背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)巨噬細(xì)胞參與神經(jīng)病理性疼痛發(fā)生和維持

神經(jīng)病理性疼痛(neuropathic pain, NP)是一種由神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性損害和功能障礙所激發(fā)或引起的疼痛。研究表明，脊髓背角神經(jīng)元和小膠質(zhì)細(xì)胞（CNS 的常駐巨噬細(xì)胞）之間的分子和細(xì)胞相互作用是誘導(dǎo)和維持周圍神經(jīng)損傷后NP 的重要因素。例如，外周神經(jīng)損傷后，損傷同側(cè)背根神經(jīng)節(jié)(dorsal root ganglia, DRG)中的巨噬細(xì)胞數(shù)量明顯增加，同時(shí)引起位于損傷側(cè)脊髓背角的小膠質(zhì)細(xì)胞活化，導(dǎo)致疼痛加劇，如果用氯膦酸鹽耗竭全身的巨噬細(xì)胞后可以減輕疼痛癥狀。然而，由于這些研究并沒(méi)有在DRG 中進(jìn)行，因此不能確定DRG 中巨噬細(xì)胞的貢獻(xiàn)。為此，該研究通過(guò)使用藥理學(xué)與化學(xué)遺傳學(xué)的方法，探究了DRG 中巨噬細(xì)胞在NP 中的作用，以及巨噬細(xì)胞與感覺(jué)神經(jīng)元之間的相互作用。首先，研究人員構(gòu)建了一款巨噬細(xì)胞Fas 誘導(dǎo)凋亡的小鼠(marophage Fas-induced apoptosis, MAFIA)，該小鼠在集落刺激因子1 受體(CSF1R)啟動(dòng)子下游使FK結(jié)合蛋白二聚化因子AP20187 (AP)誘導(dǎo)的Fas 自殺基因表達(dá)，再通過(guò)AP 誘導(dǎo)該小鼠耗竭外周的巨噬細(xì)胞，并使用免疫染色觀察了轉(zhuǎn)錄因子PU.1 (Spi-1 proto-oncogene)、小膠質(zhì)細(xì)胞/巨噬細(xì)胞特異性蛋白抗體(Ionized calcium binding adaptor molecule1,Iba1)和GFP，用于證實(shí)外周巨噬細(xì)胞的耗竭情況，然后通過(guò)熒光激活細(xì)胞分選 (fluorescence-activated cell sorting, FACS)檢測(cè)了巨噬細(xì)胞數(shù)量，發(fā)現(xiàn)AP注射停止后的第4 天，巨噬細(xì)胞減少的數(shù)量仍然明顯，直到第9 天后才恢復(fù)。這說(shuō)明AP 引發(fā)的巨噬細(xì)胞消融在停止給藥后是可以恢復(fù)的。

該研究通過(guò)軸突切斷術(shù)建立選擇性神經(jīng)損傷(spared nerve injury, SNI)模型，并在該神經(jīng)損傷模型下對(duì)DRG 巨噬細(xì)胞的激活進(jìn)行了研究。通過(guò)FACS 對(duì)表達(dá)趨化因子受體CX3CR1 的DRG 巨噬細(xì)胞進(jìn)行定量分選發(fā)現(xiàn)：在手術(shù)后的第4 天(POD4)，造模側(cè)L4與L5的DRG 巨噬細(xì)胞數(shù)量開始較對(duì)側(cè)上升，并且這種巨噬細(xì)胞的上升在造模后至少持續(xù)4 周(POD28)；這表明DRG 巨噬細(xì)胞參與了NP 的發(fā)生與維持。為了進(jìn)一步確定DRG 中損傷誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞擴(kuò)增的起源，作者檢測(cè)了標(biāo)志著巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)的趨化因子受體 CCR2，結(jié)果表明：CCR2+巨噬細(xì)胞在未受損小鼠的DRG 中同樣顯著增加，說(shuō)明CCR2 并非浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞特異的標(biāo)志物。于是，選定了Ki67 抗體對(duì) CX3CR1+巨噬細(xì)胞進(jìn)行染色，經(jīng)FACS 分析顯示神經(jīng)損傷后1 天(POD1)，同側(cè)受傷的 DRG 中 Ki67+CX3CR1+巨噬細(xì)胞的百分比與對(duì)側(cè)未受傷的 DRG 中的巨噬細(xì)胞沒(méi)有差異，而在第4 天時(shí)(POD4)，脊髓腰段中增殖的小膠質(zhì)細(xì)胞(Ki67+CX3CR1+)與對(duì)側(cè)相比增加超過(guò)2 倍；因此得出結(jié)論：①CX3CR1+為非浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞特異標(biāo)記物；②軸突切斷可誘導(dǎo)DRG 中巨噬細(xì)胞擴(kuò)增。另外，在局部擴(kuò)增的巨噬細(xì)胞來(lái)源上雖然不能排除浸潤(rùn)，但該研究的觀點(diǎn)是駐留巨噬細(xì)胞增殖占主導(dǎo)地位。

為了確定 DRG 巨噬細(xì)胞的增加是否有助于NP 的發(fā)展，該研究選擇了 MAFIA 轉(zhuǎn)基因品系小鼠進(jìn)行研究。首先，通過(guò)每日腹腔注射AP（5 次，10 mg·kg-1）進(jìn)行誘導(dǎo)并消耗體內(nèi)的巨噬細(xì)胞，注射后第1 天(POD1)出現(xiàn)機(jī)械痛閾的上調(diào)，且在消除巨噬細(xì)胞的過(guò)程中會(huì)導(dǎo)致小鼠的體重減輕。因此，在注射次數(shù)和注射劑量上進(jìn)行了調(diào)整，并將注射的方式改為每日 AP 注射 3 次 （注射劑量為1.0 mg·kg-1）。在該方案下，AP 注射之后，雖然也會(huì)引起小鼠體重的減輕，但并不會(huì)影響到MAFIA 小鼠機(jī)械痛與熱痛的閾值。接下來(lái)使用不同方法來(lái)檢查 DRG 和血液?jiǎn)魏思?xì)胞中的常駐巨噬細(xì)胞，通過(guò)FACS 檢測(cè)DRG駐留(GFP+)巨噬細(xì)胞的數(shù)量，結(jié)果表明：AP 治療降低了L4-5神經(jīng)損傷側(cè)與對(duì)側(cè)DRG 中巨噬細(xì)胞的數(shù)量，但在第9 天時(shí)(POD9)巨噬細(xì)胞擴(kuò)增再次出現(xiàn)。另外，通過(guò)巨噬細(xì)胞所表達(dá)的GFP 和 PU.1 進(jìn)行免疫染色也證實(shí)了這種現(xiàn)象。

既往研究認(rèn)為AP 不會(huì)穿過(guò)血腦屏障(blood brain barrier, BBB)，但作者認(rèn)為必須排除 AP 治療對(duì)CNS 的直接作用。于是通過(guò)SNI 造模后POD1與POD4 對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行FACS 分析，發(fā)現(xiàn)其在數(shù)量上沒(méi)有影響。同時(shí)，對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行免疫染色后也得出了相同的結(jié)論。因此，該研究認(rèn)為無(wú)論是否存在神經(jīng)損傷，脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞都不受AP 治療的影響。

基于上述結(jié)果，進(jìn)一步分析了DRG 巨噬細(xì)胞與神經(jīng)損傷引起的機(jī)械痛敏化之間的關(guān)系。分別在不同實(shí)驗(yàn)組中每日 AP 注射3 次(1.0 mg·kg-1)后，建立SNI 模型，再通過(guò)vonFrey 與熱輻射對(duì)小鼠的機(jī)械痛閾與熱痛閾進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明：巨噬細(xì)胞的消耗延遲了痛閾超敏的發(fā)展，并且這種延遲至少持續(xù)到神經(jīng)損傷后的第7 天；重要的是，巨噬細(xì)胞擴(kuò)增恢復(fù)的小鼠表現(xiàn)出機(jī)械性疼痛的敏化。但是，由于AP 治療引起的體重減輕在這些小鼠中持續(xù)存在，作者認(rèn)為AP 對(duì)機(jī)械超敏反應(yīng)的影響不是繼發(fā)于體重減輕，又檢測(cè)了AP 治療后小鼠對(duì)熱刺激的反應(yīng)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)熱痛閾值在 AP 治療前后小鼠沒(méi)有差異。因此，認(rèn)為體重減輕不是巨噬細(xì)胞耗竭產(chǎn)生的抗異常性疼痛作用的主要因素。除此之外，本文作者在另一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)中將MAFIA 小鼠中分離的骨髓(BM) 祖細(xì)胞 (GFP+) 移植到WT 小鼠中，并在AP治療后進(jìn)行SNI 造模，發(fā)現(xiàn)移植小鼠DRG 中AP介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞耗竭顯著延遲了神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械超敏反應(yīng)的發(fā)展。

接下來(lái)，研究了DRG 與神經(jīng)損傷部位的巨噬細(xì)胞對(duì)于NP 的貢獻(xiàn)。由于AP 對(duì)于巨噬細(xì)胞的消耗是全身性的，所以無(wú)法區(qū)分損傷部位與DRG 中巨噬細(xì)胞各自的貢獻(xiàn)。因此，設(shè)計(jì)了一個(gè)植入套管并將其縫合到覆蓋損傷部位的肌肉上，用來(lái)提供局部的低劑量AP，只針對(duì)損傷部位周圍的巨噬細(xì)胞進(jìn)行局部消融，而不會(huì)產(chǎn)生全身的作用。在損傷部位使用AP (0.8 μg/20 μl)套管治療后，小鼠并未出現(xiàn)明顯的機(jī)械痛閾改變或體重減輕。為探究AP 套管治療是否會(huì)影響DRG 巨噬細(xì)胞，又對(duì)受損神經(jīng)部位與DRG 進(jìn)行了組織化學(xué)染色和FACS 分析，結(jié)果顯示：損傷神經(jīng)部位GFP+巨噬細(xì)胞數(shù)量減少，而DRG 中巨噬細(xì)胞數(shù)量無(wú)明顯改變，這表明AP 套管治療可以僅在損傷部位消耗巨噬細(xì)胞。然后，通過(guò)vonFrey 對(duì)局部消融巨噬細(xì)胞小鼠進(jìn)行機(jī)械痛閾測(cè)定，結(jié)果顯示：局部AP 治療對(duì)神經(jīng)損傷后小鼠機(jī)械痛閾無(wú)顯著改變。綜合上述結(jié)果得出結(jié)論：神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械超敏反應(yīng)的啟動(dòng)必需要DRG 中巨噬細(xì)胞的參與，且與損傷部位巨噬細(xì)胞無(wú)關(guān)。

然后，作者探究了神經(jīng)損傷觸發(fā) DRG 巨噬細(xì)胞和感覺(jué)神經(jīng)元之間的相互作用。軸突切斷刺激DRG 感覺(jué)神經(jīng)元表達(dá)CSF1 和CSF1 轉(zhuǎn)運(yùn)到脊髓背角后通過(guò) CSF1R 激活小膠質(zhì)細(xì)胞，誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞增殖，并促進(jìn)NP 的發(fā)生。在AP 治療的小鼠中，巨噬細(xì)胞的消耗并沒(méi)有下調(diào)損傷誘導(dǎo)的軸突感覺(jué)神經(jīng)元中 CSF1 的表達(dá)，為了證明DRG 中神經(jīng)損傷后CSF1 是否參與誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的擴(kuò)增，使用了CSF1fl/fl的Adv-Cre 品系小鼠，該小鼠的感覺(jué)神經(jīng)元中CSF1 基因表達(dá)可被選擇性敲除。神經(jīng)損傷后第 4 天(POD4)，對(duì)腰段脊髓背角小膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行 FACS 分析，結(jié)果表明：Adv-Cre 小鼠同側(cè)損傷誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞同WT 小鼠相比，巨噬細(xì)胞的激活和增殖都明顯下調(diào)，CSF1 條件性敲除可阻止同側(cè)軸突切斷的 DRG 中巨噬細(xì)胞損傷誘導(dǎo)的擴(kuò)張，但在全身缺乏CCL2 的小鼠中，DRG 巨噬細(xì)胞的擴(kuò)增并未受到影響。由此得出結(jié)論，軸突切斷DRG 感覺(jué)神經(jīng)元通過(guò)CSF1 釋放激活DRG 巨噬細(xì)胞，并且這種激活不依賴于CCL2。另外，CSF1也在衛(wèi)星細(xì)胞中表達(dá)，由于DRG 中的衛(wèi)星細(xì)胞有助于損傷引起神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)展，但在 AP介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞耗竭后通過(guò)對(duì)衛(wèi)星細(xì)胞標(biāo)志物連接蛋白-43 進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)沒(méi)有明顯改變，這表明CSF1 的來(lái)源并非是衛(wèi)星細(xì)胞。

接下來(lái)探究了神經(jīng)損傷誘導(dǎo)DRG 巨噬細(xì)胞的激活是否反過(guò)來(lái)影響感覺(jué)神經(jīng)元？具體來(lái)說(shuō)，作者檢測(cè)了四種成熟標(biāo)記物：ATF332、Atf3、甘丙肽和神經(jīng)肽 Y (NPY)。在 SNI 造模(POD1)后通過(guò)qPCR分析，上述標(biāo)記物均無(wú)顯著改變，但腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子(BDNF)的上調(diào)在AP 治療后被顯著抑制；因此，通過(guò)使用原位雜交 (ISH)技術(shù)確定了DRG 中BDNF 的來(lái)源。ISH 的結(jié)果顯示周圍的非神經(jīng)元細(xì)胞中沒(méi)有表達(dá)BDNF，認(rèn)為巨噬細(xì)胞不表達(dá)BDNF；但由于BDNF 的選擇性敲除并不會(huì)影響NP 的敏化，因此，推測(cè)BDNF 對(duì)感覺(jué)神經(jīng)元的影響并不明確。由于白細(xì)胞介素1β (IL-1β) 和腫瘤壞死因子α (TNF-α)在 DRG 中的神經(jīng)元和非神經(jīng)元細(xì)胞中均有表達(dá)，并且與NP 有關(guān)；因此，在SNI 模型中對(duì)IL-1β 和TNF-α 進(jìn)行了qPCR 分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：IL-1β 有明顯上調(diào)，但TNF-α 沒(méi)有明顯改變。在給予AP 治療后，IL-1β 表達(dá)在造模側(cè)與對(duì)側(cè)均出現(xiàn)降低。令人驚訝的是，只在Itgam+巨噬細(xì)胞中檢測(cè)到IL-1β 的表達(dá)；除此之外，還檢查了兩種假定的抗炎細(xì)胞因子，即IL-10 和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β (TGF-β)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TGF-β基因表達(dá)在神經(jīng)損傷巨噬細(xì)胞耗盡后沒(méi)有改變，而IL-10 表達(dá)水平太低而無(wú)法在DRG 中檢測(cè)到。綜上所述，該研究認(rèn)為神經(jīng)損傷后IL-1β 的上調(diào)主要來(lái)自DRG 巨噬細(xì)胞，而巨噬細(xì)胞耗竭所引起的NP 延遲的原因部分是由于損傷誘導(dǎo)的 IL-1β 減少所致。

最后，作者研究了在NP 中巨噬細(xì)胞的擴(kuò)增是否存在性別差異。通過(guò)FACS 分析發(fā)現(xiàn)：雌性小鼠在損傷側(cè)的巨噬細(xì)胞數(shù)量雖然增加，但與雄性小鼠相比并不顯著；這表明在受到神經(jīng)損傷刺激后DRG巨噬細(xì)胞的增殖存在性別差異。為進(jìn)一步研究性別差異是否會(huì)影響DRG 巨噬細(xì)胞在神經(jīng)損傷疼痛中的功能，仍以上述實(shí)驗(yàn)方法將小鼠按性別分為兩組，通過(guò)AP 消耗巨噬細(xì)胞后，與雄性小鼠一樣，雌性小鼠的脊髓小膠質(zhì)細(xì)胞不受影響；此外，神經(jīng)損傷后4周(POD28)通過(guò) AP 給藥引起的巨噬細(xì)胞耗竭，當(dāng)出現(xiàn)明顯的機(jī)械性異常性疼痛時(shí)，也會(huì)在雌性小鼠中產(chǎn)生短暫的、較小的異常性疼痛逆轉(zhuǎn)。同時(shí)，還檢查了缺乏 CCL2 的雄性和雌性小鼠，發(fā)現(xiàn) SNI誘導(dǎo)的機(jī)械超敏反應(yīng)在雄性和雌性小鼠中相似。得出結(jié)論：CSF1 對(duì)神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的 DRG 巨噬細(xì)胞擴(kuò)增的貢獻(xiàn)存在性別差異，但在功能上，DRG 巨噬細(xì)胞對(duì)于雄性和雌性小鼠神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的機(jī)械超敏反應(yīng)的啟動(dòng)和維持是一致的。

綜上所述，該研究通過(guò)MIFIA 小鼠與AP 誘導(dǎo)Fas 特異消耗巨噬細(xì)胞的方法證明了DRG 巨噬細(xì)胞在SNI 中的起始與延續(xù)中都起到了重要作用。并且還發(fā)現(xiàn)DRG 巨噬細(xì)胞與感覺(jué)神經(jīng)元之間的相互作用，即神經(jīng)損傷后CSF1 促使巨噬細(xì)胞增殖，反之神經(jīng)損傷后 DRG 中巨噬細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β 感覺(jué)神經(jīng)元進(jìn)一步敏化。另外，作者還發(fā)現(xiàn)了 DRG 中損傷誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞的來(lái)源。盡管 CCR2 表達(dá)與浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞有關(guān)，作者在未受損的小鼠DRG 中發(fā)現(xiàn)了許多 CCR2+駐留巨噬細(xì)胞。這說(shuō)明CCR2 并不能作為區(qū)分浸潤(rùn)巨噬細(xì)胞與駐留DRG 巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，而Ki67 則是DRG 巨噬細(xì)胞較好的標(biāo)志物?；谶@些結(jié)果，該研究認(rèn)為該DRG 巨噬細(xì)胞在來(lái)源上雖然不能排除浸潤(rùn)，但更認(rèn)同巨噬細(xì)胞擴(kuò)增主要源自損傷后增殖的駐留 DRG 巨噬細(xì)胞，并說(shuō)明了性別在其中的影響，雖然在巨噬細(xì)胞的數(shù)量上雌鼠要低于雄鼠，但在NP 的開始與維持中DRG 巨噬細(xì)胞的貢獻(xiàn)是沒(méi)有差異的。

該研究已經(jīng)證明雄性和雌性小鼠中軸突切斷引起的NP 會(huì)引起DRG 中巨噬細(xì)胞的擴(kuò)增，巨噬細(xì)胞擴(kuò)增是NP 的發(fā)生和維持所必須的。DRG 中巨噬細(xì)胞和感覺(jué)神經(jīng)元之間存在相互作用，這種相互作用與感覺(jué)神經(jīng)元-小膠質(zhì)細(xì)胞連接一致，有助于NP 表型的發(fā)展。上述過(guò)程在多大程度上是獨(dú)立的，以及是否可以作為一種新的疼痛治療方式仍有待確定。