膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎相關(guān)炎癥及軟骨代謝標(biāo)志物的表達(dá)與臨床意義

黃遠(yuǎn) 劉日光 張沕 董亮宏 楊嘉飛 石豪 王愛民 楊正杰 李光第*

1.銅仁市人民醫(yī)院骨科，貴州 銅仁 554300 2.貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨科，貴州 貴陽 550004 3.黔東南州人民醫(yī)院骨科，貴州 凱里 556000

膝關(guān)節(jié)骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是常見的慢性骨關(guān)節(jié)疾病，因現(xiàn)有診斷方法的局限性，臨床上很難發(fā)現(xiàn)最早期KOA，當(dāng)患者因各種不適就診時，膝關(guān)節(jié)已經(jīng)發(fā)生了不可逆性損傷。因此，深入研究KOA發(fā)病機(jī)制，尋找到有效的治療靶點(diǎn)，早期診斷已成為醫(yī)學(xué)上亟待解決的問題。KOA的發(fā)病有一個“沉默期”，在此期間患者沒有任何臨床癥狀，影像學(xué)檢查也沒有異常，但關(guān)節(jié)組織已經(jīng)發(fā)生廣泛的代謝改變[1-2]。生物標(biāo)志物(Biomarker，BM)是指能客觀測量并且可以評估正常生理代謝過程、病理變化以及治療效果的生化指標(biāo)[3-4]。在影像學(xué)改變之前，血液、尿液及關(guān)節(jié)液等體液組織中的BM能夠動態(tài)地反映關(guān)節(jié)組織代謝狀況，評估關(guān)節(jié)組織病變程度，已經(jīng)得到國內(nèi)外學(xué)者的認(rèn)可[5-7]。監(jiān)測體液BM的變化情況，及時發(fā)現(xiàn)早期病變并采取有效治療措施，這將對KOA早期診斷、病程監(jiān)測以及療效評估起到積極的指導(dǎo)作用[8-9]。KOA的病理生理變化，尤其是局部炎癥反應(yīng)及關(guān)節(jié)軟骨的破壞是骨科領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)，有研究者提出單一生物標(biāo)志物的檢測靈敏度相對較差，若能將幾項(xiàng)標(biāo)志物聯(lián)合檢測，可更加準(zhǔn)確地反映病變情況[10-11]。

本研究以KOA患者為研究對象，采集血清、尿液、關(guān)節(jié)液以及關(guān)節(jié)軟骨標(biāo)本，聯(lián)合檢測COMP、MMP-13、Cbf-β的表達(dá)情況。本研究采取自愿參與的原則且通過貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院倫理委員會審批，批件號：2018倫審(15)號。并在中國臨床試驗(yàn)注冊中心(Chinese clinical trial registry，ChiCTR)注冊登記，注冊號：ChiCTR1800017066。

1 材料與方法

1.1 體液部分

1.1.1一般資料：納入2018年6月至2019年1月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)外科收治，行人工全膝關(guān)節(jié)置換的KOA患者22例為試驗(yàn)組。納入同期行關(guān)節(jié)腔注射治療的KOA患者22例為對照組。納入健康志愿者18例為健康對照組。

1.1.2納入排除標(biāo)準(zhǔn)：納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合KOA的診斷標(biāo)準(zhǔn)[12-13]；②既往無膝關(guān)節(jié)感染及手術(shù)外傷史；③既往無關(guān)節(jié)穿刺及注射治療史；④無激素、免疫抑制劑等藥物服用史；⑤沒有嚴(yán)重的系統(tǒng)性疾病且肝、腎功能無明顯異常。排除標(biāo)準(zhǔn)：①腫瘤、結(jié)核等慢性消耗性疾??；②痛風(fēng)、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎等其他類型骨關(guān)節(jié)疾?。虎巯忍煨砸蛩厮孪リP(guān)節(jié)畸形及功能障礙；④患有精神類疾病不能配合研究者；⑤不同意參與試驗(yàn)及未簽署知情同意書的患者。

1.1.3實(shí)驗(yàn)方法：血清、尿液、關(guān)節(jié)液標(biāo)本采集后分裝于1.5 mL EP管，凍存于-80 ℃冷庫。采用酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)測定標(biāo)本中COMP、MMP-13、Cbf-β的表達(dá)情況。COMP、MMP-13試劑盒購于武漢華美公司，Cbf-β試劑盒購于上海酶聯(lián)生物科技有限公司。具體操作步驟如下：①標(biāo)準(zhǔn)品加樣：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣本孔，標(biāo)準(zhǔn)品孔各加不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品 50 μL；②加樣：分別設(shè)空白孔和待測樣品孔。在待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品 10 μL；③加酶：每孔加入酶標(biāo)試劑 100 μL，空白孔除外；④溫育60 min；⑤配液：將20倍濃縮洗滌液用蒸餾水20倍稀釋后備用；⑥洗滌：每孔加滿洗滌液，靜置 30 s后棄去，如此重復(fù)5次；⑦顯色：每孔先加入顯色劑A 50 μL，再加入顯色劑B 50 μL顯色15 min；⑧終止：每孔加終止液50 μL，終止反應(yīng)(藍(lán)色立轉(zhuǎn)黃色)；⑨測定：以空白孔調(diào)零，450 nm 波長依序測量各孔的吸光度(OD 值)。

1.2 軟骨組織部分

1.2.1一般資料：納入2018年6月至2019年1月貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院骨關(guān)節(jié)科收治，行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的KOA患者22例為試驗(yàn)組，納入同期外傷急診截肢患者8例為對照組。納入排除標(biāo)準(zhǔn)同第一部分，正常對照組軟骨取自年齡大于18歲急診截肢患者，排除KOA或關(guān)節(jié)慢性疼痛病史，既往無膝關(guān)節(jié)外傷、感染、手術(shù)等情況。

1.2.2試驗(yàn)方法：采集膝關(guān)節(jié)軟骨組織標(biāo)本，觀察其大體結(jié)構(gòu)并做好記錄，取脛骨平臺全層軟骨，成塊狀取下，置于5 mL EP管，4%多聚甲醛浸泡固定。另一部分成片狀切下，置于5 mL EP管，-80 ℃冷庫凍存。通過番紅O固綠染色觀察軟骨組織病變情況，應(yīng)用免疫組化法檢測軟骨組織Ⅱ型膠原表達(dá)情況。應(yīng)用免疫印跡蛋白定量法(Western Blot)檢測軟骨組織COMP、MMP13、Cbf-β蛋白的表達(dá)情況。

1.2.3主要實(shí)驗(yàn)試劑與儀器：番紅-固綠染色試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)，即用型免疫組化二抗試劑盒(福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司)，COMP、MMP-13、Cbf-β抗體(北京博奧森生物技術(shù)有限公司)，β-actin抗體(Abclonal公司)，EDTA脫鈣液(北京雷根生物技術(shù)有限公司)，微量移液器(Eppendorf公司)，冷凍離心機(jī)(Thermo公司)，漩渦振蕩儀(Labnet公司)，電泳儀(Bio-rad公司)、垂直電泳槽(Bio-rad公司)、化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Bio-rad公司)。

1.2.4實(shí)驗(yàn)步驟：(1)番紅O固綠染色：將固定的軟骨組織塊EDTA脫鈣液脫鈣后，石蠟包埋、切片，入固綠染色液內(nèi)浸染5 min弱酸溶液洗滌后，入 Safranin O stain 內(nèi)浸染 5 min，顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。(2)Ⅱ型膠原免疫組化：將固定的軟骨組織行免疫組織化學(xué)染色。具體操作步驟如下：①石蠟切片脫蠟；②抗原修復(fù)：組織切片置于修復(fù)盒中于微波爐內(nèi)進(jìn)行抗原修復(fù)；③阻斷內(nèi)源性過氧化物酶：切片放入3%過氧化氫溶液孵育25 min；④BSA或者血清封閉：用組化筆在組織周圍畫圈，在圈內(nèi)滴加用3%BSA均勻覆蓋組織，封閉30 min；⑤孵育一抗，再使用二抗；⑥D(zhuǎn)AB顯色：滴加DAB顯色液，陽性為棕黃色；⑦復(fù)染細(xì)胞核；⑧脫水封片；⑨顯微鏡鏡檢，圖像采集分析。采用Image Pro-Plus 6.0軟件，分析每張片子陽性細(xì)胞的累計(jì)光密度值(IOD)。(3)蛋白水平Western Blot 檢測：將凍存的軟骨組織在液氮中研磨后提取蛋白，BCA 法測定各組蛋白濃度。根據(jù)測定的蛋白含量作為參照，每個膠孔加入等量蛋白，再以β-actin為參照驗(yàn)證蛋白含量。重復(fù)實(shí)驗(yàn)調(diào)整蛋白上樣量使其一致，使用統(tǒng)一蛋白上樣量進(jìn)行SDS-PAGE，每個蛋白上樣40 μg進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，孵育一抗，再使用二抗，以Bio-Rad化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)顯色，結(jié)果使用Image J 2X軟件對Western-Blot條帶進(jìn)行半定量，分析其讀數(shù)，最后以β-actin作為內(nèi)參計(jì)算樣本的相對表達(dá)量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 25.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)或單因素方差分析，計(jì)數(shù)資料比較采用卡方檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 體液部分試驗(yàn)結(jié)果

2.1.1一般資料比較：見表1。

表1 體液部分各組基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data of body fluid between each group

2.1.2血清標(biāo)本檢測結(jié)果：三組受試者血清中均檢測到COMP、MMP-13、Cbf-β的表達(dá)，各因子在健康對照組、試驗(yàn)對照組、試驗(yàn)組間的表達(dá)均逐漸增高，經(jīng)單因素方差分析，COMP、MMP-13、Cbf-β在試驗(yàn)組、試驗(yàn)對照組以及健康對照組血清的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001、0.001、0.001)。見圖1。

圖1 各組血清標(biāo)本BM檢測結(jié)果Fig.1 Detection results of BM in serum samples of each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.1.3尿液檢測結(jié)果：三組受試者尿液中均檢測到COMP、MMP-13的表達(dá)，各因子在健康對照組、試驗(yàn)對照組、試驗(yàn)組間的表達(dá)均逐漸增高，經(jīng)單因素方差分析，COMP、MMP-13在試驗(yàn)組、試驗(yàn)對照組以及健康對照組尿液的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001、0.001)。見圖2。

圖2 各組尿液標(biāo)本BM檢測結(jié)果Fig.2 Detection results of BM in urine samples of each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.1.4關(guān)節(jié)液檢測結(jié)果：三組受試者關(guān)節(jié)液中均檢測到COMP、MMP-13、Cbf-β的表達(dá)，各因子在健康對照組、試驗(yàn)對照組、試驗(yàn)組間的表達(dá)逐漸增高，經(jīng)單因素方差分析，COMP、MMP-13、Cbf-β在試驗(yàn)組、試驗(yàn)對照組以及健康對照組關(guān)節(jié)液的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001、0.001、0.001)。見圖3。

圖3 各組關(guān)節(jié)液標(biāo)本BM檢測結(jié)果Fig.3 Detection results of BM in synovial fluid samples of each group注：*P<0.05，**P<0.01。

2.2 軟骨組織試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1一般資料比較：見表2。

表2 軟骨組織各組基線資料比較

2.2.2番紅O固綠染色結(jié)果：番紅O固綠染色可見對照組軟骨基質(zhì)紅染均勻，軟骨下骨呈綠色，軟骨與軟骨下骨界限清楚，結(jié)構(gòu)整齊。實(shí)驗(yàn)組軟骨結(jié)構(gòu)層次紊亂，軟骨基質(zhì)染色較淡，并且紅染范圍小，提示試驗(yàn)組病變膝關(guān)節(jié)軟骨基質(zhì)破壞、減少；而綠染范圍大，提示試驗(yàn)組膝關(guān)節(jié)軟骨病變較重。見圖4。

圖4 軟骨組織番紅O染色結(jié)果Fig.4 Results of Safranin O fast green staining in the cartilage

2.2.3免疫組化結(jié)果：試驗(yàn)組軟骨組織Ⅱ型膠原蛋白的表達(dá)較對照低，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，Ⅱ型膠原蛋白在試驗(yàn)組與對照組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001)。見圖5。

圖5 軟骨組織Ⅱ型膠原表達(dá)情況Fig.5 Expression of type II collagen in the cartilage注：*P<0.05，**P<0.01。

2.2.4Western Blot檢測結(jié)果：試驗(yàn)組軟骨組織COMP、MMP-13、Cbf-β的表達(dá)均高于對照組，經(jīng)獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，COMP、MMP-13、Cbf-β在試驗(yàn)組與對照組的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.001、0.002、0.002)。見圖6。

圖6 軟骨組織BM表達(dá)情況Fig.6 Expression of BM in the cartilage注：*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

3 討論

血液、尿液及關(guān)節(jié)液內(nèi)生物標(biāo)志物的變化可反映KOA的病變嚴(yán)重程度，預(yù)測疾病的進(jìn)展，近年來引起廣大醫(yī)學(xué)研究人員的重視[14-15]。致病因素的持續(xù)存在使軟骨代謝發(fā)生改變時，軟骨基質(zhì)合成與分解代謝的動態(tài)平衡被打破，其代謝過程中的小分子產(chǎn)物是生物標(biāo)志物最豐富的來源[16]。

血清COMP可作為OA病變的特異性生物標(biāo)志物，輔助OA的早期診斷，并且在預(yù)測疾病快速進(jìn)展的危險性方面有一定的參考價值[17-18]。Kluzek等[19]研究表明，血清COMP可以預(yù)測KOA的發(fā)生發(fā)展，并且獨(dú)立于年齡和BMI等發(fā)病高危因素。MMP-13是最有效的Ⅱ型膠原降解酶，可有效降解軟骨基質(zhì)，促進(jìn)軟骨病變的進(jìn)展，有研究表明MMP-13在KOA患者血清高表達(dá)，其表達(dá)含量與膝關(guān)節(jié)病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)[20-21]。也有研究報道在KOA患者血清中同時檢測到COMP與MMP-13的高表達(dá)，與K-L分級、WOMAC評分呈正相關(guān)，提示血清COMP和MMP-13聯(lián)合測定可動態(tài)監(jiān)測KOA膝關(guān)節(jié)病變的進(jìn)展，在早期診斷、病情評估等方面有一定的參考意義[22]。有文獻(xiàn)指出Cbf-β可能通過增強(qiáng)Runx2與DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄活化也參與到骨性關(guān)節(jié)炎的病變調(diào)控[23-24]，本研究在KOA患者及健康志愿者血清中檢測到了Cbf-β的表達(dá)，KOA患者明顯高于健康志愿者，同COMP與MMP-13一致，在病變較重的試驗(yàn)組高于病變較輕的試驗(yàn)對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示血清Cbf-β可能是KOA潛在的生物標(biāo)志物，對于KOA的早期診斷及病情評估有一定的參考價值，聯(lián)合檢測血清COMP、MMP-13、Cbf-β的表達(dá)，可能更準(zhǔn)確地反映KOA患者膝關(guān)節(jié)軟骨的病變進(jìn)展程度。

既往對于KOA相關(guān)生物標(biāo)志物的研究多集中在血清及關(guān)節(jié)液，而關(guān)于尿液生物標(biāo)志物的研究較少，因其獲取簡單并且無創(chuàng)采集的特點(diǎn)，使得尿液生物標(biāo)志物研究越來越受到重視。有學(xué)者指出尿液蛋白質(zhì)組學(xué)的研究有助于更好地了解身體的動態(tài)變化并識別潛在的疾病特異性生物標(biāo)志物[25-26]，其代謝產(chǎn)物的改變可以反映組織器官的代謝狀況[27]。有文獻(xiàn)指出COMP及CTX-II在KOA患者尿液中高表達(dá)，其含量隨K-L分級的增加而逐漸升高，可作為KOA診斷及嚴(yán)重程度評估的參考標(biāo)志物[29]。本研究在KOA患者尿液中檢測到COMP、MMP-13的高表達(dá)，KOA患者明顯高于健康志愿者，并且試驗(yàn)組表達(dá)高于試驗(yàn)對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。提示尿液COMP、MMP-13可能在KOA的早期診斷，病情評估具有重要的參考意義。

關(guān)節(jié)病損后組織結(jié)構(gòu)以及細(xì)胞代謝的變化可以通過關(guān)節(jié)液的變化來體現(xiàn)[30]。KOA軟骨病變后相關(guān)代謝產(chǎn)物直接釋放于關(guān)節(jié)液，關(guān)節(jié)液內(nèi)代謝相關(guān)標(biāo)志物的變化可以靈敏地反映關(guān)節(jié)軟骨的病理變化[31]。研究表明KOA患者關(guān)節(jié)液內(nèi)COMP的表達(dá)與病變程度以及疾病進(jìn)展有一定的相關(guān)性，可作為OA的診斷性標(biāo)志物[32]。也有文獻(xiàn)表明在KOA患者關(guān)節(jié)液內(nèi)檢測到COMP的高表達(dá)，表達(dá)水平與關(guān)節(jié)損傷的影像學(xué)表現(xiàn)呈正相關(guān)，提示關(guān)節(jié)液COMP對KOA軟骨破壞的監(jiān)測有一定的參考價值[33-34]。MMP-13作為軟骨基質(zhì)有效的降解酶，在膝關(guān)節(jié)病變過程中起到了關(guān)鍵作用，?zler等[34]研究表明，重度KOA患者關(guān)節(jié)液內(nèi)MMP-13的表達(dá)與WOMAC評分顯著相關(guān)。本研究在試驗(yàn)組、試驗(yàn)對照組、健康對照組關(guān)節(jié)液中均檢測到了COMP、MMP-13、Cbf-β的表達(dá)，KOA患者顯著高于健康志愿者，并且試驗(yàn)組高于試驗(yàn)對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示關(guān)節(jié)液內(nèi)COMP、MMP-13、Cbf-β的表達(dá)含量可能與KOA病變嚴(yán)重程度呈正相關(guān)性，可反映病變的嚴(yán)重程度。

軟骨破壞是KOA的特征性病變，本研究在試驗(yàn)組及對照組軟骨組織標(biāo)本均檢測到了COMP、MMP-13、Cbf-β的表達(dá)，試驗(yàn)組顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示COMP、MMP-13、Cbf-β可能參與了KOA病變進(jìn)程，進(jìn)一步驗(yàn)證了三者在血清、尿液、關(guān)節(jié)液內(nèi)表達(dá)對疾病診斷、病情評估的參考意義。

綜上所述，聯(lián)合檢測COMP、MMP-13、Cbf-β在血清、尿液、關(guān)節(jié)液及關(guān)節(jié)軟骨的表達(dá)，有助于KOA的早期診斷，也可為病變嚴(yán)重程度的評估提供參考依據(jù)。但是在軟骨部分的試驗(yàn)結(jié)果中，兩組在年齡因素比較中差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，分析原因如下，受疾病好發(fā)人群的年齡限制，在臨床中行人工全膝關(guān)節(jié)置換術(shù)的KOA患者和同期外傷急診截肢患者相比年齡偏大，盡管正常對照組僅納入年齡大于18歲的患者，但因可取材患者有限，難以消除統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。且本研究僅以貴州醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院就診的小部分KOA患者為研究對象，并且多數(shù)為病變較重，K-L分級Ⅲ級、Ⅳ級者，因此今后仍需多中心、大樣本，納入更多Ⅰ、Ⅱ級KOA患者的研究進(jìn)一步探討。