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    黑皮油松松針精油的超聲波輔助-鹽析-水蒸氣蒸餾法提取及其抑菌效果和穩(wěn)定性1)

    2018-10-23 11:26:08包怡紅劉文麗
    關(guān)鍵詞:黑皮松針油松

    包怡紅 劉文麗

    (東北林業(yè)大學(xué),哈爾濱,150040)

    Ultrasonic-assisted salting-out hydrodistillation extraction method was used to extract essential oil of Pinus tabulaeformis needles. By using single factor experiment, the extraction conditions of P. tabulaeformis needles oil were optimized by orthogonal method. Combined with the disc diffusion method and microatmosphere test the antibacterial activity of essential oil of P. tabulaeformis needles were determined. Double dilution method was used to determine the minimum inhibitory concentration (MIC). The effects of pH, temperature and ultraviolet on the antibacterial effect of essential oil of P. tabulaeformis needles were studied. The optimum extraction conditions of essential oil of P. tabulaeformis needles are ultrasonic power of 240 W, ultrasonic time of 60 min, NaCl of 4%, and extraction time of 5 h. Three times of verification experiments show that the yield of P. tabulaeformis needles oil is 0.388 2%. P. tabulaeformis needles oil has inhibitory effects on all three strains of bacteria, and has little antibacterial effect on Saccharomyces cerevisiae and Aspergillus oryzae. MICs of essential oil to Bacillus subtilis, Staphylococcus aureus and Escherichia coli are 5, 10 and 20 μL/mL, respectively. The essential oils has good stability to temperature and ultraviolet radiation, and their antibacterial activity was unstable under different pH conditions. Antibacterial activity was strong in acid and weak in base solution.

    黑皮油松(Pinustabulaeformis)為松科(Pinaceae)松屬(Pinus)植物,其葉為松針,常被用于醫(yī)藥以及食品添加劑領(lǐng)域,具有活血安神、消炎止癢之功效[1],主要分布在中國(guó)東北地區(qū)。經(jīng)查閱文獻(xiàn),對(duì)松針的研究集中在化學(xué)成分[2]、黃酮提取[3]、藥理[4]、莽草酸提取及腫瘤治療[5]等幾個(gè)方面,而在松針精油提取和抑菌活性方面的研究報(bào)道很少。王得道[2]運(yùn)用了水蒸氣蒸餾法提取黑皮油松松針精油,并且測(cè)得了主要成分是烯烴類(lèi)和芳香類(lèi),其中石竹烯含量最高。超聲波輔助處理可以產(chǎn)生空化效應(yīng)和機(jī)械剪切效應(yīng),加快分子的運(yùn)動(dòng),使萃取成分與溶劑充分混合,有助于內(nèi)容物的溶出[6-7]。鹽析效應(yīng)是為了強(qiáng)化有機(jī)物的分離效果,在水蒸氣蒸餾中加入某種無(wú)機(jī)鹽,在含水體系中,鹽可以通過(guò)親和力“氫鍵”離子的靜電等作用與溶液中某種組分發(fā)生優(yōu)先溶劑化反應(yīng),形成難揮發(fā)的化合物,從而減少了該組分與另一組分之間的吸引作用[8]。

    植物精油具有良好的抑菌抗炎活性[9],由于現(xiàn)有的化學(xué)抑菌劑副作用較大,精油作為天然成分更適合用于食品的保鮮防腐。本試驗(yàn)采用超聲波鹽析輔助的方法提取黑皮油松松針中的精油,且以精油得率為指標(biāo),采用L9(34)正交表進(jìn)行實(shí)驗(yàn),進(jìn)行最佳工藝條件的確定,并對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌等微生物的抑制作用進(jìn)行了研究,此外,還探討了熱處理、pH值和紫外線照射條件對(duì)精油抑菌穩(wěn)定性的影響,對(duì)開(kāi)發(fā)天然食品防腐劑及保鮮劑具有重大的意義,為黑皮油松松針精油的開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供新途徑。

    1 材料與方法

    1.1 材料與儀器

    黑皮油松松針采于東北林業(yè)大學(xué)校園,將其晾干后用萬(wàn)能粉碎機(jī)打碎;NaCl固體購(gòu)于天津基準(zhǔn)化學(xué)試劑有限公司;牛肉膏、蛋白胨、營(yíng)養(yǎng)瓊脂購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司;吐溫-80購(gòu)于天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所提供;葡萄糖購(gòu)于天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司;大腸桿菌(E.coli)、枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、金黃色葡萄球菌(S.auTeus)、釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、米曲霉(Aspergillus),所有供試菌種均來(lái)源于東北林業(yè)大學(xué)微生物實(shí)驗(yàn)室。

    水蒸氣蒸餾裝置實(shí)驗(yàn)室自備;電子天平購(gòu)于常熟市天量?jī)x器有限責(zé)任公司;高速多功能粉碎機(jī)購(gòu)于上海市頂帥工貿(mào)有限公司;KQ-300DE型數(shù)控超聲波清洗器購(gòu)于昆山市超聲儀器有限公司;高壓蒸汽滅菌鍋購(gòu)于上海博訊實(shí)業(yè)有限公司;電熱恒溫培養(yǎng)箱購(gòu)于天津市泰斯特儀器有限公司;恒溫水浴鍋購(gòu)于上海一恒科技有限公司。

    1.2 試驗(yàn)方法

    黑皮油松松針精油的提取:稱(chēng)取50 g粉碎后的黑皮油松松針置于圓底燒瓶中,加入一定質(zhì)量分?jǐn)?shù)的NaCl溶液在不同的超聲功率下處理一定的時(shí)間,回流后收集稱(chēng)其質(zhì)量,重復(fù)3次,精油提取率按(1)式計(jì)算。

    (1)

    式中:E為精油得率(%);m1為精油質(zhì)量(g);m2為松針質(zhì)量(g)。

    超聲功率的影響:稱(chēng)量粉碎后的黑皮油松松針?lè)?0 g,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的條件下,分別在180、210、240、270、300 W超聲功率下處理30 min,水蒸氣蒸餾3 h后,計(jì)算得率。

    超聲時(shí)間的影響:稱(chēng)量粉碎后的黑皮油松松針?lè)?0 g,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,超聲功率為270 W的條件下,分別處理15、30、45、60、75 min,水蒸氣蒸餾3 h后,計(jì)算得率。

    NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的影響:稱(chēng)量粉碎后的黑皮油松松針?lè)?0 g,超聲功率為270 W的條件下,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為2%、4%、6%、8%、10%,超聲處理30 min,水蒸氣蒸餾3 h后,計(jì)算得率。

    蒸餾時(shí)間的影響:稱(chēng)量粉碎后的黑皮油松松針?lè)?0 g,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%,超聲功率為270 W的條件下,分別進(jìn)行水蒸氣蒸餾1、2、3、4、5 h后,計(jì)算得率。

    正交試驗(yàn):在單因素的基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)超聲功率、超聲時(shí)間、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)和蒸餾時(shí)間4因素的L9(34)正交實(shí)驗(yàn),確定黑皮油松松針精油最佳提取工藝條件。

    1.3 精油抑菌試驗(yàn)

    菌懸液的制備:取活化之后的菌體于相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中,細(xì)菌于37 ℃中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,用平板計(jì)數(shù)法將菌懸液調(diào)整濃度為每毫升106~107個(gè)菌落群,真菌于28 ℃中培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期,并用血球計(jì)數(shù)法調(diào)整菌的濃度至每毫升106~107個(gè)菌落群,備用[10]。

    黑皮油松松針精油的制備:將精油溶于滅菌后的吐溫-80溶液中制備成體積分?jǐn)?shù)為10%的精油溶液,置于4 ℃中冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

    黑皮油松松針精油液相抑菌活性的測(cè)定:根據(jù)文獻(xiàn)[11],測(cè)定黑皮油松松針精油對(duì)5種供試菌的抑菌活性。在無(wú)菌條件下,將培養(yǎng)基倒入滅過(guò)菌的平板后冷卻凝固,取100 μL菌懸液于培養(yǎng)基上并涂布均勻,取4片滅好菌的濾紙片(直徑為6 mm)放置于含菌平板上,其中3片滴加10 μL體積分?jǐn)?shù)為10%的精油溶液,另外1片以10 μL吐溫-80溶液作為對(duì)照,細(xì)菌放置于37 ℃中培養(yǎng)24 h,真菌放置于28 ℃中培養(yǎng)48 h。多次試驗(yàn)后用交叉法測(cè)得抑菌圈的直徑大小。

    最低抑菌體積分?jǐn)?shù)測(cè)定:根據(jù)文獻(xiàn)[12],取4 mL液體培養(yǎng)基加入滅完菌的試管中,再加入1 mL用吐溫-80溶液倍比稀釋過(guò)的黑皮油松松針精油溶液,使得精油的體積分?jǐn)?shù)為0.625~40 mL/L,以1 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.1%的吐溫-80溶液作為對(duì)照,每支試管中加入菌懸液100 μL,振蕩搖勻后將其置于37 ℃中恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。從各試管中分別取100 μL于平板上并涂布均勻,放于37 ℃培養(yǎng)24 h。

    黑皮油松松針精油氣相抑菌活性的測(cè)定:根據(jù)文獻(xiàn)[13],取100 μL菌液于培養(yǎng)基上并涂布均勻,取一片直徑大小為25 mm的濾紙片置于培養(yǎng)皿蓋中央,向?yàn)V紙片中滴加50 μL的純精油,以50 μL無(wú)菌水作為對(duì)照,將培養(yǎng)皿密封置于37 ℃中培養(yǎng)24 h。

    溫度對(duì)黑皮油松松針精油抑菌效果的影響:將體積分?jǐn)?shù)10%的精油置于20、40、60、80、100 ℃處理15 min,空白組不進(jìn)行處理,進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

    pH值對(duì)黑皮油松松針精油抑菌效果的影響:用質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%的NaOH溶液和體積分?jǐn)?shù)50%的檸檬酸將質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%吐溫-80的pH值分別調(diào)為4、5、6、7、8、9、10,再將精油稀釋至體積分?jǐn)?shù)10%,空白組不進(jìn)行處理,同時(shí)設(shè)置不同pH值的吐溫-80溶液為對(duì)照組,進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

    紫外線對(duì)黑皮油松松針精油抑菌效果的影響:將體積分?jǐn)?shù)為10%的精油分別在紫外燈(功率為20 W,垂直距離35 cm)下處理10、20、30、40、50、60 min,空白組不進(jìn)行處理,進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

    數(shù)據(jù)分析:實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,所有數(shù)據(jù)利用Word2016、Excel2016、SPSS 22.0、Origin 8.0統(tǒng)計(jì)和繪圖,進(jìn)行數(shù)據(jù)方差顯著性分析。

    2 結(jié)果與分析

    2.1 單因素對(duì)黑皮油松松針精油提取率的影響

    超聲功率對(duì)黑皮油松松針精油得率的影響:由表1可知,隨著超聲功率的改變,精油得率先上升后下降。其原因可能是超聲功率增大導(dǎo)致空化作用也逐漸增強(qiáng),加速了細(xì)胞的破碎速度,使得精油有效成分加快滲出,精油得率提高;但當(dāng)超聲功率過(guò)大時(shí)則空化效應(yīng)增強(qiáng)的幅度過(guò)大,使得精油更多得損失于水介質(zhì)中。

    表1 超聲功率對(duì)精油得率的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

    超聲時(shí)間對(duì)黑皮油松松針精油得率的影響:由表2可知,隨著超聲時(shí)間的增加,精油的得率也相對(duì)增加,當(dāng)超聲時(shí)間到達(dá)45 min時(shí),黑皮油松的得率基本趨于穩(wěn)定并且有所下降。這與李敏杰等[14]使用超聲波輔助提取葛縷子精油的結(jié)果一致,這可能是因?yàn)殡S著超聲時(shí)間的增加,細(xì)胞的破碎程度增加,有助于精油進(jìn)入溶劑中,隨著時(shí)間的增長(zhǎng),超聲產(chǎn)生的熱效應(yīng)加速升高溫度,使得精油中易揮發(fā)氧化的物質(zhì)損失,因此精油得率開(kāi)始下降。

    表2 超聲時(shí)間對(duì)精油得率的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

    NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黑皮油松松針精油得率的影響:由表3可知,精油的得率隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加也相對(duì)增加,但是當(dāng)NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過(guò)4%,精油得率就開(kāi)始減少。這與閆旭宇等[15]鹽析輔助提取靈香草精油結(jié)果一致,精油得率隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而增加,超過(guò)4%時(shí),精油得率開(kāi)始下降。這可能是由于加入無(wú)機(jī)鹽可增大細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓,更易于精油的溶出,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)過(guò)高時(shí)精油提取率下降主要是因?yàn)辂}濃度升高,水蒸汽沸點(diǎn)升高而蒸餾溫度升高,導(dǎo)致精油損失增加[16]。

    蒸餾時(shí)間對(duì)黑皮油松松針精油得率的影響:由表4可知,當(dāng)蒸餾時(shí)間從1 h到4 h時(shí),隨著時(shí)間的增長(zhǎng),精油的得率不斷升高,當(dāng)?shù)竭_(dá)4 h之后精油得率趨于平穩(wěn)并且開(kāi)始有所下降,原因是隨著時(shí)間的增長(zhǎng),精油中不穩(wěn)定的成分發(fā)生損失,使得精油得率下降。

    表3 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)精油得率的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

    表4 蒸餾時(shí)間對(duì)精油得率的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;同列不同字母表示差異顯著(p<0.05)。

    2.2 超聲波鹽析輔助提取黑皮油松松針精油的條件優(yōu)化

    結(jié)合單因素試驗(yàn)結(jié)果,以超聲功率、超聲時(shí)間、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、蒸餾時(shí)間為影響因素,以提取率為考察指標(biāo),進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),因素水平見(jiàn)表5。

    9組正交試驗(yàn)獲得的精油得率分別為0.293 2%、0.321 8%、0.337 4%、0.385 9%、0.359 7%、0.368 9%、0.352 6%、0.366 1%、0.382 6%。由各因素極差R的大小可知,RA>RC>RB>RD,影響得率的因素由大到小是超聲功率、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、超聲時(shí)間、蒸餾時(shí)間,超聲功率為主要影響因素,蒸餾時(shí)間為不重要因素。由k值可得,最佳水平為A2B3C2D3,即超聲功率為240 W,超聲時(shí)間為60 min,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為4%,蒸餾時(shí)間為5 h,在此條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn),設(shè)置3組平行試驗(yàn),最終得到黑皮油松松針精油得率為0.388 2%(n=3)。本試驗(yàn)優(yōu)化提取的黑皮油松松針精油得率高于王得道[2]研究的得率0.254%,這說(shuō)明超聲波和鹽析輔助有助于精油得率的提高。

    表5 正交試驗(yàn)因素水平

    2.3 黑皮油松松針精油抑菌活性

    黑皮油松松針精油的液相抑菌活性:黑皮油松松針精油對(duì)5種微生物的液相抑制作用結(jié)果見(jiàn)表6,對(duì)3種細(xì)菌均表現(xiàn)出抑菌效果,對(duì)枯草芽孢桿菌的抑制作用最強(qiáng),對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用居中,抑制作用最弱的為大腸桿菌,這可能是由于革蘭氏陰性菌的細(xì)胞壁較革蘭氏陽(yáng)性菌的細(xì)胞壁更為復(fù)雜,能夠阻止精油的抑菌成分進(jìn)入細(xì)胞中,起到保護(hù)的作用;對(duì)釀酒酵母和米曲霉的抑菌效果較差,幾乎沒(méi)有檢測(cè)到抑菌圈。

    表6 黑皮油松松針精油的液相抑菌生物活性測(cè)定結(jié)果

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;“—”表示無(wú)抑菌效果。

    黑皮油松松針精油的最低抑菌體積分?jǐn)?shù):由于抑菌圈試驗(yàn)表明黑皮油松松針精油對(duì)酵母菌和米曲霉抑菌效果不明顯,因此選取了對(duì)精油較敏感的3種細(xì)菌進(jìn)行了最低抑菌濃度的測(cè)定,后面試驗(yàn)均以這3種菌作為研究對(duì)象。

    由表7可以看出,黑皮油松松針精油對(duì)枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌最低抑菌體積分?jǐn)?shù)分別是5、10、20 mL/L,可見(jiàn)精油對(duì)枯草芽孢桿菌的抑菌效果最好。

    表7 黑皮油松松針精油對(duì)供試菌的最低抑菌體積分?jǐn)?shù)

    黑皮油松松針精油的氣相抑菌活性:結(jié)果見(jiàn)表8,黑皮油松松針精油對(duì)3種供試菌均具有抑菌效果,對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用最強(qiáng),枯草芽孢桿菌次之,作用最弱的為大腸桿菌。對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌作用比革蘭氏陰性菌強(qiáng),但抑制金黃色葡萄球菌的作用強(qiáng)于枯草芽孢桿菌。這種差異可能是由于液相抑菌法是直接接觸測(cè)定法,其主要取決于擴(kuò)散性和溶解度,而氣相抑菌則主要依賴于精油化合物的揮發(fā)性[17]。

    表8 黑皮油松松針精油的氣相抑菌生物活性測(cè)定結(jié)果

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差;“—”表示無(wú)抑菌效果。

    溫度對(duì)黑皮油松松針精油抑菌活性的影響:由表9可見(jiàn),在20,40,60,80,100 ℃下處理后,與對(duì)照組相比,黑皮油松松針精油的抑菌活性基本維持穩(wěn)定。這與王步江等[18]人的研究結(jié)果一致。這表明加熱并沒(méi)有使精油中的抑菌成分發(fā)生改變,黑皮油松松針精油的有效成分對(duì)溫度的耐受性較好。

    表9 溫度對(duì)黑皮油松精油抑菌活性的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

    酸堿環(huán)境對(duì)黑皮油松松針精油抑菌活性的影響:由表10可見(jiàn),pH值的改變會(huì)影響黑皮油松松針精油對(duì)細(xì)菌的抑制作用。在pH值<8時(shí),隨著pH值的降低,抑菌圈增大,在pH值>8時(shí),隨著pH值的增大,抑菌圈稍有增大。對(duì)照組在強(qiáng)酸和強(qiáng)堿時(shí)表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌的抑制作用。這與劉玉民等[19]人的試驗(yàn)結(jié)果一致。精油在低pH條件下抑菌活性增強(qiáng)是由于在酸性條件下細(xì)菌自身的生理活性降低,同時(shí)精油的活性成分的結(jié)構(gòu)形式也發(fā)生改變,即pH值的降低能夠使精油中酚類(lèi)化合物上所帶羥基的電離度降低,疏水性增強(qiáng),更易于與細(xì)菌的細(xì)胞膜和脂蛋白相結(jié)合,從而提高抑菌活性[20]。pH值>8時(shí),細(xì)菌在堿性條件下不易于生長(zhǎng)導(dǎo)致抑菌能力的增強(qiáng)。因此,在酸性條件下精油的具有更好的抑菌作用。

    表10 pH值對(duì)黑皮油松松針精油抑菌活性的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

    紫外線照射對(duì)黑皮油松松針精油的抑菌活性的影響:由表11可見(jiàn),紫外線分別照射10,20,30,40,50,60 min之后,與對(duì)照組相比,黑皮油松松針精油的抑菌活性并未發(fā)生顯著的變化。這與李婭男等[21]人研究的紫外線對(duì)4種精油穩(wěn)定性的影響的結(jié)果一致。這表明黑皮油松松針精油對(duì)紫外線具有較高的穩(wěn)定性,紫外線對(duì)精油的成分及其結(jié)構(gòu)沒(méi)有產(chǎn)生影響。

    表11 紫外線對(duì)黑皮油松松針精油抑菌活性的影響

    注:表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

    3 結(jié)論

    黑皮油松松針精油的最優(yōu)提取條件是:超聲功率240 W,超聲時(shí)間60 min,NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)4%,蒸餾時(shí)間5 h,選用50 g粉碎完成的黑皮油松松針,按照試驗(yàn)得出的條件,重復(fù)3次試驗(yàn)得出精油平均得率為0.388 2%。

    黑皮油松松針精油抑菌活性試驗(yàn)得出,黑皮油松精油在液相和氣相方面均表現(xiàn)出對(duì)細(xì)菌較好的抑制作用,且對(duì)革蘭氏陽(yáng)性菌的抑制作用強(qiáng)于革蘭氏陰性菌,對(duì)釀酒酵母和米曲霉的抑菌效果不明顯。

    黑皮油松松針精油對(duì)溫度和紫外線的耐受性較好,這種較好的穩(wěn)定性有利于精油的開(kāi)發(fā)利用。而pH值對(duì)其的抑菌效果產(chǎn)生了影響,在pH值較小的環(huán)境中抑菌效果較好,隨著pH值的增大效果減弱,因此在酸性食品的加工中有很好的應(yīng)用前景。

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