外泌體在年齡相關(guān)性黃斑變性發(fā)病機(jī)制與診療方面的研究進(jìn)展

劉金霞，秦宇

(中國醫(yī)科大學(xué)眼科醫(yī)院 遼寧省晶狀體學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 中國醫(yī)科大學(xué)附屬第四醫(yī)院眼科，沈陽 110005)

年齡相關(guān)性黃斑變性(age-related macular degene-ration，AMD)是造成老年人不可逆性視力障礙的主要原因[1]。其可分為萎縮型(干性)和滲出型(濕性)兩種。其中，萎縮型約占80%，以黃斑區(qū)地圖狀萎縮和玻璃膜疣為特點(diǎn)，患者常出現(xiàn)視物模糊和變形癥狀；滲出型以脈絡(luò)膜新生血管(choroidal neovascularization CNV)為特征，其視功能嚴(yán)重?fù)p傷的病理學(xué)基礎(chǔ)即黃斑區(qū)CNV形成[2]。目前，AMD的發(fā)病機(jī)制尚未完全清楚，炎癥與免疫功能紊亂、血管生成與抑制失調(diào)、光損傷及氧化應(yīng)激反應(yīng)等均有報(bào)道[3]。對于AMD的治療，干性AMD主要著眼于補(bǔ)體抑制、神經(jīng)保護(hù)、細(xì)胞療法和抗炎藥物治療，濕性AMD則更注重新的、潛在更持久的抗血管內(nèi)皮生長因子制劑及緩釋裝置和基因治療等[4-5]。

外泌體最初于1987年在綿羊紅細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，直徑為30～100 nm，多種體液中均含有外泌體，如血漿、血清、尿液、唾液、精液、母乳、房水和腦脊液等。由于外泌體的來源細(xì)胞多樣，其功能也各不相同[6-7]。近年來，外泌體在眼科領(lǐng)域的研究逐漸增加。研究顯示,視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(retinal pigment epithelial cell，RPE)、睫狀體上皮細(xì)胞、小梁細(xì)胞等均可分泌外泌體[8-9]。其參與了AMD發(fā)生發(fā)展過程中的新生血管生成、玻璃膜疣形成、免疫調(diào)節(jié)等環(huán)節(jié)[2]。現(xiàn)就外泌體在AMD發(fā)病、診斷和治療等方面的研究進(jìn)展予以綜述，以為AMD的發(fā)病機(jī)制和診療策略研究提供新思路。

1 外泌體

1.1外泌體的產(chǎn)生 外泌體的形成過程包括漿膜的雙重內(nèi)陷以及含有腔內(nèi)囊泡的多囊泡體形成。漿膜的第一次內(nèi)陷形成一個(gè)杯狀結(jié)構(gòu)(包括細(xì)胞表面蛋白和與細(xì)胞外環(huán)境相關(guān)的可溶性蛋白)導(dǎo)致早期核內(nèi)體形成。隨后，早期核內(nèi)體逐漸成熟變?yōu)橥砥诤藘?nèi)體，晚期核內(nèi)體膜內(nèi)陷產(chǎn)生多囊泡體(即漿膜的雙重內(nèi)陷)。多囊泡體既可以與溶酶體或自噬體融合降解，也可以與質(zhì)膜融合，將所含的腔內(nèi)囊泡釋放成為外泌體[10]。

1.2外泌體的分離提取 目前，有關(guān)外泌體的提取方法主要有多步差速離心法、聚乙二醇沉淀法、蔗糖密度梯度離心法、免疫親和色譜法、尺寸排除色譜法等。每一種提取方法在產(chǎn)量、純度、成本及生物活性等方面不盡相同[11]。常用的外泌體鑒定方法包括電鏡檢測、納米粒子追蹤分析、外泌體表面蛋白檢測。其中，電鏡檢測和納米粒子追蹤分析可確定外泌體的形態(tài)、數(shù)量及直徑大小，蛋白質(zhì)免疫印跡法及流式細(xì)胞術(shù)可檢測外泌體表面標(biāo)志性蛋白CD9、CD63、CD81、血清膜聯(lián)蛋白A5、腫瘤易感基因101、浮艦蛋白-1等，因?yàn)檫@些標(biāo)志物不僅可用于識別外泌體，而且與直接從細(xì)胞表面釋放的其他微囊泡相比，還顯示了外泌體在細(xì)胞內(nèi)的獨(dú)特起源[12]。

1.3外泌體的生物學(xué)功能

1.3.1細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo) 外泌體最主要的功能為介導(dǎo)細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。細(xì)胞外囊泡分為外泌體和細(xì)胞外顆粒兩種，從母細(xì)胞中釋放后，這兩類囊泡在細(xì)胞外液中游走不同的時(shí)間和距離，隨后與靶細(xì)胞的內(nèi)吞膜或質(zhì)膜融合，并將腔內(nèi)成分釋放到胞質(zhì)中，導(dǎo)致靶細(xì)胞生理性能發(fā)生變化。融合后，外泌體或外泌體成分可以在新的囊泡中重新組裝，再循環(huán)至其他細(xì)胞中，激活一系列效應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)揮細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)作用[13]。研究發(fā)現(xiàn)，在乳腺癌的發(fā)生發(fā)展過程中，由耐藥細(xì)胞分泌的外泌體可大量攜帶環(huán)狀RNA-UBE2D2，并將其轉(zhuǎn)移至親本細(xì)胞中；由外泌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)移的環(huán)狀RNA-UBE2D2能夠與其靶基因微RNA(microRNA，miRNA/miR)-200a-3p相互作用，增強(qiáng)乳腺癌細(xì)胞的他莫昔芬耐藥性，為提高他莫昔芬對乳腺癌患者的療效提供新見解[14]。

1.3.2腫瘤微環(huán)境形成 自Stephen Paget于1889年提出“seed-and-soil”假說以來，器官定向性轉(zhuǎn)移一直是腫瘤最大的謎團(tuán)之一[15]。Hoshino等[16]證明，來自小鼠和人類的肺、肝和腦嗜腫瘤細(xì)胞的外泌體優(yōu)先與預(yù)期目的地的駐留細(xì)胞融合，即肺成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞、肝庫普弗細(xì)胞和腦內(nèi)皮細(xì)胞，從而形成腫瘤的轉(zhuǎn)移前微環(huán)境，促進(jìn)腫瘤的器官定向性轉(zhuǎn)移。Liu等[17]研究表明，胃癌細(xì)胞系(MKN-45、MKN-28等)來源的外泌體由肺巨噬細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞攝取后，改變肺CD8+T細(xì)胞的基因表達(dá)和細(xì)胞因子分泌，形成一種免疫抑制的腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)胃腫瘤的肺轉(zhuǎn)移。

1.3.3免疫學(xué)作用 大部分免疫細(xì)胞能分泌外泌體，如樹突狀細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞等。而免疫細(xì)胞源性外泌體在抗原呈遞、免疫應(yīng)答、免疫調(diào)節(jié)以及免疫赦免等方面均發(fā)揮至關(guān)重要的作用，可以刺激或減弱免疫反應(yīng)，這些作用的發(fā)揮均取決于細(xì)胞環(huán)境、分子組成和產(chǎn)生免疫細(xì)胞外泌體的微環(huán)境[18]。有研究顯示，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激能夠促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞分泌miR-27a-3p高表達(dá)的外泌體，這種外泌體能夠通過支架蛋白MAGI-2(membrane-associated guanylate kinase inverted-2)/人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因/磷脂酰肌醇-3-激酶通路上調(diào)程序性死亡配體1的表達(dá)，從而促進(jìn)乳腺癌的免疫逃逸[19]。另有研究證實(shí)了外泌體在癌癥免疫治療中的強(qiáng)大功能，其可作為腫瘤免疫治療的介質(zhì)、藥物載體和預(yù)后生物標(biāo)志物[20]。

2 外泌體與AMD

近年來，有關(guān)外泌體在眼科疾病中應(yīng)用的研究逐漸增多，包括角膜疾病、青光眼、糖尿病性視網(wǎng)膜病變以及AMD等[11]。2012年，廖志雄等[21]首先在兔房水中分離和提取出外泌體，并發(fā)現(xiàn)其明顯抑制T細(xì)胞的增殖，故認(rèn)為外泌體很有可能參與了眼球免疫耐受的維持。Zhang等[22]研究發(fā)現(xiàn)，氧化應(yīng)激損傷的RPE可分泌富含白細(xì)胞介素-1β、白細(xì)胞介素-18和胱天蛋白酶1的外泌體，這些外泌體又能進(jìn)一步加劇RPE的氧化應(yīng)激反應(yīng)。而RPE損傷與AMD的形成密切相關(guān)，因此RPE來源的外泌體可能參與了AMD的發(fā)生發(fā)展[22]。

2.1外泌體與新生血管形成 CNV是AMD患者致盲的主要原因，其以新生血管生成和視網(wǎng)膜下血液聚集為特征，從而對RPE造成機(jī)械性壓迫[23]。研究發(fā)現(xiàn)，與正常RPE比較，氧化應(yīng)激損傷的RPE分泌到細(xì)胞外基質(zhì)的外泌體水平升高且攜帶血管內(nèi)皮生長因子受體1和2，從而影響鄰近血管內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞新生血管形成；當(dāng)細(xì)胞內(nèi)氧化刺激水平升高時(shí)，血管內(nèi)皮生長因子受體1和2的信使RNA水平明顯升高，促血管生成效應(yīng)也明顯增強(qiáng)[24-25]。

Hajrasouliha等[26]發(fā)現(xiàn)，視網(wǎng)膜星形膠質(zhì)細(xì)胞(retinal astrocytes，RAC)分泌的外泌體具有抗血管生成作用。Zhu等[27]研究表明，從正常和高度自噬的RAC中提取的外泌體對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)移和血管生成的作用截然不同。他們發(fā)現(xiàn)，從正常RAC中提取的外泌體能明顯抑制人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的血管生成；而在氧化應(yīng)激條件下，由于RAC自噬水平升高，從中提取的外泌體會促進(jìn)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和血管生成。因此，研究RAC源性外泌體的成分及其功能，可能能為改善AMD中CNV的抗血管生成治療提供新靶點(diǎn)和思路。

2.2外泌體與玻璃膜疣形成 布魯赫膜是一種五氨基膜復(fù)合體，鄰近RPE的基底側(cè)，包括其基底外側(cè)細(xì)胞膜。它將RPE單層與體循環(huán)有孔毛細(xì)血管床(即脈絡(luò)膜毛細(xì)血管)分離，因此在介導(dǎo)流向RPE和光感受器的氧、電解質(zhì)、營養(yǎng)物質(zhì)和細(xì)胞因子，以及代謝廢物和信號分子的外排方面起至關(guān)重要的作用。早期AMD的發(fā)病機(jī)制以布魯赫膜的增厚為特征，這是由于脂質(zhì)和蛋白的積累導(dǎo)致視網(wǎng)膜下沉積物的形成，稱為玻璃膜疣[28]。Klingeborn等[29]分析了在穩(wěn)態(tài)條件下從RPE基底側(cè)和頂端釋放的外泌體蛋白質(zhì)組，結(jié)果顯示，RPE分泌的外泌體中含有631種蛋白質(zhì)，其中有299種為頂端特異性釋放，94種為基底側(cè)特異性釋放，由此推斷RPE的極性能夠影響外泌體的定向釋放。這也將為外泌體在視網(wǎng)膜疾病的發(fā)生、靶向治療和診斷標(biāo)志物方面的應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。

Wang等[30-31]研究發(fā)現(xiàn)，線粒體DNA受損的RPE的胞吐活性增強(qiáng)，使攜帶細(xì)胞內(nèi)蛋白的外泌體釋放增加。同時(shí)，外泌體標(biāo)志物CD63、CD81和溶酶體關(guān)聯(lián)膜蛋白2在AMD患者的玻璃膜疣中出現(xiàn)，且CD63與玻璃膜疣表面的β淀粉樣蛋白、αB-晶體蛋白、C5b-9和補(bǔ)體因子H(complement factor H，CFH)共表達(dá)。因此推測在AMD患者的RPE中，由于細(xì)胞的胞吐活性增強(qiáng)，細(xì)胞內(nèi)蛋白通過外泌體釋放增加，從而促進(jìn)玻璃膜疣的形成。另有研究表明，載脂蛋白E與外泌體和腔內(nèi)囊泡的膜結(jié)合是色素細(xì)胞中淀粉樣纖維形成的重要調(diào)節(jié)因素[32-33]。外泌體與載脂蛋白E的這種關(guān)聯(lián)也促使研究者重新考慮載脂蛋白E和外泌體在AMD中的作用，因?yàn)檩d脂蛋白E是玻璃膜疣的重要組成部分。

2.3外泌體與免疫反應(yīng) 眼睛作為一個(gè)獨(dú)特的視覺感覺器官，一直為一個(gè)免疫赦免位點(diǎn)，防止免疫原性炎癥的發(fā)生[34]。然而有研究表明，在AMD的發(fā)病過程中，除RPE退化變性外，免疫反應(yīng)也參與其中[35]。補(bǔ)體系統(tǒng)是天然免疫的主要組成部分，也是AMD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵組成部分[36]。CFH基因編碼因子H(factor H，F(xiàn)H)及其較小的剪接變異體因子H相關(guān)蛋白(factor H related protein，F(xiàn)HR)-1，F(xiàn)H是主要的血漿補(bǔ)體調(diào)節(jié)因子，而FHR-1在布魯赫膜和脈絡(luò)膜毛細(xì)血管中占主導(dǎo)地位[37]。Sivapathasuntharam等[38]研究發(fā)現(xiàn)，CFH基因敲除(CFH-/-)小鼠出現(xiàn)明顯的視網(wǎng)膜病變和脈絡(luò)膜部分塌陷，故認(rèn)為CFH不僅是影響視網(wǎng)膜發(fā)育的重要因素，而且CFH-/-小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育異常也可能作為AMD發(fā)生的病變基礎(chǔ)。研究表明，F(xiàn)HR-4在脈絡(luò)膜毛細(xì)血管、布魯赫膜和玻璃膜疣中聚集，隨著FHR-4的不斷累積，引起補(bǔ)體過度周轉(zhuǎn)，最終導(dǎo)致循環(huán)免疫細(xì)胞的激活和募集，而該現(xiàn)象也是早期AMD的一個(gè)關(guān)鍵特征。

Wang等[30]發(fā)現(xiàn)，外泌體標(biāo)志蛋白CD63與CFH在AMD患者的玻璃膜疣中共表達(dá)，且CFH以一種劑量依賴性方式與RPE分泌的外泌體結(jié)合，故他們認(rèn)為由C3包裹的外泌體很有可能是CFH的作用靶點(diǎn)。關(guān)于AMD中外泌體與免疫反應(yīng)之間的關(guān)系目前尚不清楚，未來需進(jìn)一步研究。

2.4外泌體作為AMD診斷的標(biāo)志物 外泌體作為理想的生物標(biāo)志物具有以下特征：①外泌體的脂質(zhì)雙分子層可以為其內(nèi)容物提供保護(hù)；②外泌體的內(nèi)容物由組織、細(xì)胞和疾病特異性蛋白質(zhì)或核酸組成；③外泌體性能穩(wěn)定，從體液中分離和富集的方法多樣[11]。從RPE的基底側(cè)釋放的外泌體可通過脈絡(luò)膜進(jìn)入全身循環(huán)，因此可能成為血液中視網(wǎng)膜疾病生物標(biāo)志物的潛在來源[39]。

為了尋找與AMD發(fā)生發(fā)展相關(guān)的分泌性生物標(biāo)志物，Kang等[40]對來自RPE條件性培養(yǎng)基、條件性培養(yǎng)基以及AMD患者房水外泌體中的蛋白質(zhì)進(jìn)行了比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)多種蛋白質(zhì)在視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞系A(chǔ)RPE-19外泌體和AMD患者房水外泌體中均表達(dá)，排除其他可能分泌外泌體的細(xì)胞(Müller細(xì)胞和視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞)外，認(rèn)為RPE可能是AMD患者房水中外泌體的主要來源，因此房水中的外泌體可作為AMD的生物標(biāo)志物。

在AMD的發(fā)病機(jī)制中，許多miRNAs與細(xì)胞增殖、遷移、凋亡和新生血管形成相關(guān)。Elbay等[41]研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，濕性AMD組患者血清中的miR-486-5p和miR-626明顯高表達(dá)，而miR-885-5p 表達(dá)明顯下調(diào)。因此推斷，這些miRNAs在濕性AMD中的特異性表達(dá)可能成為診斷和評價(jià)AMD的一種新生物標(biāo)志物。

2.5外泌體與AMD的治療 對于濕性AMD，目前臨床常用的治療方法為玻璃體腔內(nèi)注射抗血管生成藥物，但這種給藥方式會產(chǎn)生一些并發(fā)癥，如結(jié)膜下出血、感染性眼內(nèi)炎、玻璃體積血等，因此提高注射安全性一直是玻璃體腔內(nèi)注射抗血管生成藥物的研究重點(diǎn)[42]。Hajrasouliha等[26]通過對CNV小鼠結(jié)膜下注射RAC源性外泌體發(fā)現(xiàn)，結(jié)膜下注射外泌體可以使藥物從結(jié)膜快速運(yùn)送至脈絡(luò)膜和視網(wǎng)膜。該結(jié)果提示，結(jié)膜下外泌體注射或許是一個(gè)更為安全有效的給藥方式。

α-晶體蛋白是小熱激蛋白家族的主要成員，在RPE的胞質(zhì)和線粒體中表達(dá)，在氧誘導(dǎo)的視網(wǎng)膜病變和發(fā)育過程中受到調(diào)節(jié)。此外，α-晶體蛋白可保護(hù)RPE免受氧化應(yīng)激和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的損傷和自噬。同時(shí)，α-晶體蛋白也是血管生成因子和血管內(nèi)皮生長因子的調(diào)節(jié)因子，通過外泌體途徑分泌。而α-晶體蛋白衍生的伴侶蛋白可防止氧化劑誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡，因此對AMD具有治療潛力[43-44]。

CFH是由RPE產(chǎn)生的一種補(bǔ)體因子，有助于C3轉(zhuǎn)化酶的衰變，防止C3b沉積的擴(kuò)增。研究表明，CFH的變異體對AMD新生血管的治療有較好的反應(yīng)[45]。Cashman等[46]研究發(fā)現(xiàn)，C3誘導(dǎo)的小鼠視網(wǎng)膜病變能夠被CFH的表達(dá)所抑制。因此，CFH的表達(dá)作為一種潛在的AMD基因治療手段值得進(jìn)一步研究。

3 小 結(jié)

AMD作為一種不可逆性的老年性致盲眼病，為患者及其家屬帶來極大負(fù)擔(dān)，手術(shù)治療以及抗血管內(nèi)皮生長因子治療等方法雖然有一定的療效，但仍存在并發(fā)癥、療效不佳等問題。外泌體作為一種天然載體，可將一種細(xì)胞的蛋白質(zhì)、核酸等轉(zhuǎn)運(yùn)到另一種細(xì)胞中，因此可作為靶向治療的理想載體，但這種效應(yīng)目前主要應(yīng)用于腫瘤領(lǐng)域，在眼科疾病中應(yīng)用較少。眼科來源的外泌體通過攜帶脂質(zhì)、核酸、蛋白質(zhì)等多種物質(zhì)發(fā)揮細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、免疫調(diào)節(jié)作用，或作為藥物載體，為AMD的診斷和治療提供新思路，但其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步研究。