間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療股骨頭壞死的研究進(jìn)展*

劉沛 劉國(guó)杰 葉曄 李帥壘 孫永強(qiáng) 郭萬首 王衛(wèi)國(guó) 張啟棟**

（1.河南省洛陽正骨醫(yī)院河南省骨科醫(yī)院人工關(guān)節(jié)翻修科，鄭州 450000；2.中日友好醫(yī)院骨科，北京 100029）

股骨頭壞死（osteonecrosis of femoral head,ONFH）好發(fā)于20～50 歲的中青年，若早期失治誤治，大約70%的患者2 年內(nèi)將發(fā)生股骨頭塌陷。ONFH的治療方法可歸納為3類：①手術(shù)治療；②手術(shù)保髖治療；③全髖關(guān)節(jié)置換術(shù)（total hip arthroplasty,THA）。非手術(shù)治療的療效欠佳，往往最終仍需手術(shù)治療[1]。手術(shù)保髖治療的術(shù)式包括：?jiǎn)瓮ǖ阑蚨嗤ǖ浪栊緶p壓術(shù)（core decompression,CD）[2]、各類截骨術(shù)[3,4]、帶血管蒂或不帶血管蒂的植骨術(shù)[5,6]，這些手術(shù)方法各有利弊。對(duì)于晚期的ONFH，THA 是最終和最佳的治療選擇。但是，年輕、活動(dòng)量大的患者初次THA術(shù)后將面臨二次或多次翻修的風(fēng)險(xiǎn)；患者的生活、工作、運(yùn)動(dòng)方式存在不同程度受限，松動(dòng)、感染、脫位等與假體相關(guān)的并發(fā)癥的發(fā)生率也相對(duì)較高[7]。

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cells,MSCs）是一種具有自我增殖、分化潛能的細(xì)胞群體，在機(jī)體發(fā)育、疾病發(fā)展及治療中發(fā)揮著重要的作用。1993 年，Hernigou 等首次應(yīng)用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（bone marrow stem cells,BMSCs）治療ONFH，并于2002 年報(bào)道了該技術(shù)的保髖成功率高達(dá)93.8%[8]。越來越多成功病例的報(bào)道，讓MSCs治療ONFH成為研究的熱點(diǎn)。本文就該技術(shù)治療ONFH 的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 基礎(chǔ)研究

1.1 作用機(jī)制

Gangji等[9]發(fā)現(xiàn)，骨壞死區(qū)干細(xì)胞的數(shù)量及活性明顯下降，并提出將具有成血管和成骨分化潛能的干細(xì)胞移植至骨壞死區(qū)的治療思路。因此，干細(xì)胞移植治療ONFH 的關(guān)鍵是：作為“種子”的干細(xì)胞能否在壞死區(qū)缺血、低氧的微環(huán)境下存活并發(fā)揮其分化潛能[10]。Yan等[11]對(duì)犬的創(chuàng)傷性O(shè)NFH模型實(shí)施CD 聯(lián)合自體的MSCs 移植術(shù)，研究發(fā)現(xiàn)：綠色熒光蛋白標(biāo)記的MSCs 可以在ONFH 病灶內(nèi)存活12周；增殖方面，從第2周的15%增殖至第12周的38%；成骨方面，兩組在第2周時(shí)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（9.36%vs8.42%，P＞0.05），在第8周、第12周時(shí)MSCs 組均優(yōu)于對(duì)照組（22.82%vs14.72%，P＜0.05；31.08%vs20.66%，P＜0.05）。上述結(jié)論表明：移植的自體MSCs可以在ONFH缺血的微環(huán)境下存活、增殖并分化成骨。Jin 等[12]得到相似的結(jié)論：經(jīng)動(dòng)脈介入灌注的MSCs 可以遷移到股骨頭的壞死灶，并分化為成骨細(xì)胞。Ciapetti 等[13]的研究進(jìn)一步證實(shí)：與正常氧分壓組（21%PO2）BMSCs分化能力相比，低氧分壓組（2%PO2）BMSCs 的增殖能力明顯提高，堿性磷酸酶（alkaline phosphatase,ALP）、Ⅰ型膠原酶、骨鈣蛋白等與成骨分化相關(guān)的基因均高表達(dá)；而且成骨誘導(dǎo)的礦物沉積不但沒有受到抑制，在某些病例反而有增強(qiáng)的趨勢(shì)。上述研究表明，移植的自體BMSCs可以在骨壞死灶低氧的微環(huán)境下生存，并保持其分化潛能。Fan 等[14]研究發(fā)現(xiàn)，與正常組兔子BMSCs 的分化功能相比，ONFH 組BMSCs 的成骨分化降低、成脂分化增加；然而，在低氧暴露后，其損傷的增殖潛能得到逆轉(zhuǎn)，表現(xiàn)為成骨分化增加、成脂分化減少。同時(shí)，作者還發(fā)現(xiàn)：CD 術(shù)后，低氧分壓組MSCs 的血管生成能力增加，凋亡降低[15]。多項(xiàng)研究也得出類似的結(jié)論：分化初始階段的MSCs 接受低氧暴露，可以促進(jìn)成骨分化表達(dá)[16,17]。

在ONFH的動(dòng)物模型中，移植的MSCs可以在缺血、低氧的微環(huán)境下存活、增殖并分化成骨；低氧的微環(huán)境不但沒有損傷MSCs 的功能，反而促進(jìn)其成骨分化。

1.2 MSCs的基因工程

基因工程也可用來修飾干細(xì)胞，如骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（bone morphogenetic protein-2,BMP-2）、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子（basic fibroblast growth factor,bFGF）、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（hepatocyte growth factor,HGF）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）等。Tang 等[18]采用BMP-2 修飾的BMSCs 來修復(fù)山羊模型的ONFH，取得了良好的效果。Pend 和Wang[19]證明BMP-2 和bFGF 成骨、成血管共修飾的BMSCs 可以成功修復(fù)比格犬模型的骨壞死。VEGF 單獨(dú)或聯(lián)合BMP-2 修飾的MSCs 在犬和兔子的實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭幸踩〉昧肆己玫男Ч鸞20,21]。Wen 等[22]研究表明，CD 聯(lián)合HGF 轉(zhuǎn)染的自體BMSCs 移植可以促進(jìn)兔子ONFH 模型中血管的再生、骨的重建。

MSCs的基因修飾有望成為提高ONFH療效的一種潛在的有效方法。然而，上述結(jié)果都是在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中獲得的，其在ONFH 患者中的有效性和安全性仍需進(jìn)一步評(píng)估。

1.3 MSCs來源的外泌體

除增殖、分化潛能外，MSCs還具有旁分泌的功能[23]。一方面，它能夠分泌生長(zhǎng)因子、細(xì)胞因子、趨化因子等多種活性因子，進(jìn)入骨壞死區(qū)，促進(jìn)成血管、成骨分化。另一方面，它可以通過分泌不同類型的胞外囊泡（extracellular vesicles,EVs）調(diào)節(jié)靶基因功能，比如外泌體、微囊泡。外泌體富含mRNA、miRNA、酶、脂質(zhì)等多種成分，具有調(diào)節(jié)局部微環(huán)境，抑制炎癥反應(yīng)，促進(jìn)損傷組織修復(fù)等功能。與MSCs 相比，外泌體具有以下優(yōu)勢(shì)：①明顯免疫原性[24]；②直徑為40～160 nm，降低了血管栓塞、致瘤等風(fēng)險(xiǎn)；③穩(wěn)定性好，-20℃環(huán)境下可離體保存6 個(gè)月；④使用方便，可采用口服或靜脈注射等方式使用，避免手術(shù)或介入操作所致的并發(fā)癥。因此，理論上分析，MSCs 來源外泌體（exosomes derived from MSCs,MSCs-Exos）移植治療ONFH 更具發(fā)展前景。

Guo等[25]將人滑膜MSCs-Exos經(jīng)尾靜脈注射至大鼠激素性O(shè)NFH 模型中，發(fā)現(xiàn)其具有改善糖皮質(zhì)激素對(duì)BMSCs增殖抑制和促進(jìn)凋亡的效應(yīng)。Liu等[26]發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)性多能MSCs-Exos 通過激活PI3K/Akt 信號(hào)通路，從而促進(jìn)大鼠激素性O(shè)NFH 模型的股骨頭血管生成，延緩骨壞死的進(jìn)展。周山健等[27]制備了富含miR-126的BMSCs-Exos，發(fā)現(xiàn)其能夠改善大鼠激素性O(shè)NFH的血供，增加骨量。Liao等[28]發(fā)現(xiàn)攜帶過表達(dá)miR-122-5p 的BMSCs-Exos 經(jīng)MAPK 信號(hào)通路下調(diào)SPRY2，從而延緩ONFH 的進(jìn)展。Fang 等[29]發(fā)現(xiàn)大鼠的BMSCs-Exos 成脂分化受到抑制，差異表達(dá)的基因表現(xiàn)為成骨分化相關(guān)的BMP2、BMP6、BMP1b、MMP9、SOX9 上調(diào)，信號(hào)通路涉及免疫反應(yīng)、成骨分化和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/BMP。

MSCs-Exos 雖在ONFH 的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中取得了良好的療效，但其作用機(jī)制仍不明確，MSCs-Exos 能否取代MSCs 還有待進(jìn)一步研究。此外，有報(bào)道稱外泌體載體可以轉(zhuǎn)移與神經(jīng)退行性疾病相關(guān)的毒性蛋白[30]。因此，MSCs-Exos的安全性問題不容忽視。

2 臨床應(yīng)用

2.1 臨床療效

近年來，關(guān)于MSCs移植治療ONFH的臨床報(bào)道越來越多。有些學(xué)者認(rèn)為：該方法能夠有效緩解疼痛，改善關(guān)節(jié)活動(dòng)度和功能，延緩骨壞死病程的進(jìn)展，甚至避免THA。Kang 等[31]一項(xiàng)納入了106 髖的研究發(fā)現(xiàn)，MSCs 治療組因保髖失敗而改行THA 的比例低于對(duì)照組（20%vs50%，P=0.014）。然而，一些學(xué)者對(duì)此技術(shù)持謹(jǐn)慎態(tài)度。Pepke等[32]一項(xiàng)納入了25髖的前瞻性隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)顯示：經(jīng)過2年的隨訪，與CD 組相比，CD 聯(lián)合骨髓抽取物組并沒有顯著提高保髖的成功率。Papakostidis 等[33]meta 分析認(rèn)為，在股骨頭塌陷前，將自體BMSCs 經(jīng)CD 通道移植，可以提高股骨頭的存活率，減少THA 的需求率。同時(shí)，Mao 等[34]一項(xiàng)納入了13 篇隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的meta分析也得到相似的結(jié)論：干細(xì)胞移植療法可以有效預(yù)防早期ONFH的進(jìn)展。

因此，盡管存在一些爭(zhēng)議，MSCs 移植治療ONFH 能夠促進(jìn)壞死區(qū)骨組織的修復(fù)、減輕髖關(guān)節(jié)疼痛、延緩病情進(jìn)展已得到大部分學(xué)者的認(rèn)可。臨床療效不同的原因可能在于研究間的異質(zhì)性，如患者選擇、細(xì)胞來源、細(xì)胞移植數(shù)量和細(xì)胞移植方式等差異。

2.2 患者選擇

研究表明，MSCs移植治療ONFH的臨床療效與患者自身因素具有相關(guān)性。ONFH 的分期是最重要的影響因素之一。Ma等[35]一項(xiàng)納入了53髖的前瞻性隨機(jī)雙盲對(duì)照試驗(yàn)表明：CD 聯(lián)合MSCs 技術(shù)對(duì)于Ficat Ⅰ、Ⅱ期的ONFH 治愈率高達(dá)100%。同時(shí)，Kang 等[31]報(bào)道：CD 聯(lián)合BMSCs 不能延緩ARCO Ⅲ、Ⅳ期骨壞死的進(jìn)程。Sen等[36]認(rèn)為，創(chuàng)傷性O(shè)NFH的預(yù)后優(yōu)于非創(chuàng)傷性O(shè)NFH，這表明病因是影響臨床療效的另一個(gè)因素。此外，Houdek 等[37]認(rèn)為改良Kerboul 角較小的患者能獲得更好的療效。因此，ONFH 分期、壞死灶大小、部位以及病因等都是影響療效的重要因素。隨著年齡增長(zhǎng)，供區(qū)提取、分離的MSCs 數(shù)量隨之減少，增殖能力也有所降低[38]。Stenderup等[39]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)：老年人的MSCs功能在體外試驗(yàn)中是降低的，但并不影響其在體內(nèi)的分化能力。Ganguly等[40]通過成纖維集落分析和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，BMSCs 數(shù)量、功能與年齡無相關(guān)性。Sen等[36]報(bào)道，患者的性別、病變關(guān)節(jié)的側(cè)別以及對(duì)側(cè)髖關(guān)節(jié)是否受累均不影響B(tài)MSCs的功能。上述因素是否影響ONFH的保髖療效尚存爭(zhēng)議。

因此，MSCs移植保髖治療獲得滿意療效的前提是選擇適當(dāng)?shù)幕颊摺?/p>

2.3 MSCs與其他來源干細(xì)胞的對(duì)比

可用于ONFH 治療的干細(xì)胞包括：MSCs、脂肪干細(xì)胞（adipose derived stem cell,ADSCs）、臍血干細(xì)胞（cord blood stem cell,CBSCs）和外周血干細(xì)胞（peripheral blood stem cell,PBSCs）。BMSCs是最為常用的MSCs，Rastogi 等[41]對(duì)比了CD 聯(lián)合離心的單個(gè)核細(xì)胞組和CD 聯(lián)合未處理的骨髓抽取物組之間的療效，研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)：兩組的髖關(guān)節(jié)功能評(píng)分較術(shù)前均有顯著改善；MRI 復(fù)查發(fā)現(xiàn)，離心的單個(gè)核細(xì)胞組骨壞死病灶面積減小，而骨髓抽取物組10%的病例需行THA。作者認(rèn)為，對(duì)于早期ONFH 的治療，離心的單個(gè)核細(xì)胞組療效更優(yōu)。此外，ADSCs也是常用的“種子”細(xì)胞。與BMSCs 相比，ADSCs具有來源廣泛、獲取量大、成本低、創(chuàng)傷小、痛苦少等優(yōu)勢(shì)。體外研究還表明，在細(xì)胞生長(zhǎng)速度、成骨分化方面，ADSCs 優(yōu)于BMSCs[42]。Pak[43]發(fā)現(xiàn)自體ADSCs 聯(lián)合富血小板血漿（platelet rich plasma,PRP）髖關(guān)節(jié)局部注射后，病變關(guān)節(jié)疼痛緩解，功能改善，MRI 復(fù)查發(fā)現(xiàn)新骨形成。CBSCs 來源于廢棄的臍帶，來源廣泛，收集簡(jiǎn)單，倫理可行；而且易于分離，數(shù)量大，免疫原性低，可傳30～40 代，體外擴(kuò)增簡(jiǎn)便。Cai等[44]觀察了自體BMSCs和異體臍血干細(xì)胞（human umbilical cord-derived MSCs,hUC MSCs）移植治療ONFH的療效，隨訪12個(gè)月未發(fā)現(xiàn)嚴(yán)重不良反應(yīng)。Chen 等[45]分析了hUC MSCs 移植治療ONFH 的臨床效果，經(jīng)過3 年的隨訪發(fā)現(xiàn)，壞死灶減少，且無明顯副作用。

然而，上述研究的病例數(shù)量均較少，仍需大樣本量高質(zhì)量隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)的長(zhǎng)期隨訪來評(píng)估不同組織來源干細(xì)胞移植治療ONFH的有效性和安全性。

2.4 移植MSCs的數(shù)量

文獻(xiàn)報(bào)道，MSCs移植治療ONFH的療效與細(xì)胞數(shù)量具有相關(guān)性[33,37]。髂骨骨髓中約每3萬個(gè)有核細(xì)胞中含1 個(gè)祖細(xì)胞，骨髓有核細(xì)胞平均數(shù)為18×106/ml，因此祖細(xì)胞的數(shù)量約為600/ml。通過MRI 和組織學(xué)觀察顯示，股骨頭中骨小梁的比例約為1/3，其余2/3 為脂肪和血液細(xì)胞[46]。根據(jù)松質(zhì)骨的1/3 為骨基質(zhì)估算，每立方厘米新骨約含有2000萬個(gè)成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞[46]。因壞死灶的平均體積約為15 cm3，所以大約需要3×108個(gè)（2000 萬個(gè)細(xì)胞/cm3×15 cm3）成骨細(xì)胞或骨細(xì)胞來進(jìn)行新骨的修復(fù)。早期，Hernigou等[47]報(bào)道的BMSCs注射劑量為24×103至25×103個(gè)細(xì)胞。目前，大部分文獻(xiàn)報(bào)道的劑量為106～109，其中最常用的劑量為108[32,36,41,48,49]。

然而，成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞數(shù)量不僅取決于所注射的干細(xì)胞的數(shù)量，還與在骨壞死缺血、低氧的微環(huán)境下，干細(xì)胞可增殖的次數(shù)、具有成骨分化活性干細(xì)胞的數(shù)量相關(guān)。此外，是否注射的干細(xì)胞數(shù)量越多越好，以及是否存在最大注射量的安全閾值，仍然未知。

2.5 MSCs的移植方式

MSCs 移植治療ONFH 的移植方式主要有3 種：①動(dòng)脈介入法。利用動(dòng)脈介入技術(shù)，將MSCs 注入旋股內(nèi)側(cè)動(dòng)脈、旋股外側(cè)動(dòng)脈或閉孔動(dòng)脈，利用血液循環(huán)攜帶干細(xì)胞至股骨頭的壞死灶處。Cai等[44]通過數(shù)字減影血管造影術(shù)將自體BMSCs 和異體CBSCs移植至股骨頭動(dòng)脈，發(fā)現(xiàn)該方法可以提高保髖成功率。該研究表明，經(jīng)動(dòng)脈介入干細(xì)胞灌注法是治療ONFH 的有效方法，但需要相應(yīng)的設(shè)備和一定的介入操作技術(shù)。②髓芯減壓通道灌注法。利用CD 的骨道，將干細(xì)胞混懸液注入股骨頭的壞死灶局部[32,50]。該方法克服了干細(xì)胞混懸液因血液再分配所致數(shù)量不足的弊端，增加“種子細(xì)胞”的密度。因此，經(jīng)CD 通道干細(xì)胞原位灌注法可以顯著提高療效[51]。③復(fù)合支架材料植入法。該方法將經(jīng)體外分離、鑒定、純化的干細(xì)胞，在標(biāo)準(zhǔn)化制備后通過支架載體植入骨壞死灶。Kang 等[52]采用自體髂骨聯(lián)合BMSCs 移植治療ONFH 患者52 例（61 髖），經(jīng)平均68 個(gè)月的隨訪，對(duì)早期ONFH 保髖療效顯著。Kawate 等[53]以β-磷酸三鈣為載體復(fù)合自體BMSCs，聯(lián)合游離腓骨移植治療ONFH，影像學(xué)隨訪檢查發(fā)現(xiàn)新骨形成。該方法的優(yōu)勢(shì)在于不僅保證了干細(xì)胞的質(zhì)量，而且可以使移植細(xì)胞的數(shù)量精準(zhǔn)化。但耗時(shí)長(zhǎng)、成本高，有可能損傷干細(xì)胞的分化潛能，從而影響療效。

總體來說，無論使用哪種MSCs 移植方式，均能取得良好的臨床療效。

2.6 MSCs移植的安全性

干細(xì)胞移植可增加異位骨化[54]、致癌的風(fēng)險(xiǎn)[55]，免疫排斥和細(xì)胞去分化等問題也限制了干細(xì)胞移植技術(shù)的臨床應(yīng)用[56]。回顧目前關(guān)于MSCs移植治療ONFH 的文獻(xiàn)，大多數(shù)研究都未發(fā)生嚴(yán)重的并發(fā)癥，只有少數(shù)研究報(bào)道患者出現(xiàn)臉紅、輕度頭痛和發(fā)熱等并發(fā)癥[57]。此外，對(duì)于需要在體外進(jìn)行擴(kuò)增的干細(xì)胞，整個(gè)制備過程必須嚴(yán)格監(jiān)督、標(biāo)準(zhǔn)化操作，既要保持干細(xì)胞整體表型和分化潛能，又要確保所培養(yǎng)的干細(xì)胞未被污染。

因此，應(yīng)用MSCs移植治療ONFH似乎是相對(duì)安全的。然而，仍需更多高質(zhì)量的研究和長(zhǎng)期的隨訪來證實(shí)。

3 總結(jié)與展望

綜上所述，MSCs移植治療ONFH是安全、有效的。在基礎(chǔ)研究方面，對(duì)MSCs進(jìn)行預(yù)處理和精準(zhǔn)的細(xì)胞亞群選擇有望提高ONFH 療效。同時(shí)，利用基因組織工程修飾MSCs也是提高療效的有益嘗試。近年來，MSCs-Exos 在組織再生工程中發(fā)揮著越來越重要的作用，并有可能成為MSCs 之外的另一種選擇。然而，上述動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的結(jié)果還有待臨床進(jìn)一步驗(yàn)證。在臨床應(yīng)用方面，早期的ONFH（ARCO Ⅰ、Ⅱ期）、改良Kerboul 角較小的患者似乎是該技術(shù)的良好適應(yīng)證。BMSCs 是最常用的干細(xì)胞，其他類型的干細(xì)胞，如ADMSCs，生長(zhǎng)速度快、成骨分化潛力大，有望成為BMSCs的替代。此外，療效與MSCs移植的數(shù)量相關(guān)，根據(jù)現(xiàn)有的臨床經(jīng)驗(yàn)，注射106～109個(gè)有核細(xì)胞可能是比較合適的，但目前仍無注射數(shù)量、頻次及移植方法的參考標(biāo)準(zhǔn)。