吃奶边做爰视频| 久久午夜福利片| 三上悠亚av全集在线观看| 大又大粗又爽又黄少妇毛片口| 2022亚洲国产成人精品| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产老妇伦熟女老妇高清| 成年人免费黄色播放视频| 免费高清在线观看视频在线观看| 亚洲精品乱久久久久久| 久久久久久人妻| 国产成人精品无人区| 日本猛色少妇xxxxx猛交久久| 国产精品久久久久久精品电影小说| 日韩电影二区| www.色视频.com| 国产精品99久久99久久久不卡 | 久久精品国产亚洲av天美| 日韩熟女老妇一区二区性免费视频| 日韩制服骚丝袜av| 国产av国产精品国产| 天堂俺去俺来也www色官网| 一本一本久久a久久精品综合妖精 国产伦在线观看视频一区 | 久久久久视频综合| 建设人人有责人人尽责人人享有的| 国产成人一区二区在线| 久久精品久久久久久噜噜老黄| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 午夜免费鲁丝| 午夜福利视频在线观看免费| 日本wwww免费看| 一区二区三区乱码不卡18| 日韩精品免费视频一区二区三区 | 免费日韩欧美在线观看| 久久精品国产亚洲av天美| 国产免费现黄频在线看| 777米奇影视久久| 国产精品久久久久成人av| 嘟嘟电影网在线观看| 午夜福利,免费看| 老司机影院毛片| 男女啪啪激烈高潮av片| 97在线视频观看| 18禁动态无遮挡网站| 国产一区二区三区综合在线观看 | 在线观看人妻少妇| 视频在线观看一区二区三区| av一本久久久久| 有码 亚洲区| 男人添女人高潮全过程视频| 内地一区二区视频在线| 日本与韩国留学比较| 精品久久蜜臀av无| 免费黄频网站在线观看国产| 街头女战士在线观看网站| 日韩成人av中文字幕在线观看| 极品少妇高潮喷水抽搐| 亚洲精品视频女| 久久99热6这里只有精品| 日本午夜av视频| 亚洲欧美日韩另类电影网站| 成人手机av| 下体分泌物呈黄色| 亚洲精品乱码久久久久久按摩| 精品久久久精品久久久| 欧美精品一区二区大全| 99久久综合免费| 精品国产一区二区三区久久久樱花| 中国国产av一级| 一个人看视频在线观看www免费| 欧美日韩视频高清一区二区三区二| 一区二区日韩欧美中文字幕 | 国产成人aa在线观看| 两个人免费观看高清视频| 制服人妻中文乱码| 亚洲精品美女久久av网站| 狂野欧美激情性xxxx在线观看| 国产精品99久久久久久久久| 91久久精品国产一区二区三区| 国产探花极品一区二区| 丰满迷人的少妇在线观看| 黄色配什么色好看| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 波野结衣二区三区在线| 久久 成人 亚洲| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 18禁在线播放成人免费| 精品酒店卫生间| 各种免费的搞黄视频| 日韩欧美一区视频在线观看| 91aial.com中文字幕在线观看| 成年av动漫网址| 精品人妻偷拍中文字幕| 国产黄色视频一区二区在线观看| 人成视频在线观看免费观看| 精品一区二区三区视频在线| 天堂中文最新版在线下载| 欧美xxxx性猛交bbbb| 成人黄色视频免费在线看| 麻豆精品久久久久久蜜桃| 少妇丰满av| 久久久久久久久久久丰满| 少妇人妻 视频| 欧美一级a爱片免费观看看| 免费不卡的大黄色大毛片视频在线观看| 亚洲精品久久成人aⅴ小说 | 欧美日韩国产mv在线观看视频| 不卡视频在线观看欧美| 国产在视频线精品| 你懂的网址亚洲精品在线观看| 午夜激情av网站| 国产免费一级a男人的天堂| 日本欧美国产在线视频| 日产精品乱码卡一卡2卡三| 亚洲欧美一区二区三区国产| 哪个播放器可以免费观看大片| 天堂俺去俺来也www色官网| 日韩不卡一区二区三区视频在线| 三上悠亚av全集在线观看| 亚州av有码| 老女人水多毛片| 国产亚洲最大av| 日韩视频在线欧美| 亚洲国产精品一区三区| 精品一区二区三卡| 夫妻午夜视频| 欧美激情极品国产一区二区三区 | 亚洲精品久久午夜乱码| 日韩亚洲欧美综合| 午夜福利在线观看免费完整高清在| 99热这里只有是精品在线观看| 大香蕉久久成人网| 免费黄频网站在线观看国产| 国产视频首页在线观看| 熟女av电影| 亚洲高清免费不卡视频| 欧美激情国产日韩精品一区| 一区二区三区四区激情视频| 男女免费视频国产| 亚洲精品成人av观看孕妇| 亚洲av国产av综合av卡| 狠狠精品人妻久久久久久综合| 欧美精品人与动牲交sv欧美| 亚洲精品456在线播放app| 亚洲一级一片aⅴ在线观看| 日本91视频免费播放| 成人影院久久| 如何舔出高潮| 大片电影免费在线观看免费| 国产探花极品一区二区| 国产国语露脸激情在线看| 飞空精品影院首页| 女人久久www免费人成看片| 国产黄片视频在线免费观看| 熟女电影av网| 日韩亚洲欧美综合| 日韩伦理黄色片| 80岁老熟妇乱子伦牲交| 亚洲精品国产色婷婷电影| 国产又色又爽无遮挡免| 黄片播放在线免费| 九草在线视频观看| 卡戴珊不雅视频在线播放| 久久久欧美国产精品| 观看美女的网站| 九草在线视频观看| 亚洲人与动物交配视频| 久久久久久伊人网av| 欧美老熟妇乱子伦牲交| 免费大片18禁| 欧美xxⅹ黑人| 亚洲精品国产av成人精品| 久久人妻熟女aⅴ| 妹子高潮喷水视频| 国产精品国产三级专区第一集| av黄色大香蕉| 人人妻人人添人人爽欧美一区卜| 国产成人精品福利久久| 亚洲人与动物交配视频| 七月丁香在线播放| 国产精品麻豆人妻色哟哟久久| 欧美日韩视频精品一区| 香蕉精品网在线| 亚洲国产av新网站| 亚洲性久久影院| 亚洲四区av| 只有这里有精品99| 久久久久久人妻| av一本久久久久| 久热这里只有精品99| 热re99久久国产66热| a级毛片在线看网站| 亚洲av免费高清在线观看| 亚洲国产精品一区二区三区在线| 国产成人av激情在线播放 | 精品国产乱码久久久久久小说| 一级黄片播放器| 波野结衣二区三区在线| 精品国产国语对白av| 91精品一卡2卡3卡4卡| 国产一区二区在线观看日韩| 久久久久久久久久久丰满| 免费高清在线观看视频在线观看| 51国产日韩欧美| 69精品国产乱码久久久| 久久久久久久久久久丰满| 久久久久久伊人网av| 在线观看一区二区三区激情| 亚洲av成人精品一二三区| 亚洲精品乱码久久久v下载方式| 一级毛片黄色毛片免费观看视频| 日本欧美国产在线视频| 岛国毛片在线播放| 日韩欧美精品免费久久| 久久精品国产亚洲av涩爱| 91精品国产国语对白视频| 91精品一卡2卡3卡4卡|