淫羊藿苷介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路防治骨質(zhì)疏松的研究進(jìn)展

王敬博 陳躍平 章曉云 廖建釗

1.廣西中醫(yī)藥大學(xué)，廣西 南寧 530001 2.廣西中醫(yī)藥大學(xué)附屬瑞康醫(yī)院創(chuàng)傷骨科與手外科，廣西 南寧 530011

傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為OP屬于骨痿的范疇，《素問》中提出：“腎主骨，腎精充足則骨堅(jiān)，若腎氣不足則骨痿?！惫收J(rèn)為腎氣虛是OP發(fā)生的主要原因。當(dāng)前中醫(yī)藥治療OP常以淫羊藿等補(bǔ)腎藥物為主[1]。淫羊藿為毛莨目小蘗科多年生草本植物，又名仙靈脾、鐵打杵，《本草綱目》稱：“其可益精氣，強(qiáng)筋骨，利小便”，在臨床上主要治療陽痿遺精、筋骨痿軟、筋脈拘攣等癥?，F(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)[2]，淫羊藿的主要藥效成分淫羊藿苷(Icariin，ICA)具有促進(jìn)骨形成、改善骨代謝平衡、增加骨密度等作用，其中成骨細(xì)胞(osteoblast，OB)與破骨細(xì)胞(osteoclast，OC)是參與骨形成和骨代謝的關(guān)鍵，維持OB和OC的相對(duì)穩(wěn)定可確保骨的完整性和功能。研究表明[3]，絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)在骨細(xì)胞的形成、發(fā)育和凋亡過程中起著非常重要的作用，通常MAPK通路在ICA的激活作用下促進(jìn)OB增殖、抑制OC分化及促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchyml stem cells，BMSCs)成骨分化，進(jìn)而發(fā)揮抗OP的作用，見圖1。因此，本文就ICA介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路防治OP的作用機(jī)制作一綜述。

圖1 ICA介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路治療骨質(zhì)疏松作用機(jī)制Fig.1 Mechanism of ICA mediated MAPK signaling pathway in the treatment of osteoporosis

1 MAPK通路

MAPK是信號(hào)由細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的傳遞者，是一種具有磷酸化功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其活化受生長因子、氧化、激素等多種胞內(nèi)和胞外信號(hào)刺激[4]。其中細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(extracellular signal-regulated kinase，ERK)、p38和c-Jun 氨基末端激酶(c-jun N-terminal kinase，JNK)3種激酶是MAPK的主要組成部分[5]，在將細(xì)胞外刺激轉(zhuǎn)化為多種細(xì)胞反應(yīng)的過程中起著關(guān)鍵作用[6]，其中JNK和p38 MAPK表達(dá)的變化在細(xì)胞受到各種物理、化學(xué)和生物應(yīng)激刺激后最為顯著，而ERK1/2信號(hào)主要激活細(xì)胞生長因子的表達(dá)，并在骨細(xì)胞的形成過程中有著至關(guān)重要的地位。

2 MAPK與骨細(xì)胞

目前維持骨代謝平衡是治療OP的主要方法之一，其中維持OB骨形成和OC骨吸收水平穩(wěn)定是確保骨代謝平衡的關(guān)鍵。在OP發(fā)生發(fā)展過程中，由于機(jī)體氧化應(yīng)激水平不斷升高，OB出現(xiàn)異常凋亡的現(xiàn)象，導(dǎo)致機(jī)體內(nèi)骨穩(wěn)態(tài)平衡被打破，然而機(jī)體內(nèi)OC的活性增高，骨吸收功能亢進(jìn)，也可打破骨形成與骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡。因此，降低機(jī)體氧化應(yīng)激水平，維持OB的骨形成穩(wěn)定，降低OC活性，抑制其骨吸收功能，可有效發(fā)揮抗OP作用[7-8]。另外，BMSCs也與人類的骨骼代謝密切相關(guān)，在轉(zhuǎn)錄因子和細(xì)胞因子的共同刺激下，可以促進(jìn)BMSCs成骨分化，從而促進(jìn)骨形成[9]。近年來發(fā)現(xiàn)，MAPK通路通過調(diào)控相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子和基因的表達(dá)，促進(jìn)OB和OC增殖、分化，促進(jìn)BMSCs成骨分化以及調(diào)節(jié)BMSCs成脂分化，在骨形成和骨吸收中發(fā)揮著重要作用。具體機(jī)制研究如下。

2.1 MAPK與成骨細(xì)胞

MAPK通路中的ERK1/2、p38 MAPK和JNK在成骨基因表達(dá)過程中起著非常關(guān)鍵的作用，激活MAPK通路，可有效提高OB的活性并促進(jìn)骨基質(zhì)的分泌與鈣化，利于機(jī)體骨形成。其中纖維細(xì)胞生長因子激活ERK1/2通路可顯著促進(jìn)OB增殖，而抑制ERK1/2信號(hào)通路的活化可降低Bax和Bel-2的表達(dá)，從而抑制Caspase-3的活化，遏制細(xì)胞凋亡。當(dāng)p38 MAPK通路被激活后，OB中堿性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)的表達(dá)顯著提升，從而誘導(dǎo)OB分化。JNK通路的激活也是OB分化的關(guān)鍵，當(dāng)前列腺素E2、脂聯(lián)素等激活JNK通路后，可顯著促進(jìn)OB增殖，因此激活MAPK信號(hào)通路是促進(jìn)OB增殖、分化方式之一。Pratsinis等[10]指出hBMSCs向OB增殖、分化主要受ERK的激活，其中血小板衍生生長因子等骨活性劑均通過激活ERK信號(hào)通路促進(jìn)OB增殖、分化。Greenblatt等[11]研究發(fā)現(xiàn)p38 MAPK通路是小鼠正常骨骼形成的必要條件，敲除MAPK通路成員編碼基因Mkk3、Mkk6、p38a或p38b的小鼠則會(huì)出嚴(yán)重的骨量減少，通常表現(xiàn)為OB的分化缺陷，而在MAP3K家族中，p38上游的關(guān)鍵激活因子TGF-β活化激酶1往往也能促進(jìn)OB的表達(dá)。Yang等[12]研究發(fā)現(xiàn)在OB分化過程中，由于JNK/MAPK磷酸化水平不斷提高，阻斷了成脂細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，刺激了OB轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，導(dǎo)致OB含量明顯增多，利于機(jī)體骨形成。綜上所述，OB的成骨基因表達(dá)與MAPK通路的激活作用密切相關(guān)，當(dāng)MAPK通路激活后可促進(jìn)OB增殖、分化(圖2)。此外，OB是參與骨形成的關(guān)鍵，更深層次了解MAPK信號(hào)通路對(duì)OB的影響有助于更好地研究OP。

圖2 MAPK信號(hào)通路與成骨細(xì)胞作用機(jī)制Fig.2 MAPK signaling pathway and the mechanism of osteoblasts

2.2 MAPK與破骨細(xì)胞

MAPK通路是OC形成的主要參與者，在OC分化過程中起主導(dǎo)作用。當(dāng)ERK1/2通路受到激活作用后，可通過刺激c-Fos、c-Myc等下游轉(zhuǎn)錄因子調(diào)節(jié)OC分化。MKK3/MKK6磷酸化水平提高可激活p38 MAPK通路，并通過NFATc1促進(jìn)OC分化。而JNK通路的活化常由細(xì)胞核因子-κB受體活化因子配體(receptor activator of NF-κB ligand，RANKL)與TRAF2和TRAF5相結(jié)合而引起，并可激活c-Jun/Fos活化蛋白1的表達(dá)，從而提高OC活性，促進(jìn)OC增殖、分化。因此，尋找激活MAPK通路以刺激相關(guān)基因表達(dá)是促進(jìn)OC增殖、分化的關(guān)鍵。研究表明[13]成熟OC存活周期受ERK通路調(diào)控，其中c-Fos基因蛋白的穩(wěn)定表達(dá)可誘導(dǎo)骨髓巨噬細(xì)胞經(jīng)過巨噬細(xì)胞刺激集落因子(macrophage colony-stimulating factor，M-CSF)促進(jìn)NFATc1表達(dá)，并協(xié)同c-FMS在M-CSF刺激下通過ERK1/2和c-Fos信號(hào)通路介導(dǎo)OC分化。Tian等[14]認(rèn)為酪氨酸磷酸化蛋白激酶p38 MAPK被激活后，可促進(jìn)NFATc的表達(dá)，從而促進(jìn)OC前體細(xì)胞分化為成熟OC。Huang等[15]研究發(fā)現(xiàn)唑來膦酸(zoledronic acid，ZOL)可降低RANKL誘導(dǎo)的JNK磷酸化，使OC的活性大大降低，從而抑制OC形成。這些結(jié)果提示，MAPK通路在激活作用下，OC的活性顯著提高，從而促進(jìn)OC分化，增強(qiáng)骨吸收功能(圖3)。然而OP的發(fā)生與OC分化、骨吸收功能亢進(jìn)有關(guān)，通常使用相關(guān)抑制劑，在MAPK信號(hào)通路的介導(dǎo)下抑制OC分化，降低其骨吸收功能，起到治療OP的作用。

圖3 MAPK信號(hào)通路與破骨細(xì)胞作用機(jī)制Fig.3 MAPK signaling pathway and the mechanism of osteoclasts

2.3 MAPK與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞

BMSCs成骨受到激素、生長因子、培養(yǎng)環(huán)境等多種因素的影響，是骨再生的關(guān)鍵[16]。其中MAPK信號(hào)在BMSCs成骨及成脂分化中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并以提高ERK和p38 MAPK的磷酸化水平來促進(jìn)BMSCs成骨分化以及調(diào)節(jié)BMSCs成脂分化。梁軍等[17]在探究復(fù)方接骨中藥介導(dǎo)p38 MAPK信號(hào)通路對(duì)BMSCs成骨分化的影響中發(fā)現(xiàn)，中藥通過提高p38蛋白磷酸化水平，上調(diào)MAPK通路的表達(dá)，從而促進(jìn) BMSCs成骨分化。朱波等[18]通過研究p38 MAPK磷酸化水平在15Hz 1 mT的電磁場下的變化，在應(yīng)用ERK和p38 MAPK阻斷劑之后，發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)ERK和p38 MAPK磷酸化水平顯著升高，BMSCs的ALP活性增強(qiáng)，證明通過活化ERK和p38 MAPK信號(hào)通路可以促進(jìn)BMSCs的成骨分化。Jiang等[19]研究發(fā)現(xiàn)BMSCs中p-p38和p-JNK蛋白水平在骨誘導(dǎo)劑的刺激下顯著提高，這提示p38和JNK通路活化對(duì)成骨分化具有積極作用。此外，長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)與p38 MAPK信號(hào)通路密切相關(guān)，其中l(wèi)ncRNA DANCR通過激活p38 MAPK通路可誘導(dǎo)BMSCs向OB分化。而p38 MAPK和ERK信號(hào)通路也參與調(diào)節(jié)脂肪細(xì)胞的形成，劉革修等[20]實(shí)驗(yàn)得出促紅細(xì)胞生成素能夠提高ERK42、ERK44、p38 MAPK磷酸化水平，降低過氧化物酶增殖體激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptor gamma，PPARγ)的表達(dá)，從而遏制BMSCs成脂分化。也有研究表明ERKl/2通路的活化能夠促進(jìn)成脂細(xì)胞分化，在BMSCs成脂細(xì)胞分化的早期，ERKl/2通過提高C/EBPα和PPARγ的磷酸化水平，以促進(jìn)脂肪細(xì)胞分化[21]。綜上所述，p38 MAPK和ERK通路不僅可以促進(jìn)BMSCs成骨分化，還在BMSCs成脂分化中起到促進(jìn)或抑制的作用(圖4)。

圖4 MAPK信號(hào)通路與骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞作用機(jī)制Fig.4 The mechanism of MAPK signaling pathway and bone marrow mesenchymal stem cells

3 淫羊藿苷與骨質(zhì)疏松

3.1 淫羊藿苷介導(dǎo)MAPK通路促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化

MAPK信號(hào)通路的激活是OB增殖、分化的主要促進(jìn)因子，在骨形成中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。因此尋找激活MAPK信號(hào)通路以促進(jìn)OB增殖、分化的方法成為治療OP的主要方法之一。當(dāng)前研究發(fā)現(xiàn)淫羊藿的主要藥效成分ICA能夠激活MAPK信號(hào)通路以促進(jìn)OB增殖、分化，從而促進(jìn)骨形成，抑制OP的發(fā)生、發(fā)展。劉尚全等[22]發(fā)現(xiàn)糖皮質(zhì)激素對(duì)OB的活性具有抑制作用，而ICA能夠通過MAPK/ERK信號(hào)通路改變糖皮質(zhì)激素對(duì)OB的抑制作用，通常情況下，由于受到ICA的刺激，p38 MAPK/ERK磷酸化水平提高，從而促進(jìn)OB增殖、分化，促進(jìn)骨形成。為了證實(shí)這一結(jié)論，龔一昕等[23]在實(shí)驗(yàn)中應(yīng)用ICA Ⅱ來刺激p38 MAPK信號(hào)，發(fā)現(xiàn)p-p38 MAPK磷酸化水平與ALP活性明顯提高，從而推測ICA Ⅱ能夠激活MAPK通路的表達(dá)，刺激OB分化達(dá)到治療OP的目的。因此，通過以上研究得出ICA介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路可以促進(jìn)OB增殖、分化，顯著提高骨含量和骨密度。由此得出，以O(shè)B為靶點(diǎn)是治療OP的主要方法之一，其具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

3.2 淫羊藿苷介導(dǎo)MAPK通路抑制破骨細(xì)胞分化

淫羊藿的主要藥效成分ICA是類黃酮化合物的一種[24]，它通過多種通路促進(jìn)OB增殖，遏制OC分化，從而減少骨質(zhì)流失，提高機(jī)體的骨含量與骨密度。其中MAPK通路是OC生成的主要參與者，在OC分化過程中通過c-Fos和NFAT等MAPK下游調(diào)控因子激活OC活性而產(chǎn)生。因此，當(dāng)MAPK通路與類黃酮化合物相結(jié)合時(shí)，通過調(diào)控c-fos等基因表達(dá)，能夠抑制OC分化，從而降低骨吸收作用。王想福等[25]應(yīng)用體外培養(yǎng)OC的方法，探究類黃酮通過p38 MAPK/c-Fos信號(hào)通路對(duì)OC分化的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)類黃酮能夠抑制OC分化，并可下調(diào)p38 MAPK通路中c-Fos蛋白水平表達(dá)，從而遏制OC的骨吸收作用。Ohyama等[26]發(fā)現(xiàn)類黃酮化合物能抑制OC前體細(xì)胞向OC分化，從而阻斷脂多糖誘導(dǎo)的骨性破壞。此外，ERK和JNK通路是OC分化的關(guān)鍵，而Sudachitin可阻斷骨細(xì)胞內(nèi)ERK和JNK通路的激活，發(fā)揮抑制OC分化的作用。因此，通過實(shí)驗(yàn)得出類黃酮可降低MAPK信號(hào)通路的活性來抑制OC分化，降低骨吸收功能，達(dá)到治療OP的目的。而ICA是類黃酮化合物的一種，因此ICA抗OP的作用可能是經(jīng)由MAPK通路介導(dǎo)的。

3.3 淫羊藿苷介導(dǎo)MAPK通路促進(jìn)BMSCs成骨分化

目前研究發(fā)現(xiàn)BMSCs具有多方位分化功能，通常被廣泛應(yīng)用于組織工程中，但是BMSCs的遷移能力較差，限制了對(duì)骨細(xì)胞的修復(fù)效果，當(dāng)ICA激活MAPK通路后可恢復(fù)BMSCs修復(fù)功能。同時(shí)，通過上調(diào)ELK1和c-Myc等MAPK下游轉(zhuǎn)錄因子，可促進(jìn)BMSCs成骨分化，從而提高鈣沉積面積，發(fā)揮抗OP的作用[27]。Qin等[28]通過實(shí)驗(yàn)證明ERK或p38 MAPK的特異性抑制劑能夠阻斷ICA誘導(dǎo)的蛋白激活，并顯著降低BMSCs成骨分化，證實(shí)了ICA介導(dǎo)ERK和p38 MAPK促進(jìn)BMSCs成骨分化的作用。由此可知，ICA通過MAPK通路能夠促進(jìn)BMSCs成骨分化，從而提高鈣沉積面積，達(dá)到預(yù)防OP的目的。但筆者認(rèn)為目前仍缺乏相關(guān)機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究，需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

4 總結(jié)與展望

隨著我國老齡化程度日益加重，骨質(zhì)疏松癥的患病人數(shù)呈現(xiàn)逐年上升趨勢，這給個(gè)人、家庭和社會(huì)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，為此深入研究OP的發(fā)生機(jī)制與抗OP的藥物變得尤為重要。目前補(bǔ)腎中藥淫羊藿在治療OP方面取得了良好的臨床效果，其主要藥效成分ICA介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路防治OP的有效作用機(jī)制也通過上述實(shí)驗(yàn)研究得到證實(shí)。因此，本綜述將ICA與MAPK信號(hào)通路相結(jié)合，通過刺激MAPK通路來促進(jìn)OB增殖分化，提高骨的鈣化率；通過抑制OC分化，降低骨吸收；通過促進(jìn)BMSCs成骨分化，加快鈣鹽沉積，從而達(dá)到防治OP的效果。然而BMSCs成脂分化增多也可誘導(dǎo)OP的發(fā)生，目前有研究表明ICA可通過Wnt信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs成骨分化、抑制成脂分化，進(jìn)而發(fā)揮抗OP的作用。筆者研究發(fā)現(xiàn)ICA介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路能夠促進(jìn)BMSCs成骨分化，而ICA能否介導(dǎo)MAPK信號(hào)通路抑制BMSCs成脂分化有待進(jìn)一步研究。除此之外，ICA激活cAMP-PKA、NF-κB、Wnt等信號(hào)通路也可在OB、OC、BMSCs的增殖、分化以及凋亡過程中產(chǎn)生相應(yīng)的影響，但其相關(guān)分子機(jī)制的研究還需加強(qiáng)完善。綜上所述，盡管當(dāng)前國內(nèi)外仍缺乏ICA治療OP的大量動(dòng)物或臨床樣本的實(shí)驗(yàn)研究，但隨著對(duì)ICA治療OP機(jī)制研究的不斷深入，ICA有望成為臨床上防治OP疾病的關(guān)鍵藥物。