人激肽釋放酶相關(guān)肽酶在卵巢癌中的研究進展

何征秦，王雪，蔡雪，張廣美

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院婦產(chǎn)科，哈爾濱 150001)

卵巢癌是婦科常見惡性腫瘤之一。據(jù)美國癌癥協(xié)會統(tǒng)計顯示，2019年卵巢惡性腫瘤發(fā)病人數(shù)為22 530例，死亡人數(shù)達13 980例，死亡率居女性常見惡性腫瘤的第4位[1]。鑒于早期卵巢癌患者的預后優(yōu)于晚期患者，故針對卵巢癌的高危因素采取預防措施、早期檢測、評估預后以及監(jiān)測復發(fā)有助于減少卵巢惡性腫瘤的發(fā)生，提高卵巢癌患者的生存率[2]。人激肽釋放酶相關(guān)肽酶(kallikrein-related peptidase，KLK)由15種高度保守的絲氨酸蛋白酶組成，廣泛存在于生物體液和組織中，具有不同的生物學功能[3]。KLK3作為篩查前列腺癌的生物標志物而廣為人知，而其他KLK及其在正常生理和疾病中的作用了解較少。近年來隨著研究的深入，KLK家族作為潛在的生物標志物被人們廣泛關(guān)注。KLK與不同的惡性腫瘤相關(guān)，有可能是腫瘤的生物標志物。研究顯示，在信使RNA(message RNA，mRNA)和(或)蛋白水平上，多種KLK在卵巢癌中過表達，并與卵巢癌的進展密切相關(guān)[4-5]?，F(xiàn)就KLK在卵巢癌中的研究進展進行綜述，以期為建立以KLK為基礎(chǔ)的多參數(shù)卵巢癌腫瘤標志物體系提供新思路。

1 KLK概述

20世紀30年代，Kraut等[6]將在胰腺提取物中發(fā)現(xiàn)的血管活性十肽激肽命名為胰腺組織KLK。到20世紀90年代初，僅有3個KLK基因家族成員被發(fā)現(xiàn)，即KLK1、KLK2和KLK3，隨后其他的KLK基因陸續(xù)被發(fā)現(xiàn)[3]。人KLK基因家族定位于染色體19q13.4上，包括15個編碼絲氨酸蛋白酶的基因，是目前已知的最大的絲氨酸蛋白酶基因簇，其在DNA和氨基酸水平上顯示出顯著的同源性[3]。

1.1KLK的分類和分布 根據(jù)KLK在體內(nèi)的分布可分為血漿KLK和組織KLK(包括KLK1～15)，兩者在分子量、底物特異性、免疫學特性、基因結(jié)構(gòu)以及釋放的激肽亞型等方面有顯著差異。血漿KLK是首個發(fā)現(xiàn)的從高分子量激肽原中釋放激肽的酶，其結(jié)構(gòu)特征與其他KLK有很大不同。KLK1～15在多種組織和器官中表達，包括皮膚、中樞神經(jīng)系統(tǒng)、胰腺、乳腺、前列腺、腎臟等，其中KLK1、KLK5～8和KLK10～13在正常人皮膚的角質(zhì)層、顆粒上層以及相關(guān)的皮脂腺、汗腺、毛囊和神經(jīng)組織中表達水平稍高，KLK2、KLK3和KLK4主要在前列腺表達[7]。

1.2KLK的表達 人類組織KLK家族編碼了15個同源性分泌型絲氨酸蛋白酶，其蛋白水解活性不同，其中KLK3、KLK7和KLK9顯示糜蛋白酶樣活性，KLK1、KLK10～11和KLK4具有糜蛋白酶和胰蛋白酶樣活性，而其他KLK具有胰蛋白酶樣活性[8]。在某些特定情況下，多種KLK可形成一個組織特異性的蛋白水解網(wǎng)絡(luò)，參與機體重要的生理病理過程。

KLK的表達在多個水平上受到調(diào)控，包括轉(zhuǎn)錄和翻譯水平。其中，在轉(zhuǎn)錄水平受到類固醇激素和KLK啟動子的表觀遺傳修飾調(diào)控[9]。微RNA(microRNA，miRNA)參與KLK的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，也可作為KLK的下游效應器[10]。除轉(zhuǎn)錄調(diào)控外，前體KLK的不可逆激活也受到嚴格的調(diào)控，蛋白水解活性的不當增加可能會導致細胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的喪失，導致一系列疾病的發(fā)生發(fā)展[11]。

有些KLK基因在不同組織中由不同激素調(diào)節(jié)，如在前列腺癌細胞系中KLK4基因的上調(diào)受雄激素調(diào)節(jié)，在乳腺癌細胞系中受雄激素和孕激素調(diào)節(jié)，而在子宮內(nèi)膜癌細胞中主要受雌激素調(diào)節(jié)[12]。KLK在不同組織中的差異表達模式和在同一組織中不同亞型的平行表達模式提示KLK之間可能存在多種相互作用。KLK10在大腸癌細胞系中表達上調(diào)，當沉默KLK10后可能抑制癌細胞生長和糖酵解，從而延緩大腸癌的進展[13]；而乳腺癌組織中KLK10的表達呈下調(diào)狀態(tài)，并可能與雄激素受體相關(guān)[14]。在卵巢癌中可以觀察到KLK5～8、KLK10和KLK11的強表達，KLK1、KLK13和KLK14的中等表達，KLK家族的其他成員在卵巢癌中弱表達。雖然弱表達，但仍可能發(fā)揮重要的調(diào)節(jié)作用，如激活信號分子過程[3]。

1.3KLK的生物功能 所有KLK均是單結(jié)構(gòu)域蛋白，以不活躍的酶原形式分泌，通過去除較短的前肽被蛋白水解激活[15]。一些KLK在體外激活其他前體KLK，而另一些則具有自我切割的能力，還有一些受其他蛋白酶(如基質(zhì)金屬蛋白酶)的切割[16]。作為蛋白酶，KLK通過激活細胞膜上的蛋白酶活化受體觸發(fā)細胞內(nèi)信號通路，并通過與補體C3的級聯(lián)反應在先天性免疫中發(fā)揮作用，KLK的失調(diào)與炎癥疾病相關(guān)[16]。KLK可通過自身的酶活性調(diào)節(jié)必要的生理功能，如免疫功能、皮膚脫屑、牙釉質(zhì)形成以及精液液化等。此外，KLK還可調(diào)節(jié)生長因子的生物利用度，激活蛋白酶活化受體，促進細胞增殖，降解細胞外基質(zhì)成分[17]。

KLK還通過激活與腫瘤相關(guān)的蛋白分解過程參與腫瘤的發(fā)生。如KLK通過促進上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化促進腫瘤細胞的遷移和侵襲[18-19]。KLK也可通過調(diào)節(jié)腫瘤微環(huán)境中多種細胞間的相互作用，促進血管生成和其他促腫瘤過程[20]。KLK在不同組織中的表達失調(diào)與多種疾病的發(fā)生相關(guān)，故通過調(diào)控KLK在不同疾病中的表達，可能是治療相關(guān)疾病的潛在靶標[21]。

2 KLK與卵巢癌

在某些腫瘤或非腫瘤疾病中，KLK在轉(zhuǎn)錄水平和蛋白質(zhì)水平上均協(xié)調(diào)性地上調(diào)或下調(diào)，提示KLK存在共同的調(diào)控途徑。由于KLK基因表達失調(diào)與癌癥或其他疾病有關(guān)，有研究將KLK基因的差異表達特點與作為癌癥潛在生物標志物聯(lián)系起來。研究顯示，KLK在癌癥的篩查、診斷、預后、腫瘤分期、監(jiān)測治療的藥理反應性以及評估腫瘤復發(fā)或緩解等方面均具有一定意義[22]。大部分KLK(包括KLK2～11、KLK13～15)在卵巢癌細胞中處于表達失調(diào)狀態(tài)[23]，其中KLK4、KLK5、KLK10、KLK15可作為卵巢癌預后不良的指標，而KLK8、KLK14、KLK13可作為卵巢癌預后良好的標志物，KLK8、KLK11、KLK14具有早期診斷卵巢癌的能力，KLK4還可作為預測紫杉醇耐藥的指標[24]。另有研究表明，除糖類抗原125外，KLK6、KLK13可能在卵巢癌的早期檢測中起關(guān)鍵作用[25]。

2.1KLK與卵巢癌腫瘤微環(huán)境 腫瘤微環(huán)境中的細胞和細胞衍生元素(包括細胞外基質(zhì)、蛋白、細胞因子、生長因子、激素和蛋白酶)為KLK提供了豐富的底物來源，進而促進疾病進展，調(diào)控化療耐藥的關(guān)鍵機制[26]。在器官特異性腫瘤微環(huán)境中，KLK發(fā)揮腫瘤生物學作用并調(diào)節(jié)細胞之間的相互作用[27]。此外，KLK蛋白水解網(wǎng)絡(luò)在卵巢組織和卵巢癌腫瘤微環(huán)境中也起著至關(guān)重要的作用。一些KLK水平的升高可能會增加細胞外基質(zhì)的降解、卵巢癌細胞的侵襲和轉(zhuǎn)移；另一些KLK調(diào)節(jié)細胞的增殖和血管生成。相反，KLK亦可抑制血管生成，產(chǎn)生腫瘤抑制作用[28]。KLK3又稱前列腺特異性抗原，其可強烈激活胰蛋白酶和顆粒酶B，導致細胞外基質(zhì)損傷，從而誘導前列腺癌細胞體外死亡[29]。但對于KLK在腫瘤微環(huán)境中受腫瘤部位的細胞因子、炎癥介質(zhì)和生長因子調(diào)控的機制目前還缺乏認識，仍需深入探索。

2.2KLK診斷卵巢癌的價值 KLK6可能與卵巢癌診斷、高級別分化、組織類型、殘留腫瘤組織、無瘤生存期以及化療反應性有關(guān)[30]。此外，與健康人或其他類型癌癥患者相比，56%的卵巢癌患者血清中人激肽釋放酶10的水平顯著升高。人激肽釋放酶10可能是診斷卵巢癌的一個新的血清學指標[31]。早期卵巢癌患者血清中的KLK6和KLK7蛋白水平顯著升高，這可能有助于降低人附睪蛋白4和糖類蛋白125的假陰性率；而KLK6和KLK7 mRNA過表達與早期卵巢腫瘤直接相關(guān)，并可在患者組織和血清中檢測到[32]。人激肽釋放酶5在卵巢癌患者血清中亦高表達，具有潛在診斷價值[4]。在卵巢癌患者的組織提取物、血清和腹水中可檢測到人激肽釋放酶8，提示可能是一種新的卵巢癌標志物；同時在卵巢癌患者的血清和腹水中檢測到的KLK8與KLK6具有顯著相關(guān)性[33]。不同于其他在卵巢癌中高表達的KLK，KLK11在卵巢癌組織中的表達水平明顯低于正常卵巢組織和良性卵巢腫瘤組織，故KLK11對卵巢癌早期診斷有驗證價值[34]。

2.3KLK治療卵巢癌的價值 KLK家族多個成員的調(diào)控失調(diào)在卵巢癌中發(fā)揮了重要作用。KLK在卵巢癌微環(huán)境中不僅可以介導癌癥進展和化療耐藥，同時也是新抗癌方法和藥物開發(fā)的有效靶點。研究表明，環(huán)狀RNA(hsa-circ-u0051240)通過抑制miR-637/KLK4軸促進卵巢癌細胞的增殖、遷移和侵襲[35]，因此hsa-u-circ-u0051240/miR-637/KLK4軸可作為卵巢癌治療的靶點。KLK3～12、KLK13～15在扁桃體組織提取液中的表達水平高于淋巴結(jié)和脾臟組織，其中KLK9在B細胞活化的淋巴濾泡生發(fā)中心有較強的表達，而KLK10在維持B細胞成熟起重要作用的濾泡樹突狀細胞中有較高的表達[36]。以上研究提示，KLK在免疫細胞中存在差異表達，其有望成為免疫相關(guān)疾病和癌癥免疫療法的靶標。

Raza等[37]通過計算KLK8與其抑制劑的結(jié)合活性發(fā)現(xiàn)，鋅指蛋白02927490對KLK8的S1位點具有較高的結(jié)合特異性，其有助于改進目前的治療藥物，增加靶向治療的特異性。KLK4在其他癌癥中通過激活基質(zhì)金屬蛋白酶促進細胞侵襲和轉(zhuǎn)移[38]，KLK特異性小干擾RNA有效降低了KLK4的表達水平和活性，同時也抑制了癌細胞的增殖和侵襲[39]。針對KLK的特異抑制劑(包括肽類抑制劑、小分子抑制劑、環(huán)肽、工程天然抑制劑等)正在研究中，KLK4～6不僅可作為炎癥疾病的靶點，也可作為抑制卵巢癌的首選靶點[26]。但這些治療靶點仍需要進一步的研究證實，特別是在同質(zhì)患者隊列或明確定義的細胞和臨床前疾病模型中。

miRNA和干擾小RNA調(diào)節(jié)KLK蛋白的水解活性，已被開發(fā)用于各種組織修復和抗癌治療[40]。有研究證實，干擾小RNA抑制KLK14的表達可明顯抑制卵巢癌細胞的體外惡性行為，增加細胞凋亡率[41]。

2.4KLK預測卵巢癌預后的價值 KLK可作為判斷卵巢癌預后的生物標志物。KLK4 mRNA表達水平升高與卵巢癌患者總生存期縮短顯著相關(guān)，且KLK4在調(diào)節(jié)細胞增殖、黏附、侵襲以及遷移等方面具有重要作用，其可能是卵巢癌不良預后的獨立預測指標[42]。研究表明，KLK6 mRNA表達水平升高亦與卵巢癌患者總生存期縮短顯著相關(guān)，KLK6不僅是卵巢癌不良預后的生物標志物，也是卵巢癌治療的潛在靶點[43]。此外，KLK5 mRNA表達水平升高與無進展生存期縮短顯著相關(guān)，而與總生存期無關(guān)，故KLK5 mRNA亦可以作為判斷卵巢癌不良預后的生物標志物[4]。

有研究全面量化了晚期高級別漿液性卵巢癌的同質(zhì)患者中腫瘤相關(guān)KLK的表達水平，并評估了KLK對疾病進程的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，KLK9 mRNA和KLK10 mRNA的表達水平與卵巢癌患者預后無關(guān)，但KLK15 mRNA、KLK11 mRNA的高水平與卵巢癌預后較好相關(guān)[43]。KLK10和KLK11在晚期漿液性卵巢癌中協(xié)調(diào)表達，兩者編碼的蛋白質(zhì)表達增加與卵巢癌良好預后相關(guān)[44]。Dettmar等[45]發(fā)現(xiàn)，卵巢癌組織中KLK13 mRNA與KLK14 mRNA的表達呈負相關(guān)：KLK13 mRNA水平升高與較短的無進展生存期和總生存期顯著相關(guān)，而KLK14 mRNA水平升高與較長的無進展生存期和總生存期顯著相關(guān)，表明KLK13 mRNA和KLK14 mRNA是預測卵巢癌復發(fā)和評估預后的獨立指標。

2.5KLK在卵巢癌化療耐藥中的作用 順鉑聯(lián)合紫杉醇方案仍是晚期卵巢癌及復發(fā)性卵巢癌的主要化療策略，但復發(fā)性卵巢癌化療耐藥亟須解決。鑒于聯(lián)合高表達的KLK4～7增強了卵巢癌細胞對紫杉醇的耐藥性，故抑制KLK可能是治療晚期卵巢癌化療耐藥的一種新方法[26]。KLK4可促進多細胞團簇的形成，從而導致卵巢癌耐藥性的產(chǎn)生，用免疫球蛋白G抗體和高度特異的SFTI-FCQR(一種選擇性活性位點KLK4絲氨酸蛋白酶抑制劑)抑制KLK4的活性可提高紫杉醇治療卵巢癌細胞的效率[46]。目前KLK在卵巢癌耐藥方向的研究尚不完善，還需大量研究驗證其與卵巢癌耐藥的相關(guān)性。

3 展 望

目前對卵巢癌病理生理學的研究為開發(fā)作用于特定信號通路或干擾腫瘤微環(huán)境因素的靶向治療提供了方向，但仍缺乏合適的生物標志物以早期檢測、指導靶向藥物治療及評估患者預后。盡管進行了廣泛的研究，但通過篩查程序和尋找有效的生物標志物或新的治療策略改善卵巢癌患者生存預后的總體結(jié)果尚不理想。隨著對KLK家族成員研究的深入發(fā)現(xiàn)，在腫瘤組織中差異表達的KLK在其他器官和組織中表達受限，KLK可能是合適的卵巢癌治療靶點。KLK不僅是卵巢惡性腫瘤微環(huán)境中重要的因子，介導腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，也與化療藥物耐藥密切相關(guān)，同時也是新的抗癌方法和藥物開發(fā)的有效靶點。KLK對早期卵巢癌的預測作用在實驗室中得到了證實，但在實際臨床中的診斷價值仍存在爭議。KLK在卵巢癌早期診斷、評估預后，監(jiān)測復發(fā)等方面的敏感性和特異性還有待進一步提高，以克服傳統(tǒng)卵巢癌標志物的單一性和局限性。目前仍需要對KLK家族進行深入探索，以期進一步提高KLK在卵巢癌預后判斷以及作為早期診斷標志物的價值，改善卵巢癌患者的生存率和生存質(zhì)量。