泛素結(jié)合酶UBE2G2基因調(diào)控胞內(nèi)布魯氏菌存活的作用

印雙紅，張俊波， 張孟琴， 易 萌， 易彩霞， 蔡春連， 毛 宏， 易繼海， 李志強(qiáng)， 陳創(chuàng)夫

(1.銅仁學(xué)院大健康學(xué)院，貴州銅仁 554300； 2.銅仁學(xué)院農(nóng)林工程與規(guī)劃學(xué)院，貴州銅仁 554300；3.貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州銅仁 554300；4.銅仁學(xué)院材料與化學(xué)工程學(xué)院，貴州銅仁 554300； 5.石河子大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，新疆石河子 832000；6.商丘師范學(xué)院生物與食品學(xué)院，河南商丘 476000)

布魯氏菌病是一種廣泛分布的人畜共患傳染病。動(dòng)物感染布魯氏菌后表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、流產(chǎn)、胎膜發(fā)炎、空懷和睪丸炎等癥狀。人可以通過吸入氣溶膠化的細(xì)菌或通過攝取和接觸被污染的動(dòng)物組織而感染。人感染布魯氏菌后會(huì)導(dǎo)致反復(fù)發(fā)燒、關(guān)節(jié)炎和心內(nèi)膜炎等全身性疾病。目前，布魯氏菌的持續(xù)性感染的分子機(jī)制尚不清楚。

泛素蛋白酶體途徑具有降解真核細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的作用，調(diào)節(jié)著大多數(shù)蛋白的降解，是維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)所必需的。蛋白酶體降解途徑主要包括靶蛋白的泛素化和泛素化靶蛋白在蛋白酶體內(nèi)的降解。靶蛋白的泛素化主要需要3種酶協(xié)同完成，包括E1活化酶、E2結(jié)合酶和E3連接酶。E2結(jié)合酶以一個(gè)多基因家族形式存在，人類基因組中已發(fā)現(xiàn)40多個(gè)泛素結(jié)合酶。E2結(jié)合酶一般具有1個(gè) 16～18 ku大小的催化中心，包含具有催化活性的半胱氨酸殘基。然而，E2結(jié)合酶在布魯氏菌感染過程中的作用機(jī)制尚不清楚。本研究以泛素結(jié)合酶UBE2G2為研究對(duì)象，檢測(cè)其在胞內(nèi)布魯氏菌繁殖中的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

Opti-MEM培養(yǎng)基，購(gòu)自GIBCO公司；LDH檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自碧云天生物技術(shù)公司；LipofectamineRNAiMAX轉(zhuǎn)染試劑、Lipofectamine 2000 和總RNA提取試劑Trizol，均購(gòu)自Invitrogen公司；布魯氏菌M5-90、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7和pLVX-puro載體，由貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。該試驗(yàn)于2019年4月至2020年10月在貴州省梵凈山地區(qū)生物多樣性保護(hù)與利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2 UBE2G2基因過表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建

1.2.1 過表達(dá)質(zhì)粒pLVX-puro-的構(gòu)建 利用NCBI網(wǎng)站下載小鼠的基因序列(GenBank登錄號(hào)為NM_019803.3)，送華大基因公司合成序列，將目的基因序列與pLVX-puro載體連接構(gòu)建過表達(dá)質(zhì)粒pLVX-puro-，將該重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，于37 ℃振蕩培養(yǎng)1 h，7 000 r/min離心3 min，將沉淀菌體涂布于含有氨芐青霉素(100 g/mL)的固體平板中，于 37 ℃ 培養(yǎng)16 h，提取質(zhì)粒并進(jìn)行PCR擴(kuò)增和酶切驗(yàn)證。

設(shè)計(jì)pLVX-puro載體和pLVX-puro-的共同檢測(cè)引物，F(xiàn)：5′-C A C G C T G T T T T G A C C T C C A T-3′，R：5′-G G A T G T G G A A T G T G T G C G A G-3′。質(zhì)粒pLVX-puro和pLVX-puro-的PCR體系為20 μL：2×ESMasterMix 10.0 μL，pLVX-puro-(pLVX-puro) 1.0 μL，上下游引物各1.0 μL，ddHO 7.0 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，57 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，循環(huán)30次；72 ℃ 7 min。質(zhì)粒pLVX-puro-雙酶切驗(yàn)證體系為40 μL：RⅠ限制性內(nèi)切酶 2.0 μL，HⅠ限制性內(nèi)切酶2.0 μL，質(zhì)粒pLVX-puro-20.0 μL，10×H Buffer 4.0 μL和ddHO 12.0 μL。

1.2.2 過表達(dá)效果的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[7]中的方法，用6孔板培養(yǎng)細(xì)胞，培養(yǎng)液用10%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，待細(xì)胞密度為1×10個(gè)/mL時(shí)，將細(xì)胞培養(yǎng)基更換為無(wú)血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，將細(xì)胞分為磷酸鹽緩沖液(PBS)對(duì)照組、pLVX-puro 空質(zhì)粒組和pLVX-puro-過表達(dá)質(zhì)粒組。取2支滅菌的EP管，一個(gè)管加入 10 μL Lipofectamine 2000和240 μL Opti-MEM；另一個(gè)管加入15 μL質(zhì)粒(pLVX-puro或pLVX-puro-)或15 μL PBS和235 μL Opti-MEM，室溫靜置4 min，將上述2個(gè)管中的液體混合，室溫靜置15 min，然后將其加入至6孔板中，培養(yǎng)4 h后加入含胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)48 h后收集細(xì)胞，利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qRT-PCR)分析基因過表達(dá)情況。從NCBI網(wǎng)站下載和內(nèi)參基因序列(GenBank登錄號(hào)分別為NM_019803.3和 NM_008084.3)，設(shè)計(jì)引物(表1)，引物序列由華大基因公司合成。以為內(nèi)參，qRT-PCR分析的表達(dá)水平，反應(yīng)體系為20 μL：熒光染料10 μL，模板cDNA 2 μL，上下游引物各1 μL，ddHO 6 μL。PCR反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min。試驗(yàn)將PBS處理的細(xì)胞作為對(duì)照組。每組細(xì)胞設(shè)置3次重復(fù)，采用2-ΔΔ法分析基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 UBE2G2、CHOP和GAPDH基因的qRT-PCR引物

1.3 UBE2G2沉默表達(dá)細(xì)胞的構(gòu)建

1.3.1 小干擾RNA(siRNA)的合成 由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)并合成基因干擾片段，包括3對(duì)陽(yáng)性siRNA序列(-83-siRNA、-253-siRNA和-456-siRNA)和1對(duì)陰性siRNA序列(表2)。

表2 UBE2G2基因的siRNA序列

1.3.2 沉默效果的檢測(cè) 參照文獻(xiàn)[7]中的方法，按照“1.2.2”節(jié)的方法培養(yǎng)細(xì)胞，將細(xì)胞分為PBS對(duì)照組、陰性siRNA組、-83-siRNA干擾組、-253-siRNA干擾組和-456-siRNA干擾組。取2個(gè)EP管，個(gè)管分別加125 μL Opti-MEM，然后一個(gè)管加入7 μL Lipofectamine RNAiMAX，另一個(gè)管加入12.5 μL siRNA(-83-siRNA、-253-siRNA、-456-siRNA或陰性siRNA)，室溫孵育5 min，將上述2個(gè)管中的液體混勻，室溫孵育15 min，然后將其加入細(xì)胞液中，培養(yǎng)4 h后加入含20%胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基；培養(yǎng)48 h后，利用qRT-PCR分析基因沉默表達(dá)情況。

1.4 UBE2G2沉默或過表達(dá)對(duì)細(xì)胞活性的影響

采用MTT比色法檢測(cè)細(xì)胞活性。將-83-siRNA和pLVX-puro-質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞，培養(yǎng)細(xì)胞至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，消化細(xì)胞，加入含胎牛血清的Opti-MEM培養(yǎng)基，將懸浮細(xì)胞接種于96孔板中。棄去上清液，加入二甲基亞砜(DMSO)，測(cè)量490 nm處的吸光度。試驗(yàn)設(shè)正常培養(yǎng)的細(xì)胞為對(duì)照組，重復(fù)3次。

1.5 羊種布魯氏菌M5-90感染對(duì)相關(guān)基因表達(dá)的影響

從NCBI網(wǎng)站下載基因序列(GenBank登錄號(hào)為NM_007837.4)，設(shè)計(jì)基因的引物(表1)。用qRT-PCR分析M5-90感染對(duì)過表達(dá)和沉默表達(dá)基因的細(xì)胞中基因表達(dá)量的影響。

用M5-90感染細(xì)胞，培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞。利用qRT-PCR分析的表達(dá)水平，具體方法見“1.2.2”節(jié)。試驗(yàn)以PBS處理的細(xì)胞為對(duì)照組。

取轉(zhuǎn)染pLVX-puro-和-83-siRNA的細(xì)胞，用M5-90感染轉(zhuǎn)染的細(xì)胞，培養(yǎng)24 h收集細(xì)胞。利用qRT-PCR檢測(cè)的表達(dá)水平，具體方法見“1.2.2”節(jié)。試驗(yàn)同時(shí)設(shè)正常細(xì)胞及轉(zhuǎn)染pLVX-puro空質(zhì)粒、陰性siRNA、PBS處理的細(xì)胞為對(duì)照組。

1.6 UBE2G2沉默或過表達(dá)對(duì)細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌存活的影響

取“1.5”節(jié)中5組細(xì)胞，37 ℃培養(yǎng)1.5 h，添加含有慶大霉素(50 μg/mL)細(xì)胞培養(yǎng)基孵育40 min，更換無(wú)慶大霉素的培養(yǎng)基，培養(yǎng)24 h，用TritonX-100裂解細(xì)胞，室溫放置15 min后將裂解液涂布固體平板，統(tǒng)計(jì)細(xì)菌數(shù)量，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 UBE2G2沉默或過表達(dá)對(duì)細(xì)胞乳酸脫氫酶(LDH)水平及相關(guān)細(xì)胞因子的影響

取M5-90感染的PBS對(duì)照組、pLVX-puro空質(zhì)粒組、pLVX-puro-過表達(dá)質(zhì)粒組、陰性siRNA對(duì)照組、-83-siRNA干擾組共5組細(xì)胞，檢測(cè)LDH水平、白介素-18(IL-18)水平和γ-干擾素(IFN-γ)水平，試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)均利用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行單因素方差分析(one-way ANOVA)，結(jié)果以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)粒pLVX-puro-UBE2G2構(gòu)建的驗(yàn)證

由圖1可知，pLVX-puro質(zhì)粒經(jīng)引物pLVX-puro-F/pLVX-puro-R PCR擴(kuò)增獲得大小為 254 bp 的條帶，pLVX-puro-質(zhì)粒經(jīng)PCR擴(kuò)增可獲得的764 bp的條帶。由圖2可知，質(zhì)粒pLVX-puro-經(jīng)雙酶切獲得大小為510 bp的目的基因條帶，結(jié)果與預(yù)期值相符。結(jié)果表明，pLVX-puro-構(gòu)建成功。

2.2 過表達(dá)載體pLVX-puro-UBE2G2過表達(dá)效果的驗(yàn)證

由圖3可知，轉(zhuǎn)染pLVX-puro-UBE2G2組細(xì)胞的表達(dá)量極顯著高于PBS對(duì)照組(<0.01)；轉(zhuǎn)染pLVX-puro組細(xì)胞的的表達(dá)量與PBS對(duì)照組無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，pLVX-puro-質(zhì)?？蛇^表達(dá)。

2.3 siRNA干擾UBE2G2基因效果的驗(yàn)證

由圖4可知，-83-siRNA、-253-siRNA和-456-siRNA干擾組細(xì)胞基因的表達(dá)量均極顯著低于PBS對(duì)照組(<0.01)，干擾效率分別為89%、63%、48%。結(jié)果表明，的最佳干擾片段為-83-siRNA。

2.4 沉默或過表達(dá)UBE2G2基因?qū)?xì)胞活性的影響

由圖5可知，-83-siRNA干擾組、pLVX-puro-過表達(dá)質(zhì)粒組的細(xì)胞活性均在90%以上。結(jié)果表明，沉默或過表達(dá)基因不影響細(xì)胞活性。

2.5 布魯氏菌感染對(duì)UBE2G2和CHOP基因相對(duì)表達(dá)量的影響

由圖6可知，M5-90感染組細(xì)胞基因的表達(dá)量極顯著高于PBS對(duì)照組(<0.01)。結(jié)果表明，M5-90感染可誘導(dǎo)細(xì)胞的表達(dá)。

由圖7可知，與PBS對(duì)照組細(xì)胞相比，pLVX-puro-過表達(dá)組細(xì)胞中的表達(dá)量顯著降低(<0.05)；-83-siRNA干擾組細(xì)胞中的表達(dá)量顯著升高(<0.05)；pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA對(duì)照組細(xì)胞中的表達(dá)量均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，沉默和過表達(dá)分別可提高和抑制M5-90介導(dǎo)的細(xì)胞中的表達(dá)。

2.6 沉默和過表達(dá)UBE2G2基因?qū)Π麅?nèi)布魯氏菌存活的影響

由圖8可知，轉(zhuǎn)染-83-siRNA片段的細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌(M5-90)菌株數(shù)量顯著低于PBS對(duì)照組(<0.05)，轉(zhuǎn)染pLVX-puro-質(zhì)粒的細(xì)胞內(nèi)M5-90菌株數(shù)量顯著高于PBS對(duì)照組(<0.05)。結(jié)果表明，沉默和過表達(dá)分別可抑制和促進(jìn)胞內(nèi)M5-90菌株的存活。

2.7 沉默和過表達(dá)UBE2G2基因?qū)5-90感染細(xì)胞的LDH、IL-18和IFN-γ水平的影響

2.7.1 LDH水平 由圖9可知，與PBS對(duì)照組相比，pLVX-puro-質(zhì)粒組細(xì)胞的LDH水平極顯著升高(<0.01)，-83-siRNA干擾組細(xì)胞的LDH水平顯著降低(<0.05)；pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA組細(xì)胞的LDH水平均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，沉默和過表達(dá)分別可抑制和提高M(jìn)5-90介導(dǎo)的細(xì)胞中LDH水平。

2.7.2 IL-18水平 由圖10可知，與PBS對(duì)照組相比，pLVX-puro-質(zhì)粒組細(xì)胞的IL-18水平顯著降低(<0.05)；-83-siRNA干擾組細(xì)胞的IL-18水平顯著升高(<0.05)；pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA組細(xì)胞的IL-18水平均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，沉默和過表達(dá)分別可提高和抑制M5-90介導(dǎo)的細(xì)胞中IL-18水平。

2.7.3 IFN-γ水平 由圖11可知，與PBS對(duì)照組相比，pLVX-puro-質(zhì)粒組細(xì)胞的IFN-γ水平顯著降低(<0.05)；-83-siRNA干擾組細(xì)胞的IFN-γ水平顯著升高(<0.05)；pLVX-puro空質(zhì)粒組與陰性siRNA組細(xì)胞的 IFN-γ 水平均無(wú)明顯變化。結(jié)果表明，沉默和過表達(dá)分別可提高和抑制M5-90介導(dǎo)的細(xì)胞中 IFN-γ 水平。

3 討論與結(jié)論

泛素主要參與細(xì)胞周期、胞吞作用和細(xì)胞程序性死亡等細(xì)胞過程。泛素蛋白酶體系統(tǒng)參與病毒感染、存活、釋放與免疫逃逸等各個(gè)階段。研究表明，沉默泛素結(jié)合酶UBE2J1可顯著降低登革病毒(DENV)感染，而過表達(dá)UBE2J1可增強(qiáng)DENV感染。細(xì)胞泛素蛋白酶體系統(tǒng)也參與了細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌的存活。研究表明，布魯氏菌S2感染巨噬細(xì)胞可誘導(dǎo)泛素及蛋白酶體的表達(dá)；功能增強(qiáng)后的泛素蛋白酶體系統(tǒng)可抑制布魯氏菌S2的早期感染；而在感染后期，利用抑制劑乳胞素抑制細(xì)胞蛋白酶體功能，可抑制細(xì)胞內(nèi)布魯氏菌S2的存活能力，因此推測(cè)泛素蛋白酶體功能被抑制后可促進(jìn)巨噬細(xì)胞自體吞噬系統(tǒng)的活化，從而提高了巨噬細(xì)胞的殺菌能力。筆者所在課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在胞內(nèi)布魯氏菌繁殖中發(fā)揮正調(diào)控作用，本研究結(jié)果表明，M5-90感染可誘導(dǎo)細(xì)胞中的表達(dá)，且可調(diào)控胞內(nèi)M5-90菌株的存活，因此，與功能相似。

細(xì)胞因子IL-18具有在機(jī)體中防御各種傳染病調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的作用。IL-18在清除病毒過程中發(fā)揮作用。干擾素INF-γ是細(xì)胞分泌的糖蛋白，可活化自然殺傷(NK)細(xì)胞和誘導(dǎo)細(xì)胞主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ(MHCⅠ)的表達(dá)，增強(qiáng)宿主的免疫力。IFN-γ是反映宿主細(xì)胞免疫水平的主要巨噬細(xì)胞活化因子。INF-γ是抗布魯氏菌感染的細(xì)胞因子。本研究表明，沉默和過表達(dá)分別可提高和抑制M5-90介導(dǎo)的細(xì)胞中IL-18和IFN-γ水平。因此，可調(diào)控布魯氏菌介導(dǎo)的細(xì)胞中IL-18水平和IFN-γ水平。

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在機(jī)體抵抗胞內(nèi)病原感染過程中至關(guān)重要。布魯氏菌侵入細(xì)胞后隱藏于膜結(jié)合隔室內(nèi)，該隔室被稱為布氏小體。由于布氏小體在感染細(xì)胞周期中具有內(nèi)體性質(zhì)，因此將其稱為內(nèi)體布氏小體，該內(nèi)體布氏小體與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)持續(xù)相互作用，獲得與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相關(guān)的標(biāo)記物；內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中含菌小泡被稱為復(fù)制性布氏小體，該復(fù)制性布氏小體具有內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的結(jié)構(gòu)和功能特征，表明內(nèi)體布氏小體轉(zhuǎn)化為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)衍生的細(xì)胞器。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為布魯氏菌在細(xì)胞內(nèi)的繁殖提供了有利的場(chǎng)所。布魯氏菌在感染的細(xì)胞內(nèi)與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相互作用，可表現(xiàn)出免疫逃避和細(xì)胞凋亡抑制的功能。是細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)錄因子，當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激超過自身的應(yīng)答能力時(shí)，誘導(dǎo)的高表達(dá)，引發(fā)細(xì)胞凋亡。本研究表明，沉默和過表達(dá)分別可提高和抑制M5-90介導(dǎo)的細(xì)胞中的表達(dá)。筆者推測(cè)沉默可通過誘導(dǎo)M5-90介導(dǎo)的細(xì)胞中的表達(dá)促進(jìn)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而抑制胞內(nèi) M5-90 菌株的存活；因此，可能通過的表達(dá)來調(diào)控胞內(nèi)布魯氏菌的存活。