腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞來源外泌體ciRS-7經(jīng)miR-7/IGF1R軸促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞糖酵解

谷甸娜，陳涵斌，錢方璟，陳揚(yáng)，葉志強(qiáng)

1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 腫瘤內(nèi)科，浙江 溫州 325015；2.溫州醫(yī)科大學(xué) 第一臨床醫(yī)學(xué)院，浙江 溫州 325035；3.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院 乳腺外科，浙江 溫州 325015

胰腺癌是目前已知惡性程度最高的腫瘤之一，其早期診斷困難，易于侵襲轉(zhuǎn)移，5年生存率只有5%左右[1]。胰腺癌組織內(nèi)富含大量的結(jié)締組織，血供不足造成缺氧、低營養(yǎng)的微環(huán)境，快速增殖的腫瘤更是增加了對物質(zhì)代謝的需求[2]。胰腺癌具有高水平的糖酵解代謝，這不僅可滿足腫瘤快速增殖時(shí)對ATP、生物大分子的需求，而且乳酸可酸化腫瘤微環(huán)境促進(jìn)轉(zhuǎn)移[3-4]。因此，探索通過阻斷胰腺癌糖酵解來控制腫瘤能量生成正備受關(guān)注。

環(huán)狀RNA ciRS-7又叫做小腦變性相關(guān)蛋白1 反義轉(zhuǎn)錄物（antisense to the cerebellar degeneration-related protein transcript, CDR1as），包含70多個(gè)miR-7的識別位點(diǎn)，可以抑制miR-7活性而提高miR-7靶基因表達(dá)[5]。本課題組之前的研究表明，miR-7可通過調(diào)控糖酵解代謝而抑制胰腺癌進(jìn)展[6]。胰腺癌微環(huán)境中最顯著的特征是含有密集的腫瘤相關(guān)成纖維細(xì)胞（cancer associated fibroblasts, CAFs），CAFs對于胰腺癌細(xì)胞不是簡單的旁觀者，而是腫瘤發(fā)展的關(guān)鍵推手[7]。前期預(yù)實(shí)驗(yàn)提示，由胰腺癌組織分離的CAFs可分泌大量外泌體，其內(nèi)具有高水平ciRS-7。本研究旨在探討CAFs經(jīng)外泌體ciRS-7對胰腺癌細(xì)胞糖酵解代謝的影響及其可能機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)及外泌體制備 人胰腺癌細(xì)胞PANC-1購自中國科學(xué)院（上海）；胰腺癌CAFs取自手術(shù)采集的新鮮胰腺癌組織，用差速貼壁法分離、純化后獲得胰腺癌CAFs，并進(jìn)行細(xì)胞鑒定。PANC-1、CAFs細(xì)胞培養(yǎng)于含10%去外泌體胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至75%～80%時(shí)，用胰酶消化、傳代培養(yǎng)。取對數(shù)期CAFs細(xì)胞接種到6孔板，每孔5×105個(gè)細(xì)胞，24 h后細(xì)胞使用LipofectamineTM3000轉(zhuǎn)染試劑，將敲降質(zhì)粒siRNA-ciRS-7、過表達(dá)質(zhì)粒EgciRS-7及對照質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至CAFs細(xì)胞（質(zhì)粒構(gòu)建參考文獻(xiàn)[8]），構(gòu)建敲降、過表達(dá)ciRS-7及對照質(zhì)粒胰腺癌CAFs，轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)48 h離心收集細(xì)胞上清液。將胰腺癌相關(guān)成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液吸入離心管并按如下梯度離心：4 ℃條件下，1 000×g離心10 min，3 000×g離心30 min，10 000×g離心60 min，100 000×g離心 70 min，將沉淀重懸于PBS緩沖液中。

1.2 納米粒子追蹤分析技術(shù)（nanoparticle tracking analysis, NTA）檢測外泌體粒徑及濃度 將提純的外泌體標(biāo)本用PBS稀釋50～100倍，PBS沖洗機(jī)器完成后，設(shè)置機(jī)器，多點(diǎn)讀數(shù)，用1 mL注射器將稀釋好的外泌體打入機(jī)器中，進(jìn)行測試。粒徑分析儀器：Nanosight NS300。

1.3 實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)（real-time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）法檢測CAFs外泌體中ciRS-7及胰腺癌細(xì)胞中糖酵解關(guān)鍵酶基因mRNA的表達(dá) 使用TRIzol試劑分別提取外泌體及胰腺癌細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照RT-PCR試劑盒說明書，在熒光定量PCR儀上檢測糖酵解通路上關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)水平，兩步法擴(kuò)增程序：第一步： 預(yù)變性95 ℃ 30 s循環(huán)1次；第二步：PCR反應(yīng)95 ℃ 5 s，60 ℃ 34 s，循環(huán)40次。引物序列見表1。

表1 RT-qPCR實(shí)驗(yàn)中所用引物序列

1.4 Western blot檢測蛋白 利用蛋白提取試劑盒提取PANC-1細(xì)胞總蛋白，轉(zhuǎn)移至PVDF膜，5%脫脂牛奶中封閉2 h，分別加入乳酸脫氫酶A（lactate dehydrogenase A, LDHA）抗體（美國Abcam公司，ab47010，1:2 000）、己糖激酶-II（hexokinase-II, HK-II）抗體（美國Abcam公司，ab227198，1:3 000）、胰島素樣生長因子1受體（insulin-like growth factor 1 receptor, IGF1R）抗體（美國Abcam公司，ab131476，1:500）、蛋白激酶B（protein kinase B, PKB，又稱AKT）抗體（美國Abcam公司，ab8805，1: 1 000）、磷酸化蛋白激酶B（phospho-protein kinase B, p-PKB，又稱p-AKT）抗體（美國Abcam公司，ab38449，1:1 000）在4 ℃孵育過夜，在室溫下，將膜與HRP標(biāo)記的二抗孵育2 h，洗膜后顯影掃描記錄數(shù)據(jù)。

1.5 雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn) 在胰腺癌細(xì)胞中，采用雙熒光素酶法確定ciRS-7與miR-7之間的關(guān)系。根據(jù)生物信息學(xué)軟件TargetScan的分析，構(gòu)建雙熒光素酶報(bào)告基因載體，包括pmirGLO-ciRS-7-WT及pmirGLO-ciRS-7-MT。野生型熒光報(bào)告質(zhì)粒序列片段ciRS-7-WT，突變ciRS-7與miR-7結(jié)合位點(diǎn)構(gòu)建ciRS-7-MT被克隆到pmirGLO載體（美國Promega公司）。將miR-7 mimics或miR-7 inhibitor與pmirGLO載體共轉(zhuǎn)染到PANC-1細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染48 h后，以海腎熒光素酶活性作為內(nèi)參，檢測螢火蟲熒光素酶活性/海腎熒光素酶活性的相對值，統(tǒng)計(jì)檢測結(jié)果。

1.6 胰腺癌細(xì)胞乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）活性、乳酸產(chǎn)量的檢測 分別按照LDH活性比色分析試劑盒、乳酸比色分析試劑盒II（美國BioVision公司）說明書檢測活性及乳酸生成。

1.7 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用CCK8試劑檢測細(xì)胞增殖。把胰腺癌細(xì)胞接種于96孔板，每孔接種3 000個(gè)細(xì)胞。至接種次日開始檢測，檢測時(shí)每孔加入10 μL CCK8試劑，待測樣品三復(fù)孔，37 ℃孵育2 h，用酶標(biāo)儀檢測450 nm處吸光度。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以±s表示，兩組間均數(shù)比較采用Student’st檢驗(yàn)；多組間均數(shù)比較用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 ciRS-7在胰腺癌CAFs外泌體中的表達(dá) CAFs培養(yǎng)上清液中的外泌體，采用NTA技術(shù)對分離獲得的顆粒的布朗運(yùn)動進(jìn)行追蹤和分析（見圖1A、圖1B）。進(jìn)一步檢測胰腺癌CAFs培養(yǎng)上清液中的外泌體ciRS-7的表達(dá)水平，RT-qPCR檢測結(jié)果顯示，與人胰腺星狀細(xì)胞（human pancreatic stellate cells, HPSC）相比，ciRS-7在CAFs外泌體中的表達(dá)水平顯著上調(diào)（P＜0.01），見圖1C。

圖1 ciRS-7在胰腺癌CAFs外泌體中的表達(dá)

2.2 胰腺癌CAFs釋放的外泌體促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞糖酵解和增殖 為了探究胰腺癌CAFs來源外泌體對胰腺癌糖酵解的影響，將分離出的外泌體用于處理胰腺癌細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)外泌體明顯促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的增殖（P＜0.01），并且提高了胰腺癌細(xì)胞的糖酵解水平 （P＜0.01），相反地，用去外泌體條件培養(yǎng)基上清液處理可抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖（P＜0.01）和糖酵解水平（P＜0.01）。見圖2。

圖2 胰腺癌CAFs釋放外泌體促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞糖酵解和增殖

2.3 敲降胰腺癌CAFs的ciRS-7表達(dá)后其外泌體可抑制胰腺癌細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因的表達(dá) 構(gòu)建過表達(dá)與敲降ciRS-7的胰腺癌CAFs，并驗(yàn)證其外泌體中ciRS-7的表達(dá)水平（P＜0.01）。將CAFs的外泌體加入PANC-1細(xì)胞，運(yùn)用RT-qPCR法檢測胰腺癌細(xì)胞糖酵解通路關(guān)鍵酶mRNA表達(dá)，Western blot檢測LDHA與HK-II蛋白的表達(dá)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)過表達(dá)ciRS-7提高了PANC-1細(xì)胞糖酵解關(guān)鍵酶mRNA水平（P＜0.01）和蛋白LDHA、HK2的表達(dá)（P＜0.01），而敲降ciRS-7組則下調(diào)了相應(yīng)基因的表達(dá)（P＜0.01）。見圖3。

圖3 敲降胰腺癌CAFs的ciRS-7表達(dá)后外泌體可抑制胰腺癌細(xì)胞糖酵解相關(guān)基因的表達(dá)

2.4 ciRS-7在胰腺癌細(xì)胞中經(jīng)miR-7/IGF1R/AKT通路促進(jìn)癌細(xì)胞糖酵解 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測提示，miR-7 mimics可降低ciRS-7-WT組的熒光素酶活性（P＜0.01），但不影響胰腺癌細(xì)胞ciRS-7-MT組的熒光素酶活性（P＞0.05）。為了闡明外泌體ciRS-7促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞糖酵解的機(jī)制，將過表達(dá)、敲降ciRS-7的CAFs培養(yǎng)基離心獲得外泌體加入胰腺癌細(xì)胞中（每1×106胰腺癌細(xì)胞中加入約1×108外泌體），檢測糖代謝相關(guān)通路上IGF1R基因的表達(dá)，以及下游AKT蛋白水平。結(jié)果觀察到miR-7的靶基因IGF1R mRNA表達(dá)及AKT蛋白被過表達(dá)ciRS-7組增強(qiáng)，加入miR-7 mimics可以逆轉(zhuǎn)IGF1R mRNA表達(dá)，而ciRS-7的敲低降低了IGF1R/AKT通路信號（P＜0.01），推測ciRS-7在胰腺癌細(xì)胞中可能經(jīng)miR-7/IGF1R/AKT通路促進(jìn)癌細(xì)胞糖酵解。見圖4。

圖4 ciRS-7在胰腺癌細(xì)胞中經(jīng)miR-7/IGF1R/AKT通路促進(jìn)癌細(xì)胞糖酵解

3 討論

CAFs是胰腺腫瘤微環(huán)境的重要基質(zhì)細(xì)胞[9]，可通過分泌外泌體和腫瘤細(xì)胞間進(jìn)行信息傳遞，在腫瘤的生長、轉(zhuǎn)移、血管新生、免疫逃逸、腫瘤耐藥中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[10-11]。在胰腺癌中，CAFs外泌體可調(diào)控胰腺癌的增殖和吉西他濱的耐藥[10]，然而有關(guān)外泌體對胰腺癌的糖酵解的影響尚未見報(bào)道，所以本研究定位于胰腺癌中CAFs分泌的外泌體對胰腺癌的糖酵解的研究，旨在發(fā)現(xiàn)腫瘤微環(huán)境調(diào)控胰腺癌糖酵解的新機(jī)制。

circRNA具有高度保守的特征和組織發(fā)育特異性表達(dá)模式，可在外泌體中富集，能從體液中檢測到[12-13]。近年來研究發(fā)現(xiàn)外泌體circRNA在胰腺癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。據(jù)報(bào)道，外泌體 circPED8A與胰腺癌淋巴管浸潤、TNM分期和低生存率有關(guān)，并通過miRNA-338/MET/MAPK1或PKB促進(jìn)侵襲轉(zhuǎn)移[14]。而胰腺癌細(xì)胞分泌的外泌體circIARS可下調(diào)miRNA-122/ZO-1軸，上調(diào)RhoA和RhoA-GTP的水平，使內(nèi)皮細(xì)胞通透性增加，促進(jìn)轉(zhuǎn)移、血管侵犯[15]。 然而有關(guān)胰腺癌CAFs分泌的外泌體中circRNA對胰腺癌的發(fā)展影響卻鮮有報(bào)道。

本研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌CAFs分泌的外泌體中ciRS-7呈高表達(dá)狀態(tài)，具有促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞糖酵解和增殖的作用。而敲降胰腺癌CAFs中ciRS-7的表達(dá)，可以通過其外泌體抑制胰腺癌細(xì)胞糖酵解，且證實(shí)這種作用與ciRS-7/miR-7/IGF1R信號軸相關(guān)。糖酵解是胰腺癌的重要特征，具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用。本研究中，通過檢測LDH活性、乳酸的產(chǎn)生及糖酵解關(guān)鍵酶LDHA及HKII，發(fā)現(xiàn)去CAFs外泌體或下調(diào)胰腺癌CAFs中ciRS-7的表達(dá)，在體外具有抑制胰腺癌細(xì)胞糖酵解的作用。

環(huán)狀RNA調(diào)控腫瘤發(fā)展是通過環(huán)狀RNA/miRNA/mRNA之間的對話實(shí)現(xiàn)的[16]。既往研究證實(shí)miR-7在胰腺癌細(xì)胞中呈低表達(dá)狀態(tài)[6]，而miR-7正是ciRS-7的候選靶標(biāo)，本研究發(fā)現(xiàn)在胰腺癌細(xì)胞中ciRS-7可通過海綿吸附miR-7，上調(diào)miR-7的靶基因IGF1R的表達(dá)，從而活化IGF1R/AKT信號來增強(qiáng)糖酵解作用。IGF1R是一種跨膜的酪氨酸蛋白受體，是細(xì)胞體內(nèi)生長所必需的，對細(xì)胞的增殖、分化、凋亡起著重要的作用[17]。IGF1R/AKT信號參與有氧糖酵解過程，AKT可通過誘導(dǎo)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的表達(dá)及膜易位，提高HK表達(dá)與活性，激活磷酸果糖激酶PFK從而促進(jìn)糖酵解代謝[18]。本研究中，IGF1R/AKT信號的上調(diào)促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞糖酵解，這與其在肝癌[19]、乳腺腫瘤[20]及膠質(zhì)瘤[21]中的作用相一致。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)由胰腺癌CAFs分泌的外泌體中ciRS-7呈高表達(dá)狀態(tài)，敲降CAFs ciRS-7的表達(dá)，可以通過外泌體抑制胰腺癌細(xì)胞的糖酵解及增殖，而且這種作用與miR-7/IGR1R/AKT通路相關(guān)。