仙靈骨葆膠囊聯(lián)合阿侖膦酸鈉對(duì)骨質(zhì)疏松骨折大鼠骨痂血管形成的影響

何瑞娟 李曉良 杜雨辰 白露 談旭

1.濮陽(yáng)醫(yī)學(xué)高等專(zhuān)科學(xué)校教務(wù)處，河南 濮陽(yáng) 457000 2.濮陽(yáng)市中醫(yī)院骨科，河南 濮陽(yáng) 457000 3.濮陽(yáng)市人民醫(yī)院藥劑科，河南 濮陽(yáng) 457000

骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fracture，OPF)作為骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)最嚴(yán)重的并發(fā)癥，嚴(yán)重威脅著中老年人群的身心健康和生活質(zhì)量[1-2]。因此，探索行之有效的藥物研究有著非同尋常的意義，隨著祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的發(fā)展，中藥治療骨質(zhì)疏松及骨折歷史悠久，具有療效確切、不良反應(yīng)少等優(yōu)點(diǎn)。中草藥仙靈骨葆膠囊可促進(jìn)骨形成，抑制骨吸收，降低骨轉(zhuǎn)換，加速骨折早期骨痂形成，促進(jìn)骨折愈合，臨床用于OP和OPF的預(yù)防和治療[3]。阿侖膦酸鈉是以O(shè)P為適應(yīng)證而獲準(zhǔn)上市的第3代雙膦酸鹽類(lèi)藥物，增加骨量，提高骨強(qiáng)度，降低骨折發(fā)生概率[4]。目前中西醫(yī)結(jié)合防治OPF，可減少不良反應(yīng)和毒副作用的發(fā)生。本研究旨在探討通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察仙靈骨葆膠囊聯(lián)合阿侖膦酸鈉對(duì)骨折愈合過(guò)程VEGF和BMP-2表達(dá)及血管形成的影響，探索其潛在的作用機(jī)制，為中西醫(yī)結(jié)合防治OPF提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑與材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：健康3月齡Sprague-Dawley雌性大鼠75只，體重為(252.53±30.32)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK(豫)2017-0001，飼養(yǎng)于鄭州大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度(23±3)℃，室溫(25±2)℃，相對(duì)濕度(60±5)%，12 h明暗光照交替，自由進(jìn)食水，紫外線定期消毒，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。嚴(yán)格遵循實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理，各組大鼠均分籠飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境條件均相同。

1.1.2實(shí)驗(yàn)藥物及試劑：仙靈骨葆膠囊[0.5 g/粒，國(guó)藥準(zhǔn)字：Z20025337，生產(chǎn)批號(hào)：141226，國(guó)藥集團(tuán)同濟(jì)堂(貴州)制藥有限公司]，阿侖膦酸鈉片(福善美)(70 mg*1 s，生產(chǎn)批號(hào)：J20170085，美國(guó)默沙東制藥有限公司)。兔抗鼠VEGF和BMP-2多克隆抗體購(gòu)于德國(guó)ChromoTek公司，XR-36型雙能X線骨密度儀(DXA)購(gòu)于美國(guó)NORLAND公司，計(jì)算機(jī)X射線攝像儀購(gòu)于日本Konica Minolta公司，SkyScan1278 micro-CT購(gòu)于德國(guó)布魯克公司，Olympus BX53光學(xué)顯微鏡購(gòu)于上海富萊光學(xué)科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1構(gòu)建去卵巢骨質(zhì)疏松性骨折模型：參照文獻(xiàn)方法構(gòu)建去卵巢大鼠骨質(zhì)疏松性骨折模型的建立與內(nèi)固定方法[5]。麻醉、備皮、消毒、鋪巾，背側(cè)后方髂骨棘上2 cm取縱行切口1 cm，逐層分離，暴露腹腔，切除卵巢，以絲線將殘端結(jié)扎輸卵管，關(guān)閉后腹膜，逐層縫合關(guān)閉切口，假手術(shù)組僅切除卵巢周?chē)窘M織。4周后經(jīng)檢測(cè)各組大鼠右側(cè)股骨骨密度，以確定模型制備成功。再次麻醉后右側(cè)股骨中段外側(cè)2 cm縱行切口，沿股外側(cè)肌間隙鈍性分離，顯露股骨干，線鋸鋸斷股骨干中1/3段成橫行骨折，克氏針逆行穿入骨折近端髓腔且穿出股骨髁，復(fù)位骨折后再將其順行穿入骨折遠(yuǎn)段髓腔，固定牢靠后在股骨髁處截?cái)喽嘤嗫耸厢槪睇}水沖洗，逐層關(guān)閉傷口。術(shù)后給予慶大霉素8萬(wàn)U肌肉注射，連續(xù)3 d。

1.2.2實(shí)驗(yàn)分組：本實(shí)驗(yàn)在造模期間無(wú)動(dòng)物死亡，所有動(dòng)物經(jīng)X射線骨密度儀篩選均合格。將50只大鼠按隨機(jī)數(shù)字法分為：假手術(shù)組(SHAM組)、模型組(MODEL組)、仙靈骨葆組(XLGB組)、阿侖膦酸鈉組(ALLSN組)、聯(lián)合藥物組(LHYW組)，每組10只。XLGB組：仙靈骨葆膠囊，0.25 mg/kg，ig，1次/d；ALLSN組：阿侖膦酸鈉片0.25 mg/kg，ig，1次/周；LHYW組：仙靈骨葆膠囊，0.25 mg/kg，ig；阿侖膦酸鈉片0.25 mg/kg，ig，1次/周；SHAM組和MODEL組：等量0.9% NaCl，ig，1次/d，連續(xù)給藥8周。

1.2.3標(biāo)本采集與處理：建模8周后行計(jì)算機(jī)X射線攝像儀攝片后，采取脫頸法處死各組大鼠，10%水合氯醛麻醉，攝片后采用急性大失血法處死，取出右側(cè)股骨，完整分離右側(cè)整段股骨及骨痂，截取以骨折處為中點(diǎn)長(zhǎng)約2 cm股骨，0.9%生理鹽水沖洗，先檢測(cè)骨密度，10%多聚甲醛固定24 h，75%乙醇過(guò)夜，待micro-CT檢測(cè)，另取部分股骨，10%EDTA-2Na脫鈣5周，每周更換脫鈣液，脫水透明，石蠟包埋，5 μm連續(xù)切片，60 ℃烤箱備用。

1.2.4計(jì)算機(jī)X射線攝像儀攝片(CR)：取出右側(cè)股骨干，采用CR攝片，參數(shù)：電流3.2 mA/s，電壓40 kV，距離90 cm，觀察骨折斷端骨痂連續(xù)性及骨折愈合情況。

1.2.5雙能X線吸收(DEXA)法檢測(cè)骨密度：取出待測(cè)股骨，將右側(cè)全長(zhǎng)股骨3等分，采用小物體掃描模式，分別檢測(cè)股骨遠(yuǎn)1/3段骨密度(dBMD)和中1/3段骨密度(mBMD)和全長(zhǎng)骨密度(tBMD)，參數(shù)：準(zhǔn)確度0.01%，掃描速度60 mm/s，分辨率1.0 mm×1.0 mm，掃描寬度5.0 cm，連續(xù)測(cè)量BMD各5次。

1.2.6Mirco-CT檢測(cè)骨痂結(jié)構(gòu)形態(tài)學(xué)參數(shù)：采用Micro-CT-40對(duì)骨痂感興趣區(qū)域進(jìn)行掃描，參照機(jī)器操作步驟，參數(shù)設(shè)置，掃描范圍：上下界范圍：以骨折線為中心向上下分別取381層軸位片，外側(cè)范圍：可見(jiàn)的骨痂最外側(cè)骨性輪廓，內(nèi)側(cè)范圍：股骨外側(cè)緣，重構(gòu)圖像數(shù)據(jù)后使用CT Analyser骨微結(jié)構(gòu)分析，相關(guān)參數(shù)：骨小梁數(shù)量(TB.N)、骨小梁厚度(TB.Th)、骨小梁分離度(Th.Sp)和骨小梁骨體積分?jǐn)?shù)(BV/TV)。

1.2.7番紅O固綠染色觀察骨痂組織形態(tài)學(xué)：使用改良番紅固綠試劑盒中的試劑按操作流程進(jìn)行染色，二甲苯脫蠟，無(wú)水酒精及酒精水化，Weigert A液和Weigert B液等比例混合，染核3 min，鹽酸乙醇分化溶液中分化1 min；流水沖洗反藍(lán)，滴加固綠染液，乙酸溶液分化30 s。1%番紅O染液染6 min，95%乙醇溶液分化，直到骨性組織番紅染液褪去，與軟骨組織區(qū)分明顯后終止分化。再次脫水，透明，封片。隨機(jī)選擇5張矢狀位的不連續(xù)切片，Olympus光鏡下觀察骨小梁的形態(tài)結(jié)構(gòu)。

1.2.8免疫組織化學(xué)(SP)法檢測(cè)骨痂VEGF和BMP-2表達(dá)：參照SP法實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作[6]。嚴(yán)格按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，標(biāo)本切片脫蠟至水，0.3% H2O2封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，滴加兔抗鼠多克隆抗體BMP-2和VEGF(1∶400)50 μm，置于濕盒中4 ℃孵育過(guò)夜，PBS液替代一抗作為陰性對(duì)照。滴加生物素化抗兔二抗(1∶400)，DAB顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明和封固。光學(xué)顯微鏡觀察并采集涂片，以細(xì)胞膜、細(xì)胞漿呈棕黃色或棕黑色反應(yīng)為陽(yáng)性反應(yīng)，統(tǒng)計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞積分吸光度值進(jìn)行IRS半定量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

50只實(shí)驗(yàn)大鼠均進(jìn)入實(shí)驗(yàn)結(jié)果分析。

2.1 各組大鼠右股骨X線分析結(jié)果

SHAM組骨折線模糊，骨皮質(zhì)完整，斷端有明顯的骨痂形成，形成堅(jiān)實(shí)致密的高密度骨影。MODEL組骨折線清晰可見(jiàn)，斷端未出現(xiàn)連接，均無(wú)不愈合跡象，骨痂骨性骨影較少。XLGB組和ALLSN組骨折線較模糊，斷端可見(jiàn)部分膨大骨痂形成，并未完全連接。LHYY組骨折線模糊，骨折痕跡基本消失，骨痂體積和量較多，形成纖維包繞。與SHAM組(4.573±0.220)比較，MODEL組(2.608±0.135)骨折愈合評(píng)分顯著降低(P<0.05)；與MODEL組比較，XLGB組(3.953±0.215)、ALLSN組(4.058±0.288)和LHYY組(4.320±0.235)骨折愈合評(píng)分均顯著升高(P<0.05)，尤以LHYY組最高。見(jiàn)圖1。

圖1 X線觀察各組大鼠右股骨骨折愈合情況A：SHAM組；B：MODEL組；C：XLGB組；D：ALLSN組；E：LHYY組Fig.1 X-ray observation of the healing of the right femoral fractures of rats in each groupA: SHAM group；B: MODEL group；C: XLGB group；D: ALLSN group；E: LHYY group

2.2 各組大鼠右股骨骨密度測(cè)量結(jié)果

與SHAM組比較，MODEL組大鼠右側(cè)股骨tBMD、dBMD和mBMD均顯著降低(P<0.05)；與MODEL組比較，XLGB組、ALLSN組和LHYY組大鼠右側(cè)股骨tBMD、dBMD和mBMD均顯著升高(P<0.05)，尤以LHYY組最高。見(jiàn)表1。

表1 各組大鼠右股骨BMD比較

2.3 各組大鼠右股骨骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)分析

與SHAM組比較，MODEL組大鼠右股骨BV/TV、TB.N、TB.Sp和TB.Th均顯著降低(P<0.05)；與MODEL組比較，XLGB組、ALLSN組和LHYY組大鼠右股骨BV/TV、TB.N、TB.Sp和TB.Th均顯著升高(P<0.05)，尤以LHYY組最高。見(jiàn)圖2和表2。

表2 各組大鼠右股骨結(jié)構(gòu)形態(tài)參數(shù)比較Table 2 Comparison of morphological parameters of the right femur of rats between each group

圖2 各組大鼠右股骨Mirco-CT重建圖像A：SHAM組；B：MODEL組；C：XLGB組；D：ALLSN組；E：LHYY組Fig.2 Micro-CT reconstructed image of the right femur of rats in each groupA: SHAM group；B: MODEL group；C: XLGB group；D: ALLSN group；E: LHYY group

2.4 各組大鼠右股骨骨痂組織形態(tài)學(xué)觀察結(jié)果

SHAM組骨小梁結(jié)構(gòu)正常，密聚，粗細(xì)均勻，相互聯(lián)接成網(wǎng)狀，可見(jiàn)板層骨形成，并向骨性骨痂轉(zhuǎn)換。MODEL組骨小梁明顯稀疏斷裂，排列紊亂，骨髓腔擴(kuò)大，網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)破壞，結(jié)構(gòu)疏松，未見(jiàn)骨性骨痂。XLGB組和ALLSN組骨小梁增多，排列稍紊亂，大部分為骨性骨痂。LHYW組骨小梁明顯增多，粗細(xì)較均勻，排列密集整齊，相互聯(lián)接成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，幾乎均為骨性骨痂。見(jiàn)圖3。

圖3 番紅固綠染色觀察各組大鼠右股骨骨痂組織形態(tài)學(xué)(40×)A：SHAM組；B：MODEL組；C：XLGB組；D：ALLSN組；E：LHYY組Fig.3 Safranin fast green staining to observe the morphology of the right femoral callus of rats in each group (40×)A: SHAM group；B: MODEL group；C: XLGB group；D: ALLSN group；E: LHYY group

2.5 各組大鼠右股骨骨痂VEGF和BMP-2表達(dá)

VEGF主要表達(dá)于骨痂組織成骨細(xì)胞、成軟骨細(xì)胞、成纖維細(xì)胞，BMP-2主要表達(dá)于骨痂組織成骨細(xì)胞和骨小梁的邊緣。與SHAM組比較，MODEL組大鼠右股骨骨痂VEGF和BMP-2表達(dá)均顯著降低(P<0.05)；與MODEL組比較，XLGB組、ALLSN組和LHYY組大鼠右股骨骨痂VEGF和BMP-2表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，尤以LHYY組最高。見(jiàn)圖4、5和表3。

圖4 免疫組化觀察各組大鼠右側(cè)骨痂VEGF表達(dá)(200×)A：SHAM組；B：MODEL組；C：XLGB組；D：ALLSN組；E：LHYY組Fig.4 Immunohistochemical observation of the expression of VEGF in the right callus of rats in each group (200×)A: SHAM group；B: MODEL group；C: XLGB group；D: ALLSN group；E: LHYY group

圖5 免疫組化觀察各組大鼠右股骨骨痂BMP-2表達(dá)(200×)A：SHAM組；B：MODEL組；C：XLGB組；D：ALLSN組；E：LHYY組Fig.5 Immunohistochemical observation of BMP-2 expression in right femoral callus of rats in each group (200×)A: SHAM group；B: MODEL group；C: XLGB group；D: ALLSN group；E: LHYY group

表3 各組大鼠右股骨骨痂VEGF和BMP-2表達(dá)

3 討論

中醫(yī)理論將OP歸屬為“骨痿、骨痹、骨枯”等范疇[6]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為腎主骨，腎藏精，精生髓，髓生骨，骨枯髓減，發(fā)為骨痿，精足則髓足，髓足則骨強(qiáng)，腎精虧虛，骨髓無(wú)源，骨骼痿弱[7-8]。中醫(yī)藥防治OP緊緊圍繞腎主骨生髓理論[9]。仙靈骨葆膠囊是由淫羊藿、續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、知母、丹參、地黃等多味中藥組成傳統(tǒng)純中藥制劑，方中淫羊藿為主藥，配以續(xù)斷、補(bǔ)骨脂、知母、丹參、地黃等為佐使藥，全方共奏補(bǔ)腎滋陰、補(bǔ)腎壯陽(yáng)堅(jiān)筋骨、活血通絡(luò)和強(qiáng)筋壯骨，諸藥合用共奏防治“骨枯”之功效[10-11]。仙靈骨葆膠囊具有雌激素樣作用，促進(jìn)成骨細(xì)胞增殖、分化，調(diào)節(jié)骨代謝，增加骨量骨密度，降低骨高轉(zhuǎn)換率，防止骨質(zhì)疏松，同時(shí)能增加骨折局部血流量，加速骨痂形成，促進(jìn)骨質(zhì)修復(fù)和加快骨重建[12-13]。

骨折愈合是骨連續(xù)性恢復(fù)和骨結(jié)構(gòu)強(qiáng)度的重新獲得，是一系列復(fù)雜有序的骨組織再生過(guò)程[14]。研究表明血管生成與骨折愈合關(guān)系密切，新血管形成、恢復(fù)骨折斷端血供是骨折修復(fù)的前提，新血管生成提供骨愈合所需要的營(yíng)養(yǎng)及各種成骨細(xì)胞成分[15]。血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)作為機(jī)體內(nèi)作用最強(qiáng)高度特異性的促血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子，能促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，維護(hù)血管正常狀態(tài)及完整性，促進(jìn)新血管生成，同時(shí)還可促進(jìn)血管微環(huán)境生長(zhǎng)因子的表達(dá)，對(duì)骨的形成和重建有功能性的作用[16-17]。骨形態(tài)發(fā)生蛋白-2(bone morphogenetic protein-2，BMP-2)是骨折愈合關(guān)鍵性骨生長(zhǎng)細(xì)胞因子，誘導(dǎo)未分化間充質(zhì)細(xì)胞分化為成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞，促進(jìn)成骨細(xì)胞分化增殖，激活成骨細(xì)胞活性，增加骨量骨密度，加速骨重建骨形成，促進(jìn)骨折愈合[18]。

本研究結(jié)果表明MODEL組較SHAM組大鼠骨折愈合評(píng)分、骨密度、骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)、骨痂VEGF和BMP-2表達(dá)均顯著降低(P<0.05)，與MODEL組比較XLGB組、ALLSN組和LHYY組骨折愈合評(píng)分、骨密度、骨組織形態(tài)學(xué)參數(shù)、骨痂VEGF和BMP-2表達(dá)均顯著升高(P<0.05)，尤以LHYY組最高。SHAM組骨小梁結(jié)構(gòu)正常，幾乎均為骨性骨痂。MODEL組骨小梁明顯稀疏、斷裂，未見(jiàn)明顯骨性骨痂。XLGB組和ALLSN組骨小梁增多，排列稍紊亂，大部分為骨性骨痂。LHYW組骨小梁明顯增多，排列密集整齊，大量骨性骨痂。說(shuō)明仙靈骨葆膠囊聯(lián)合阿侖膦酸鈉可能通過(guò)介導(dǎo)提高骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨生長(zhǎng)因子VEGF和BMP-2表達(dá)，促進(jìn)骨痂血管形成，加速骨痂形成，增加骨密度，改善骨結(jié)構(gòu)形態(tài)，促進(jìn)骨折愈合。吳繼云等[19]研究發(fā)現(xiàn)仙靈骨葆膠囊可能通過(guò)提高骨折周?chē)浗M織TGF-β和VEGF表達(dá)，促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨折愈合過(guò)程。田發(fā)明等[20]研究發(fā)現(xiàn)仙靈骨葆膠囊可通過(guò)提高骨質(zhì)疏松骨折大鼠BMP-2表達(dá)，以增加骨痂局部血流量，加速骨痂血管形成，促進(jìn)骨折愈合。周油山等[21]研究發(fā)現(xiàn)仙靈骨葆聯(lián)合阿侖膦酸鈉能夠降低骨質(zhì)疏松癥患者骨轉(zhuǎn)換生化水平，提高骨密度，顯著提升治療有效率，療效確切，無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)。李明等[22]研究仙靈骨葆膠囊聯(lián)合阿侖膦酸鈉片可有效地改善骨質(zhì)疏松患者臨床癥狀、提高生活能力。

綜上所述，仙靈骨葆膠囊聯(lián)合阿侖膦酸鈉可促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折大鼠骨痂血管形成，加速骨痂形成，增加骨密度，改善骨結(jié)構(gòu)形態(tài)，促進(jìn)骨折愈合，其作用機(jī)制可能通過(guò)介導(dǎo)骨生長(zhǎng)因子VEGF和BMP-2表達(dá)密切相關(guān)。雖然聯(lián)合用藥臨床及實(shí)驗(yàn)研究均取得較大的進(jìn)展，但本研究?jī)H是初步結(jié)果，其具體作用機(jī)制目前尚未完全清楚，還有待于進(jìn)一步研究，中西結(jié)合為防治OPF提供了新的思路，但中藥及其復(fù)方制劑成分及作用機(jī)制復(fù)雜，應(yīng)將傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)辯證論治、整體調(diào)理的優(yōu)勢(shì)和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)理論充分結(jié)合起來(lái)，探討中西結(jié)合防治OP是未來(lái)研究的重點(diǎn)，為臨床治療及新藥研發(fā)提供依據(jù)，推動(dòng)祖國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的可持續(xù)發(fā)展，同時(shí)也為中草藥的應(yīng)用開(kāi)辟新的途徑。