新型冠狀病毒核酸檢測(cè)“假陰性”可能因素探析

廖遠(yuǎn)泉（安徽省涇縣醫(yī)院檢驗(yàn)科，安徽 涇縣 242500）

我國(guó)學(xué)者率先檢測(cè)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道了一種新型冠狀病毒[1]。2020年1月30日WHO建議將該新發(fā)現(xiàn)病毒命名為2019新型冠狀病毒（new coronavirus，2019-nCoV）。2月11日，國(guó)際病毒分類(lèi)委員會(huì)將其命名為 SARS-CoV-2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2），WHO將其感染所致的肺炎命名為COVID-19（coronavirus disease 2019）[2]。流行病學(xué)研究提示，SARS-CoV-2已經(jīng)在人際間廣泛傳播[3]。SARS-CoV-2 可經(jīng)呼吸道飛沫、密切接觸傳播，傳染源主要是 SARS-CoV-2 的感染者和病毒攜帶者[4]。SARS-CoV-2感染所導(dǎo)致的COVID-19已在世界許多國(guó)家/地區(qū)呈現(xiàn)廣泛流行態(tài)勢(shì)，是一種全球流行病（pandemic）。鑒于COVID-19是一種新發(fā)的感染性疾病，對(duì)SARS-CoV-2感染者早期明確診斷、阻斷疫情擴(kuò)散、控制發(fā)生新的感染十分重要。但臨床實(shí)驗(yàn)診斷中SARS-CoV-2核酸檢測(cè)假陰性問(wèn)題時(shí)有發(fā)生，這對(duì)于病原體分子生物學(xué)核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性提出了更高的要求。文章就影響其實(shí)驗(yàn)診斷核酸檢測(cè)“假陰性”可能的因素進(jìn)行探析。

1 SARS-CoV-2感染的實(shí)驗(yàn)室病原學(xué)檢測(cè)

SARS-CoV-2感染病原學(xué)檢測(cè)技術(shù)主要有SARSCoV-2的細(xì)胞培養(yǎng)及其基因測(cè)序、核酸檢測(cè)等。我國(guó)學(xué)者[1]發(fā)現(xiàn)的SARS-CoV-2即是將肺炎患者的支氣管肺泡灌洗液接種到人類(lèi)氣道上皮細(xì)胞中進(jìn)行培養(yǎng)、分離。采用透射電鏡技術(shù)觀察并初步描述了病毒特異性細(xì)胞病變及其病毒顆粒形態(tài)，并成功地對(duì)培養(yǎng)物的蛋白組分全基因組進(jìn)行了測(cè)序、檢測(cè)。雖然基因組測(cè)序診斷COVID-19具有很高的準(zhǔn)確度，但測(cè)序儀器昂貴，且多數(shù)病毒的細(xì)胞培養(yǎng)出現(xiàn)病變需要5～10 d，培養(yǎng)的周期長(zhǎng)、敏感度較低且不易觀察培養(yǎng)結(jié)果，不適用于臨床快速診斷以及大批量的檢測(cè)。因此病毒培養(yǎng)與基因組測(cè)序適宜于病毒感染性疾病的實(shí)驗(yàn)研究，不宜作為SARS-CoV-2感染臨床檢驗(yàn)的首選診斷手段。

核酸檢測(cè)是目前SARS-CoV-2感染的主要實(shí)驗(yàn)診斷方法?，F(xiàn)已建立的SARS-CoV-2特異性核酸檢測(cè)技術(shù)其病毒目標(biāo)片段是病毒基因組開(kāi)放性讀碼框 ORF1ab、N基因或E基因保守區(qū)域進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。臨床主要采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）、以及在該檢測(cè)技術(shù)基礎(chǔ)上優(yōu)化的新的檢測(cè)技術(shù)，如實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）或反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）。SARS-CoV-2的基因組為單鏈正RNA（+ss RNA），因此RNA基因組必須先通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)的cDNA鏈，再以cDNA鏈為基礎(chǔ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。RT-PCR是RNA反轉(zhuǎn)錄與cDNA聚合酶聯(lián)反應(yīng)相結(jié)合的新技術(shù)。采用RT-PCR檢測(cè)感染者標(biāo)本（鼻咽拭子、痰液、肺泡灌洗液及糞便等）是否含有SARS-CoV-2特異性的RNA序列，可對(duì)COVID-19進(jìn)行早期病原學(xué)診斷。進(jìn)行核酸擴(kuò)增前需對(duì)樣本進(jìn)行病毒滅活（56℃孵育30 min后加入蛋白酶K或試劑盒附加的核酸提取裂解液）。執(zhí)行此操作的實(shí)驗(yàn)室人員須采用三級(jí)生物安全防護(hù)。與普通PCR相比，RT-PCR通過(guò)反轉(zhuǎn)錄酶合成互補(bǔ)的cDNA鏈，再以cDNA鏈為基礎(chǔ)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。同時(shí)，利用信號(hào)實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè) PCR 反應(yīng)過(guò)程中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，可以對(duì)初始模板量進(jìn)行定量檢測(cè)分析，具有靈敏、特異、準(zhǔn)確、快捷且重復(fù)性好等諸多優(yōu)勢(shì)，在國(guó)內(nèi)外已經(jīng)廣泛應(yīng)用于多種病毒感染的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)[5-6]。其試驗(yàn)原理是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移原理為基礎(chǔ)。根據(jù)熒光探針發(fā)光基團(tuán)所發(fā)出的熒光強(qiáng)度與PCR產(chǎn)物的量呈對(duì)應(yīng)關(guān)系，只要對(duì)熒光信號(hào)進(jìn)行“實(shí)時(shí)”檢測(cè)并獲得未知樣本的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出該樣本的起始拷貝數(shù)。目前我國(guó)已批準(zhǔn)上市的SARS-CoV-2檢測(cè)試劑盒也以RT-PCR技術(shù)為主。

2 SARS-CoV-2核酸檢測(cè)“假陰性”可能的影響因素

PCR反應(yīng)能夠檢測(cè)不同樣品中SARS-CoV-2的基因物質(zhì)，具有很高的特異度，但是敏感度較低易導(dǎo)致出現(xiàn)假陰性反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。所以，檢測(cè)呈陰性并不能排除患者中有 SARS-CoV-2的存在。而且，由于SARSCoV-2是一種新發(fā)現(xiàn)的病毒，目前尚未建立完善的實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制體系，而樣品被污染也有可能導(dǎo)致假陽(yáng)性反應(yīng)。假陽(yáng)性反應(yīng)的影響因素主要來(lái)源于核酸污染、非特異性擴(kuò)增或因?yàn)榛€（baseline）設(shè)置不當(dāng)而致誤讀實(shí)驗(yàn)結(jié)果。這已經(jīng)是核酸檢測(cè)導(dǎo)致假陽(yáng)性的共識(shí)問(wèn)題，本文不予贅述。

對(duì)SARS-CoV-2感染所導(dǎo)致的COVID-19疫情，我國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷主要采用的是核酸檢測(cè)技術(shù)。但是，受病毒感染機(jī)制影響，不同組織來(lái)源的 SARS-CoV-2載荷差異較大，已經(jīng)有多地、多次相繼報(bào)道出現(xiàn)有核酸檢測(cè)“假陰性”的案例，尤其是有的病例在不同時(shí)間、連續(xù)檢測(cè) 5 次均呈陰性反應(yīng)，可再檢測(cè)時(shí)又由陰性轉(zhuǎn)呈陽(yáng)性反應(yīng)[7-8]，這對(duì)臨床診斷COVID-19及其疫情控制帶來(lái)種種不確定的因素及影響?？赡茉斐珊怂釞z測(cè)假陰性反應(yīng)的影響因素主要有病原學(xué)、樣本采集、核酸提取、試劑盒質(zhì)量等多個(gè)環(huán)節(jié)。

2.1 病原學(xué)因素與病毒核酸的檢測(cè)

SARS-CoV-2是單鏈 RNA 病毒，在其傳播過(guò)程中往往發(fā)生變異。為了能夠盡早明確診斷COVID-19，臨床現(xiàn)已應(yīng)用的核酸檢測(cè)試劑尚缺乏大樣本的臨床驗(yàn)證，如果被檢測(cè)病毒的引物設(shè)計(jì)區(qū)域已經(jīng)發(fā)生突變，即可能直接導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果的假陰性。

2.2 樣本因素與病毒核酸的檢測(cè)

SARS-CoV-2感染者若已出現(xiàn)臨床癥狀或肺部 CT改變，那么核酸檢測(cè)樣本首選下呼吸道樣本（如深咳痰液、灌洗液等）。而在感染者不同病程中，采取上呼吸道樣本（如鼻咽拭子）也能檢出病毒核酸。但是，臨床上由于多數(shù)感染者表現(xiàn)為咳痰困難，取下呼吸道灌洗液樣本的操作具有很大的生物安全風(fēng)險(xiǎn)，故臨床多采集鼻咽拭子或咽拭子樣本, 而拭子樣本采用RT-PCR檢測(cè)的陽(yáng)性檢出率僅有30%～50%[9]，無(wú)法避免假陰性的檢測(cè)結(jié)果，因此必須進(jìn)行多次采樣檢測(cè)或結(jié)合其他樣本的檢測(cè)結(jié)果以明確臨床診斷。相關(guān)專(zhuān)家共識(shí)指出應(yīng)采集感染者發(fā)病3 d內(nèi)的樣本，但多數(shù)感染者潛伏期為2～7 d，可能絕大多數(shù)感染者在就診時(shí)病程已經(jīng)遷延了數(shù)天或數(shù)周（COVID-19潛伏期長(zhǎng)達(dá)14 d，罕見(jiàn)病例甚至于長(zhǎng)達(dá)29 d），并不能確定樣本采集時(shí)是否為樣本檢測(cè)的最佳時(shí)段，亦不能確認(rèn)樣本內(nèi)病毒載量是否仍然處在方法學(xué)容許的最佳檢測(cè)范圍[10]。

根據(jù)臨床對(duì)213名COVID-19確診病例的866份樣本檢測(cè)結(jié)果的分析提示，發(fā)病后0～7 d采集的痰液、鼻拭子、咽拭子這三種類(lèi)型樣本核酸檢測(cè)陽(yáng)性率為60%。但隨著病程發(fā)展，這三種類(lèi)型樣本陽(yáng)性率均逐漸降低。因此，樣本采集及檢測(cè)應(yīng)該在發(fā)病后的0～7 d進(jìn)行。樣本除了肺泡灌洗液在8～14 d患者組的陽(yáng)性率可達(dá) 100%，痰液樣本在各個(gè)不同檢測(cè)時(shí)間段的陽(yáng)性率都高于其他實(shí)驗(yàn)觀察組，且鼻拭子樣本的陽(yáng)性檢出率高于咽拭子樣本[10-11]。痰樣本的病毒核酸含量高于咽拭子標(biāo)本（第六版指南建議為痰標(biāo)本）[4]。研究顯示SARS-CoV-2多趨向于與肺泡上皮細(xì)胞結(jié)合，主要感染下呼吸道甚至肺部，提示肺泡灌洗液或纖維支氣管鏡檢刷取物是較好的樣本選擇[9,12]。糞便是患者診療過(guò)程中理想的樣本，核酸檢出的持續(xù)時(shí)間普遍較呼吸道樣本更長(zhǎng)，同時(shí)糞便中SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性與感染者的疾病發(fā)展進(jìn)程具有重要的相關(guān)性，可以作為對(duì)患者的療效評(píng)估和出院標(biāo)準(zhǔn)的一種重要檢測(cè)指標(biāo)。此外，研究發(fā)現(xiàn)附有病毒保存液的植絨拭子的核酸檢出率明顯高于普通棉拭子的核酸檢出率（P＜0.05），普通棉簽拭子即使可以檢出, 其陽(yáng)性Ct值也明顯大于植絨拭子。一般認(rèn)為，對(duì)需要?dú)夤芮虚_(kāi)、進(jìn)行呼吸機(jī)搶救的患者可首先考慮采集下呼吸道標(biāo)本，對(duì)于輕癥患者可采集痰液標(biāo)本，也可采集鼻咽、口咽等上呼吸道標(biāo)本。

2.3 病毒核酸不同提取方法與病毒核酸的檢測(cè)

RT-PCR檢測(cè)的影響因素較多，如標(biāo)本核酸提取或純化過(guò)程出現(xiàn)的擴(kuò)增反應(yīng)抑制物、擴(kuò)增儀器孔間溫度差異等，或?qū)嶒?yàn)操作技術(shù)要求較高，操作不規(guī)范可導(dǎo)致核酸提取效率與純度較低。當(dāng)前常用的核酸提取方法主要有煮沸裂解法、柱提法和磁珠法（其又分手工磁珠法、自動(dòng)機(jī)器磁珠法）等，但以柱提法和磁珠法為常用。

有學(xué)者對(duì)58例已確診患者的原始樣本（均為帶有病毒保存液的咽拭子）分別采用離心柱法及磁珠法進(jìn)行病毒核酸提取后，PCR檢測(cè)結(jié)果的Ct值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9]（P＞0.05）。但不同的研究者應(yīng)用柱提法和磁珠法的提取效果的評(píng)價(jià)與結(jié)論卻并不一致。亦有研究表明，手工磁珠法和機(jī)器磁珠法兩者有效檢出率一致，兩方法間比較，手工磁珠提取病毒核酸效率最高，但步驟繁瑣，要求操作人員技術(shù)熟練[13]。手工磁珠提取需時(shí)10 min，且可以在60℃環(huán)境、同時(shí)孵育與振蕩，即可充分促進(jìn)病毒核酸的裂解釋放。而自動(dòng)機(jī)器磁珠提取法需時(shí)30 min，通常是在室溫下進(jìn)行病毒核酸的裂解釋放。且手工磁珠提取試劑是專(zhuān)一用于 RNA 的提取試劑，優(yōu)化效果更好。此外，濃縮一步法優(yōu)于普通一步法，兩者均能直接裂解釋放病毒核酸，但都未能對(duì)核酸進(jìn)行提純，對(duì)于復(fù)雜標(biāo)本的抗干擾能力較弱。提示對(duì)核酸提取時(shí)避免使用快速一步法，以減少可能出現(xiàn)的漏診或者假陰性。

2.4 不同檢測(cè)試劑與病毒核酸的檢測(cè)

在突發(fā)的公共衛(wèi)生事件情況下，為了及時(shí)明確診斷的需要，可能有的檢測(cè)試劑盒RNA質(zhì)量參差不齊、某些試劑盒引物設(shè)計(jì)的位點(diǎn)尚有待優(yōu)化。

郭元元等[14]對(duì)6種國(guó)產(chǎn)SARS-CoV-2核酸檢測(cè)試劑盒的檢測(cè)性能進(jìn)行了分析，結(jié)果表明有的患者病毒核酸顯示弱陽(yáng)性反應(yīng)可能不易被檢出，不同試劑的檢測(cè)結(jié)果亦存在一定的差異。在SARS-CoV-2感染早期，病毒復(fù)制數(shù)量往往低于RT-PCR檢測(cè)閾值，出現(xiàn)的假陰性反應(yīng)在所難免。為保證達(dá)到低水平病毒核酸檢測(cè)閾值的要求，實(shí)驗(yàn)室在使用某種新試劑前，或更換新的試劑批號(hào)時(shí)，均應(yīng)做相應(yīng)的檢測(cè)試劑性能的驗(yàn)證，以保證實(shí)驗(yàn)室的檢測(cè)質(zhì)量要求。同時(shí)，有必要采用 2種不同的試劑平行檢測(cè)以避免漏檢。當(dāng)然，這無(wú)疑會(huì)增加檢測(cè)的成本。此外，不同廠家試劑盒有其具體的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)參數(shù)及其技術(shù)要求，試劑盒與實(shí)驗(yàn)儀器的匹配性與感染者核酸檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性密切相關(guān)，因此，不同的實(shí)驗(yàn)室應(yīng)選擇與本實(shí)驗(yàn)室RT-PCR儀器檢測(cè)技術(shù)要求匹配相一致的檢測(cè)試劑盒。

2.5 SARS-CoV-2核酸檢測(cè)結(jié)果分析與解讀

國(guó)家衛(wèi)生健康委員會(huì)關(guān)于《新型冠狀病毒肺炎實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)技術(shù)指南》中要求確診的病例，需要滿(mǎn)足同一份檢測(cè)樣本中SARS-CoV-2的ORFlab及N基因的2個(gè)靶標(biāo)RT-PCR檢測(cè)均為陽(yáng)性，或2種不同類(lèi)型標(biāo)本的RT-PCR同時(shí)出現(xiàn)單靶標(biāo)陽(yáng)性，或同種類(lèi)型標(biāo)本2次采樣的RT-PCR均出現(xiàn)單靶標(biāo)陽(yáng)性[15-16]。如果檢測(cè)結(jié)果陰性，亦不能排除感染的可能。一般認(rèn)為SARSCoV-2在細(xì)胞中其mRNA往往數(shù)倍于病毒的基因組RNA，且可轉(zhuǎn)錄出不同長(zhǎng)度的mRNA，這些 mRNA都攜帶N基因，僅少數(shù)mRNA攜帶ORF1ab?，F(xiàn)在應(yīng)用的試劑盒所檢測(cè)的多為細(xì)胞內(nèi)的病毒mRNA，因患者標(biāo)本中N基因mRNA的拷貝數(shù)遠(yuǎn)高于ORF1ab基因，故當(dāng)SARS-CoV-2拷貝數(shù)較低時(shí)，攜帶N基因的檢測(cè)單通道陽(yáng)性檢出率較高。此外，N基因在SARS-CoV-2核酸序列中較ORF1ab保守，故還可能有少數(shù)樣本由于其他冠狀病毒種的核酸序列與其發(fā)生交叉反應(yīng)，導(dǎo)致N基因擴(kuò)增陽(yáng)性而ORF1ab出現(xiàn)陰性的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。臨床上對(duì)于核酸檢測(cè)為陰性或單通道陽(yáng)性的病例需謹(jǐn)慎分析與解讀，應(yīng)充分考慮到各環(huán)節(jié)中可能造成結(jié)果不準(zhǔn)確的影響因素[9-10,16]，例如保證試劑盒質(zhì)量、規(guī)范采樣、樣本的保存和運(yùn)輸、及時(shí)送檢，優(yōu)化檢測(cè)流程，提高實(shí)驗(yàn)室人員檢測(cè)技術(shù)水平等，是保障和提高核酸檢測(cè)準(zhǔn)確性的有效措施，亦是影響目前抗疫的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。

此外，有的COVID-19患者康復(fù)期病毒核酸檢測(cè)結(jié)果由“陰性”轉(zhuǎn)呈“陽(yáng)性”反應(yīng)，備受關(guān)注。分析其原因[17]與以上所述的RT-PCR技術(shù)因素等導(dǎo)致的“假陰性”密切相關(guān)之外，可能還與患者呼吸道纖毛上皮損傷致排出功能降低及分泌型免疫球蛋白A（secretory IgA，sIgA）結(jié)合病毒的解離多種原因相關(guān)。裴銀輝等[17]認(rèn)為由于核酸檢測(cè)靶點(diǎn)為病毒的核酸片段，并不能反映樣本中是否含有感染性的完整病毒顆粒。SARS-CoV-2感染檢測(cè)顯示真陽(yáng)性的病例體內(nèi)存在病毒復(fù)制，具有極高的傳染風(fēng)險(xiǎn)。

COVID-19患者治愈后是否會(huì)復(fù)陽(yáng)？李泉等[18]對(duì)COVID-19恢復(fù)期病毒核酸檢測(cè)復(fù)陽(yáng)與陰性患者淋巴細(xì)胞亞群及形態(tài)學(xué)特征的比較研究發(fā)現(xiàn)，所有COVID-19 陰性反應(yīng)患者外周血中均出現(xiàn)較多變異的淋巴細(xì)胞，平均值為12.13%，最低為 6%，最高為28%。顯示這些患者已經(jīng)建立免疫功能、產(chǎn)生了細(xì)胞免疫。但恢復(fù)期病毒核酸檢測(cè)復(fù)檢陽(yáng)性病例的變異淋巴細(xì)胞平均僅為 2.36%。因此，變異淋巴細(xì)胞似可提示COVID-19患者是否產(chǎn)生細(xì)胞免疫或是免疫功能建立的一個(gè)重要觀察指標(biāo)。

3 結(jié)語(yǔ)

目前，最常用的病原學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷仍然是采用RTPCR進(jìn)行核酸檢測(cè)，核酸檢測(cè)結(jié)果是COVID-19患者確診和治愈出院的重要依據(jù)，但臨床檢驗(yàn)中暴露的SARS-CoV-2核酸檢測(cè)“假陰性”問(wèn)題，對(duì)于核酸檢測(cè)質(zhì)量提出了更高的要求。SARS-CoV-2核酸檢測(cè)的“假陰性”問(wèn)題可從上述多個(gè)關(guān)鍵影響因素著手予以應(yīng)對(duì)，以盡可能降低核酸檢測(cè)的“假陰性”反應(yīng)，為臨床提供準(zhǔn)確、可靠的檢測(cè)結(jié)果。

臨床免疫學(xué)研究提示，IgM在病毒感染早期1周左右出現(xiàn)，是急性期病毒感染的診斷指標(biāo)，但抗體滴度相對(duì)較低、維持時(shí)間較短。IgG在病毒感染后3周左右出現(xiàn)，并在感染者體內(nèi)存在較長(zhǎng)的時(shí)間，抗體滴度有一個(gè)持續(xù)增高的過(guò)程。因此，可通過(guò)核酸檢測(cè)與特異性抗體動(dòng)態(tài)檢測(cè)的結(jié)果，明確是否為SARS-CoV-2感染。

國(guó)家衛(wèi)生健康委發(fā)布的《新型冠狀病毒肺炎診療方案》（第七版）實(shí)驗(yàn)室檢查中新增了血清SARSCoV-2抗體檢測(cè)的內(nèi)容，當(dāng)核酸檢測(cè)為陰性時(shí)，可通過(guò)觀察IgM、IgG的動(dòng)態(tài)變化，以明確COVID-19診斷[19]。無(wú)論后續(xù)核酸檢測(cè)是否為陽(yáng)性，若一周左右再次檢測(cè)抗體，IgG由陰性轉(zhuǎn)呈陽(yáng)性反應(yīng)，或抗體滴度持續(xù)升高達(dá)4倍及以上，則可判斷急性或近期感染，可作為SARS-CoV-2感染的血清學(xué)證據(jù)。IgM、IgG聯(lián)合SARS-CoV-2核酸檢測(cè)，可能是目前實(shí)驗(yàn)診斷COVID-19的優(yōu)選檢測(cè)方案。當(dāng)然，針對(duì)SARS-CoV-2感染不同的檢測(cè)方法，均存在其相應(yīng)的方法學(xué)局限性，因此，對(duì)于不同實(shí)驗(yàn)方法的檢測(cè)結(jié)果應(yīng)該密切結(jié)合臨床，嚴(yán)謹(jǐn)?shù)剡M(jìn)行分析，以為疫情防控提供科學(xué)、可靠的實(shí)驗(yàn)診斷結(jié)果。