半邊蓮總黃酮提取工藝及抑菌活性的研究

蔣瓊鳳，溫?fù)碥?，袁志輝

1湖南科技學(xué)院，永州 425199;2 湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院，株州 412004

半邊蓮(Lobelia chinensis lour)為桔?？瓢脒吷彽母稍锶?，為中國藥典收錄的常用中藥，含生物堿、黃酮甙、皂甙、氨基酸［1，2］等多種活性成分，既可內(nèi)服又可外用，療效較好，具有顯著的抗腫瘤、抗氧化、鎮(zhèn)痛消炎等藥理作用［3-5］，是一類值得大力開發(fā)應(yīng)用的植物。目前有關(guān)半邊蓮的藥效研究主要集中在半邊蓮生物堿上，對黃酮的研究鮮有報道。黃酮類化合物具有清除自由基、抗衰老、抗癌、抗病毒、抗菌消炎等［6，7］多種生物活性，由于合成食品添加劑的毒副作用，從植物當(dāng)中提取黃酮作為天然抑菌劑或防腐劑越來越受到人們的青睞［8］。本研究對半邊蓮中總黃酮進(jìn)行提取，并優(yōu)化其工藝條件，同時考察半邊蓮黃酮提取物對常見細(xì)菌、真菌的抑制作用，旨在為開發(fā)半邊蓮天然食品保鮮劑提供理論依據(jù)，也為拓寬醫(yī)療病種提供一定參考思路，使半邊蓮更廣泛地應(yīng)用于臨床。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

半邊蓮(湖南永州中草藥材市場采購)，洗凈后干燥至水分含量在0.5%以下，粉碎過40 目篩備用。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(中國藥品生物制品檢驗所);硝酸鋁、亞硝酸鈉、95%乙醇、氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、硫酸鎂(MgSO4·7H2O)、氯化鉀、硫酸亞鐵、蔗糖等均為分析純。供試菌株:金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌、青霉菌、酵母菌等均由湖南科技學(xué)院微生物實驗室提供。

752 型紫外可見分光光度計(上海菁華科技儀器有限公司)，AY220 型電子分析天平(島津國際貿(mào)易公司)，WD800GL 型微波爐(格蘭仕微波爐電器有限公司)，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)，自動型手提式滅菌鍋YXQ-LS-18SI(上海博迅實業(yè)有限公司)，恒溫光照培養(yǎng)箱MJX-250B-Z(上海博迅實業(yè)有限公司)，超凈工作臺ZHJH-1109(上海制成分析儀器制造有限公司)等。

1.2 實驗方法

1.2.1 半邊蓮總黃酮的提取

精密稱取半邊蓮粉末0.500 g 于燒杯中，加入一定量一定濃度的乙醇，在一定水浴溫度下提取一定時間，提取液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥、濃縮至膏狀，得總黃酮粗提物。單因素實驗分別考察不同乙醇濃度、提取溫度、料液比、提取時間對半邊蓮總黃酮得率的影響，在單因素實驗基礎(chǔ)上，選取乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間中影響較大的三個水平進(jìn)行L9(34)正交實驗設(shè)計，見表1。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品0.020 g，用70%乙醇溶解于100 mL 的容量瓶中，定容配制成0.20 mg/mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。精確吸取標(biāo)準(zhǔn)溶液0.0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mL 于10 mL 的容量瓶中，加入0.5mL 5%的亞硝酸鈉和0.5 mL、10%的硝酸鋁分別靜置6 min，再加入2 mL 1 mol/L 的氫氧化鈉溶液并用70%乙醇定容，靜置15 min，以70%乙醇液作空白溶液，用752 型分光光度計在510 nm 處測定吸光度值［9］。然后以蘆丁濃度C(mg/mL)為橫坐標(biāo)，吸光度值A(chǔ) 為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為y=10.3x-0.002，R2=0.9989。

表1 正交實驗因素水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiment

1.2.3 樣品液總黃酮的測定

精密吸取樣品液于25 mL 的容量瓶中，按標(biāo)準(zhǔn)曲線法在510 nm 處測定吸光度，并以下式計算總黃酮提取率(%):

式中:C-為總黃酮質(zhì)量濃度(mg/mL);V-半邊蓮總黃酮提取液的體積(mL);N-為稀釋的倍數(shù);M-為半邊蓮樣品質(zhì)量(g)。

1.2.4 半邊蓮黃酮的抑菌作用

1.2.4.1 總黃酮提取物的制備

稱取半邊蓮粉末，以料液比1∶50，加入70%乙醇，在60 ℃下提取2.5 h，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀干燥、濃縮至膏狀，得總黃酮粗提物，密封，于0～4 ℃保存。使用前準(zhǔn)確稱取膏狀物樣品用0.85%生理鹽水配制成1 g/mL 和0.1 g/mL 樣品溶液，置于紫外燈下照射1 h 滅菌后備用。

1.2.4.2 菌懸液的制備

細(xì)菌培養(yǎng)采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基，真菌采用察氏培養(yǎng)基。將供試的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、變形桿菌、酵母菌分別移接入相對應(yīng)的培養(yǎng)基上培養(yǎng)，細(xì)菌37 ℃培養(yǎng)24 h，真菌30 ℃培養(yǎng)48 h。取活化好的菌種斜面，分別溶于50 mL 無菌生理鹽水中，充分振蕩搖勻，平板計數(shù)法制成含菌數(shù)1.0 ×106cfu/mL 的菌懸液，并稀釋至1.0 ×103cfu/mL，留存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4.3 抑菌活性的測定

將直徑90 mm 培養(yǎng)皿上的培養(yǎng)基分為3 個區(qū)，用移液器吸取0.1 mL 的菌懸液，涂布均勻后，每個區(qū)分別用8 mm 的打孔器打孔，其中2 孔為平行，1孔無菌生理鹽水為對照，每孔加入0.2 mL 的半邊蓮黃酮提取液。細(xì)菌置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d后，測定抑菌圈直徑大小;青霉菌及酵母菌于30 ℃培養(yǎng)3～5 d 后測定抑菌圈直徑。

1.2.4.4 半邊蓮總黃酮的最低抑菌濃度(MIC)測定

取0.1 g/mL 的半邊蓮總黃酮樣品液，采用二倍稀釋法［10］稀釋為:100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.5625、0 mg/mL 并加入到培養(yǎng)基中，將濃度為1.0×103cfu/mL 菌懸液接種到各試管內(nèi)，細(xì)菌置于37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 d 后，霉菌及酵母菌于30 ℃培養(yǎng)3～5 d，觀察結(jié)果。以完全無菌生長的最高稀釋度為半邊蓮總黃酮對該菌的最低抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 乙醇濃度對總黃酮提取率的影響

在提取時間2 h、料液比1∶40、水浴溫度60 ℃條件下，分別用50%、60%、70%、80%、90%的乙醇進(jìn)行提取，考察乙醇濃度對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1(A)。

由圖1(A)可知，隨著乙醇濃度的增大，總黃酮的提取率也增加，當(dāng)乙醇濃度為70%時總黃酮提取率最大;乙醇濃度繼續(xù)增大，總黃酮提取率反而減少?？赡苁怯捎谝掖紳舛炔煌鄬﹄s質(zhì)含量不同，其極性也不一樣，在乙醇濃度為70%時，極性相似，使黃酮提取率最高。

2.1.2 料液比對總黃酮提取率的影響

分別以1∶30、1∶40、1∶50、1∶60、1∶70 的料液比，在提取時間2 h、乙醇濃度70%、水浴溫度60 ℃下進(jìn)行提取，考察料液比對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1(B)。

由圖1(B)可知，隨著溶劑量的增加，總黃酮提取率逐漸升高，到50 倍量以后基本持平。由于料液比增加，會給后續(xù)處理工序增加困難，在保證提取效果的前提下，為節(jié)約成本，應(yīng)盡量減少溶劑用量和降低蒸發(fā)濃縮負(fù)荷，故選用1∶40、1∶50、1∶60 進(jìn)行正交實驗。

2.1.3 提取溫度對總黃酮提取率的影響

在料液比1∶40、乙醇濃度70%，提取時間2 h條件下，分別以水浴溫度40、50、60、70、80 ℃下進(jìn)行提取，考察水浴溫度對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1(C)。

由圖1(C)可知，當(dāng)溫度低于60 ℃時，總黃酮提取率隨著溫度的升高而增加，可能溫度的升高，溶劑的粘度減小，分子運動速度加快，浸提液的擴(kuò)散系數(shù)增加，促使浸提速度加快，提取率升高;溫度高于60℃時，黃酮提取率反而降低，可能溫度的升高使黃酮化合物結(jié)構(gòu)遭到破壞，故提取率降低。

2.1.4 提取時間對總黃酮提取率的影響

在水浴溫度60 ℃、料液比1∶40、乙醇濃度70%條件下進(jìn)行提取，分別提取1、1.5、2、2.5、3 h，考察提取時間對總黃酮提取率的影響，結(jié)果見圖1(D)。

由圖1(D)可知，隨著提取時間的延長，總黃酮提取率先升高后下降。可能提取時間越長，總黃酮在乙醇溶液中充分溶解，提取率最高;但提取時間過長，會導(dǎo)致部分總黃酮的氧化分解，從而提取率降低。

圖1 乙醇濃度(A)、料液比(B)、提取溫度(C)、提取時間(D)對總黃酮提取率的影響Fig.1 Effects of ethanol concentration (A)，solid-liquid ratio (B)，extraction temperature (C)and extraction duration (D)on the extraction yield of total flavonoids

2.2 正交實驗優(yōu)化提取工藝

按1.2.1 中表1 進(jìn)行實驗，結(jié)果見表2。

由正交試驗的極差分析可知，乙醇濃度、料液比、提取溫度、提取時間對半邊蓮中總黃酮的提取率均有不同程度的影響，其中提取時間影響最大，料液比影響最小，各因素的影響順序依次是:B ＞A ＞D ＞C，即提取時間＞提取溫度＞乙醇濃度＞料液比。

綜上所述分析可得半邊蓮中總黃酮的提取工藝最佳組合是:A2B2C1D2，即提取溫度60 ℃、提取時間2.5 h、料液比為1∶40、乙醇濃度為60%。采用上述最優(yōu)工藝條件進(jìn)行驗證試驗，最終得到半邊蓮中總黃酮提取率為1.69%。

2.3 半邊蓮總黃酮提取物的抑菌效果

2.3.1 抑菌活性

由表3 可知，半邊蓮提取物溶液對6 種供試菌均有一定的抑制作用，提取液濃度在1.0 g/mL 時對各菌的抑菌作用明顯大于0.1 g/mL;提取物對各供試菌的抑制效果不同，其強(qiáng)弱順序為:大腸桿菌＞變形桿菌＞金黃色葡萄球菌＞枯草芽孢桿菌＞青霉菌＞酵母菌。黃酮類化合物屬于酚類衍生物，可以通過破壞細(xì)胞壁以及細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的完整性，導(dǎo)致微生物細(xì)胞釋放胞內(nèi)成分，引起膜的電子傳遞、ATP 活性等功能障礙［8］，從而抑制微生物的生長。

表2 正交實驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal experiment

表3 半邊蓮總黃酮提取物對各供試菌的抑菌效果Table 3 The bacteriostatic effect of total flavonoids from L.chinensis on the tested microbateria

2.3.2 半邊蓮總黃酮的最低抑菌濃度

由表4 可知，半邊蓮黃酮提取物對各供試菌的抑制作用隨著濃度的增大而增加;樣品溶液為100 mg/mL 和50 mg/mL 時各供試菌株均不能生長，在25 mg/mL 時枯草芽孢桿菌少量生長，在12.5 mg/mL 時金黃色葡萄球菌少量生長，在6.25 mg/mL 時大腸桿菌與變形桿菌均可生長，故半邊蓮總黃酮提取物對大腸桿菌、變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的最低抑菌濃度分別為:12.5、12.5、25、50 mg/mL;提取物濃度為100 mg/mL 時，對青霉菌和酵母菌抑制作用均不明顯。

3 結(jié)論與討論

本研究以總黃酮提取量為技術(shù)指標(biāo)，采用熱水輔助乙醇提取法，通過單因素和正交實驗，得到了半邊蓮中總黃酮的最佳提取工藝條件為:以60%乙醇作為溶劑，料液比為1∶40(g/mL)，水浴溫度60 ℃，水浴處理時間是2.5 h。此條件下，總黃酮提取率為:1.69%。半邊蓮總黃酮提取物具有一定的抑菌活性，對大腸桿菌的抑制效果最好，其次為變形桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、青霉菌和酵母菌。在半邊蓮提取物溶液濃度為100 mg/mL 或低于100 mg/mL 時，對青霉菌和酵母菌抑制作用不明顯。

表4 半邊蓮總黃酮提取物對各供試菌的最低抑菌濃度Table 4 The MIC of total flavonoids from L.chinensis on the tested microbateria

研究中半邊蓮總黃酮提取物對大腸桿菌等革蘭氏陰性菌的抑制效果大于其他兩種革蘭氏陽性菌，此結(jié)果與徐金龍等［11］人研究南酸棗黃酮提取物的抑菌活性結(jié)果有出入，可能是黃酮類化合物在半邊蓮中存在的形式與其不同，詳盡原因還有待進(jìn)一步研究。半邊蓮屬植物品種繁多，分布廣泛，我國共有20 多種，資源相當(dāng)豐富，且半邊蓮提取物對細(xì)菌、霉菌均有抑制作用，說明半邊蓮黃酮是值得大力推廣的天然抑菌劑和保鮮劑。

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