Notch信號(hào)通路與肝癌細(xì)胞凋亡關(guān)系的研究進(jìn)展

崔普澤，胡彥建，賀旺，胡彥華

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院 普通外科，黑龍江 哈爾濱 150086；2.哈爾濱工業(yè)大學(xué)附屬哈爾濱市第一醫(yī)院 消化內(nèi)科，黑龍江 哈爾濱 150010）

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，高居世界癌癥發(fā)病率第5位和癌癥病死率第4位[1]。盡管肝癌的5年生存率已從40 年前的3%提升到目前的18%，但仍遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于全球發(fā)病率高的其他實(shí)體腫瘤，例如大腸癌、乳腺癌、前列腺癌的5年生存率分別為65%、90%、98%[2]。美國(guó)肝癌死亡人數(shù)2000 年到2016 年增加了43%，從每10萬(wàn)人死亡7.2人上升到10.3人。根據(jù)世界衛(wèi)生組織估計(jì)，2030 年將有100 多萬(wàn)患者死于肝癌[3]。提升肝癌生存率仍然是當(dāng)今緊迫的難題。多種誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的藥物和療法被證明對(duì)腫瘤治療有效，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡希望成為更有前途的肝癌治療方案。肝癌的發(fā)生和發(fā)展表現(xiàn)肝癌細(xì)胞凋亡的失調(diào)與大量細(xì)胞信號(hào)通路異常傳導(dǎo)密切相關(guān)，如PI3K/AKT/mToR[4]、Wnt/β-catenin[5]、ras/raf/MRPK[6]、NF-κB[7]、Hedgehog[8]、Notch[9]等。Notch信號(hào)通路在組織發(fā)育和生理過(guò)程中高度保守，調(diào)控細(xì)胞凋亡。包括肝癌在內(nèi)的各種肝臟疾病中，Notch信號(hào)通路均異常傳導(dǎo)[10]。Notch信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞凋亡的作用因細(xì)胞和分子環(huán)境不同，表現(xiàn)出抑制或促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[11]。本文就Notch信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞凋亡中的作用及其機(jī)制做一綜述。

1 Notch信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡中的作用

Notch信號(hào)通路進(jìn)化上高度保守，調(diào)節(jié)組織發(fā)育和內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定[12]。Notch信號(hào)通路主要包括依賴和非依賴細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CSL（C-promoter binding factor-1、CBF-1，Suppressor of hairless，Lag的合稱）的兩種Notch信號(hào)通路活化方式。依賴CSL的經(jīng)典Notch信號(hào)傳導(dǎo)通路開始于細(xì)胞膜的相互接觸，Notch信號(hào)通路發(fā)送細(xì)胞（表達(dá)果蠅體內(nèi)的Delta和Serrate及線蟲體內(nèi)的lag-2，DSL配體）膜和鄰近的接受細(xì)胞（表達(dá)Notch受體）膜接觸，啟動(dòng)Notch信號(hào)通路，信號(hào)接受細(xì)胞的Notch受體經(jīng)過(guò)金屬蛋白酶和γ-分泌酶介導(dǎo)的兩次連續(xù)切割，釋放Notch受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)（Notch intracellular domain，NICD），NICD易位至細(xì)胞核內(nèi)，與細(xì)胞核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子CSL結(jié)合，從而激活Notch信號(hào)通路的靶基因HES和HEY家族，調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞凋亡。非依賴CSL的Notch信號(hào)通路NICD并不易位至細(xì)胞核內(nèi)，而是在胞漿中與其他信號(hào)通路（如β-catenin、PI3K/AKT等）蛋白相互作用，調(diào)控目標(biāo)蛋白的表達(dá)，影響細(xì)胞的凋亡。細(xì)胞凋亡主要包括外源性途徑和內(nèi)源性途徑。外源性途徑又稱為死亡受體途徑，通過(guò)跨膜受體介導(dǎo)，活化天冬氨酸蛋白水解酶caspase家族，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。內(nèi)源性途徑又稱線粒體途徑，刺激直接產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)信號(hào)，引起線粒體膜結(jié)構(gòu)改變，釋放促凋亡物質(zhì)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[13]。依賴CSL的經(jīng)典Notch信號(hào)通過(guò)Hes1-PTEN-AKT-mToR途徑調(diào)控細(xì)胞凋亡[14]，而非依賴CSL的Notch信號(hào)通路則通過(guò)NICD-mToR2-AKT-mToR介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。介于細(xì)胞類型不同和相關(guān)信號(hào)通路之間串?dāng)_的影響，Notch信號(hào)通路在同一腫瘤不同的細(xì)胞亞型和不同的腫瘤細(xì)胞系中表現(xiàn)出抑制和促進(jìn)凋亡的不同作用[10，16]。Yoon等[17]通過(guò)轉(zhuǎn)染的方法，使唾腺癌細(xì)胞過(guò)度表達(dá)Notch信號(hào)通路，結(jié)果細(xì)胞凋亡率明顯下降，上調(diào)Notch信號(hào)通路抑制唾腺癌細(xì)胞凋亡。Wang等[18]應(yīng)用小分子干擾RNA和γ-分泌酶抑制劑處理胰腺癌細(xì)胞，下調(diào)Notch信號(hào)通路，結(jié)果細(xì)胞凋亡率明顯增加，從而間接證實(shí)了活化的Notch信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡。此外，NICD移位進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活Notch信號(hào)通路靶基因CDK2、VEGF和MMPS表達(dá)，抑制細(xì)胞凋亡[19-20]。Notch信號(hào)通路除表現(xiàn)抗凋亡作用，還表現(xiàn)促凋亡作用，例如在小鼠表皮和成年小鼠角膜上皮的研究中，Notch信號(hào)通路通過(guò)抑制β-catenin信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞凋亡[21]。Notch信號(hào)通路對(duì)于同一細(xì)胞系的不同亞型亦表現(xiàn)出雙重的凋亡作用，Notch信號(hào)通路激活后保護(hù)1 型β細(xì)胞免于凋亡，當(dāng)應(yīng)用γ-secretase抑制劑（gamma secretase inhibitor，GSI）處理細(xì)胞，下調(diào)Notch信號(hào)通路后，1 型β細(xì)胞凋亡顯著增加，但對(duì)于2 型β細(xì)胞，采用GSI處理卻上調(diào)抗凋亡基因Bcl-2，抑制細(xì)胞凋亡[22]。Notch信號(hào)通路在細(xì)胞凋亡中表現(xiàn)的抑制和促進(jìn)凋亡作用，主要依靠不同的組織類型和其與其他細(xì)胞信號(hào)通路間的“串話”。

2 Notch信號(hào)通路在肝癌細(xì)胞凋亡中的作用

肝癌的發(fā)生發(fā)展與Notch信號(hào)通路的異常傳導(dǎo)密切相關(guān)，因受肝細(xì)胞和肝臟成分細(xì)胞（如膽管細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、星狀細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和巨噬細(xì)胞等）相互作用影響，不同肝癌組織中Notch信號(hào)通路呈上調(diào)或者下調(diào)的不同表達(dá)結(jié)果。Yang等[23]報(bào)道肝癌組織中Notch-1、Notch-3和Notch-4受體表達(dá)水平明顯高于癌旁和正常肝臟組織，在肝癌和腫瘤周圍組織之間未發(fā)現(xiàn)Notch-2 表達(dá)差異，Notch-3 的表達(dá)增加與肝癌的血管浸潤(rùn)性密切相關(guān)。Ahn等[24]研究取得了與Yang相同的Notch受體過(guò)表達(dá)結(jié)果，即肝癌組織中Notch-1、Notch-3和Notch-4高表達(dá)，同時(shí)報(bào)道了Notch-1高表達(dá)的患者預(yù)后具有高復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。Hu等[25]報(bào)道與正常肝組織相比，Notch-3在HCC組織中高表達(dá)，且Notch-3高表達(dá)的腫瘤體積更大、腫瘤更早復(fù)發(fā)、腫瘤分期更晚和總生存期更短的特點(diǎn)。此外，除肝癌組織外，研究顯示HepG2 肝癌細(xì)胞系Notch-3受體、Jagged1和Deltal配體高表達(dá)[26]。然而，也有研究報(bào)道肝癌組織中Notch信號(hào)通路受體蛋白相對(duì)于正常肝組織低表達(dá)的結(jié)果。Sui等[27]收集肝癌組織樣本30例，通過(guò)qRT-PCR分析，發(fā)現(xiàn)正常肝組織中Notch-1 mRNA的表達(dá)水平為（10.3±3.1），而肝癌組織中Notch-1 mRNA的表達(dá)水平為（5.1±2.1），肝癌細(xì)胞Notch-1 mRNA明顯低于肝正常細(xì)胞，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。蛋白質(zhì)免疫印跡分析，顯示與正常肝組織相比，Notch-1蛋白的表達(dá)在肝癌組織中顯著降低（P＜0.001），同時(shí)還發(fā)現(xiàn)與正常肝臟組織相比，肝癌細(xì)胞中NICD蛋白的表達(dá)顯著降低（P＜0.001）。Notch信號(hào)通路在肝癌組織胞中的“對(duì)向”差異性，促使其在肝癌細(xì)胞凋亡中呈現(xiàn)雙向作用。

2.1 下調(diào)Notch信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡

Notch信號(hào)通路上調(diào)的肝癌細(xì)胞，Notch信號(hào)通路抑制細(xì)胞凋亡。下調(diào)Notch信號(hào)通路，解除Notch信號(hào)通路抑制肝癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵因子，打開凋亡途徑，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

下調(diào)Notch信號(hào)通過(guò)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路介導(dǎo)促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。人第10號(hào)染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源的基因（phosphatase and tensin homologue deleted on chromosome 10，PTEN），是繼p53 后又一個(gè)與多腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的抑癌基因，其編碼具有蛋白磷酸酶和脂質(zhì)磷酸酶雙重特異磷酸酶活性的蛋白，能使磷酸化的Tyr、Ser、Thr都去磷酸化；PTEN通過(guò)去磷酸化參與細(xì)胞調(diào)控。磷酸化和去磷酸化是調(diào)節(jié)細(xì)胞活動(dòng)的重要方式，許多癌基因的產(chǎn)物都是通過(guò)磷酸化而刺激細(xì)胞生長(zhǎng)[28]。PTEN主要抑癌機(jī)制是PI3K/AKT通路的主要負(fù)調(diào)控因子。PTEN可以使磷脂酰肌醇3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）催化產(chǎn)物第二信使磷脂酰肌醇3，4，5-三磷酸（PIP3）第三位的磷酸基團(tuán)去磷酸化，從而對(duì)能促進(jìn)細(xì)胞增殖生長(zhǎng)的PI3K/Akt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑起到負(fù)調(diào)控作用。Tian等[29]在肝癌細(xì)胞系Huh-7 中過(guò)表達(dá)MicroRNA-760，下調(diào)Notch信號(hào)通路，增加PTEN蛋白表達(dá)，降低PI3K/AKT活性，結(jié)果凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3蛋白表達(dá)水平增加，肝癌細(xì)胞凋亡增加。Yang等[30]應(yīng)用小分子干擾RNA處理HepG2細(xì)胞，抑制Notch1受體蛋白的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)Akt磷酸化的水平隨Notch1 受體蛋白表達(dá)的下降而降低，流式細(xì)胞結(jié)果顯示HepG2細(xì)胞凋亡明顯增加。下調(diào)Notch信號(hào)通路，解除HES對(duì)PTEN的抑制，上調(diào)PTEN蛋白的表達(dá)，從而抑制PI3K/AKT信號(hào)通路表達(dá)，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。

Notch信號(hào)通路通過(guò)p53 介導(dǎo)調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡，p53是重要的腫瘤抑制基因，p53基因在正常情況下對(duì)細(xì)胞分裂起著減慢或監(jiān)視的作用。p53 根據(jù)細(xì)胞DNA變異的程度而發(fā)揮不同作用，如果變異較小，p53 促使細(xì)胞自我修復(fù)，若DNA變異較大，p53誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。研究表明，Notch信號(hào)通路通過(guò)INK4a/ARF（inhibitor of CDK4/alternative of reading frame）的介導(dǎo)，干擾MDM2（murine double minute2）對(duì)p53的降解作用，下調(diào)Notch信號(hào)通路促進(jìn)INK4a/ARF表達(dá)，減少M(fèi)DM2對(duì)p53的降解作用，上調(diào)p53表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[31]。Wang等[32]過(guò)表達(dá)RBP-Jinteracting and tubulin-associated（RITA），抑制Notch信號(hào)通路靶基因的轉(zhuǎn)錄，下調(diào)Notch信號(hào)通路靶基因HES1表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)RITA過(guò)表達(dá)增加p53的蛋白表達(dá)，誘導(dǎo)SMMC7721和HepG2細(xì)胞凋亡。Giovannini等[33]研究報(bào)道，沉默HepG2、SNU398和Hep3B細(xì)胞Notch3受體表達(dá)，導(dǎo)致p53上調(diào)，從而調(diào)控細(xì)胞周期蛋白G1表達(dá)以及miR-221和MDM2的前饋電路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

下調(diào)Notch信號(hào)通路通過(guò)內(nèi)、外源途徑調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡。內(nèi)源途徑又稱線粒體途徑，主要是通過(guò)Bcl-2 和核蛋白改變線粒體膜結(jié)構(gòu)。Bcl-2 家族主要包括：抗凋亡作用的Bcl-2，Bcl-xl，Mcl-L及Bcl-w等和促凋亡作用的Bax、Bak及Bok等[34]。Zhang等[35]研究報(bào)道，秋水仙堿（Silybin，SIL）下調(diào)肝癌細(xì)胞Notch信號(hào)通路NICD，RBP-Jκ和Hes1蛋白表達(dá)，下調(diào)凋亡通路相關(guān)蛋白Bcl-2 表達(dá)，并上調(diào)Bax表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Kunnimalaiyaan等[36]報(bào)道，在肝癌細(xì)胞株（HepG2、Hep3B和SK-Hep-1）中下調(diào)Notch信號(hào)通路表達(dá)，靶蛋白HES-1表達(dá)下降，細(xì)胞凋亡增加，其機(jī)制是下調(diào)Notch信號(hào)通路抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)，誘導(dǎo)凋亡小體形成。Ke等[37]通過(guò)藥物TQ（thymoquinome）處理肝癌細(xì)胞，下調(diào)Notch信號(hào)通路，取得的結(jié)果與Kunnimalaiyaan等[36]報(bào)道的一致，下調(diào)Notch信號(hào)通路通過(guò)內(nèi)源途徑調(diào)控肝癌細(xì)胞的凋亡，抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)減少，凋亡蛋白Bax表達(dá)增加，肝癌細(xì)胞凋亡增加。外源性途徑又稱死亡受體途徑，主要由膜上死亡受體介導(dǎo)，導(dǎo)致caspase-8活化，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。Huang等[38]研究發(fā)現(xiàn)，siRNA抑制Notch1的表達(dá)，有效的上調(diào)caspase-8表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞H22的凋亡。

下調(diào)Notch信號(hào)通路配體Jagged1 表達(dá)，減少Notch信號(hào)通路激活，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。Ren等[39]報(bào)道，在肝癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-199a-3p，有效地增加YAP1（yes associated protein 1）的表達(dá)，而YAP1直接抑制配體Jagged1表達(dá)，下調(diào)Notch信號(hào)通路激活，誘導(dǎo)肝癌凋亡。

下調(diào)動(dòng)物體內(nèi)細(xì)胞Notch信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。Zeyada等[40]應(yīng)用氯硝柳胺聚合物膠束處理肝癌小鼠，蛋白免疫印跡結(jié)果顯示Notch1受體和靶基因HES1表達(dá)顯著下降，凋亡執(zhí)行蛋白caspase-3的基因和蛋白表達(dá)水平增加，體內(nèi)抑制Notch信號(hào)通路，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。Xiang等[41]在異種移植荷瘤肝癌裸鼠中，應(yīng)用藥物下調(diào)Notch信號(hào)通路表達(dá)，有效抑制腫瘤生長(zhǎng)并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。

Notch信號(hào)通路通過(guò)PTEN/PI3K/AKT信號(hào)通路、p53介導(dǎo)，或是調(diào)控Bcl-2和Bax凋亡蛋白表達(dá)等機(jī)制，誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，但是具體完整機(jī)制尚需要進(jìn)一步的研究。

2.2 上調(diào)Notch信號(hào)通路誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡

Notch信號(hào)通路促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用取決于腫瘤細(xì)胞的背景，除下調(diào)Notch信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡外，上調(diào)Notch信號(hào)通路亦可以促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。Sui等[27]研究報(bào)道，Notch1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2和Hep3B細(xì)胞，上調(diào)Notch信號(hào)通路，帶有Notch1質(zhì)粒的陽(yáng)性細(xì)胞凋亡率明顯高于對(duì)照（P＜0.001），上調(diào)Notch信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，其作用機(jī)制是轉(zhuǎn)染Notch1 質(zhì)粒顯著激活了2 種細(xì)胞系中JNK的磷酸化。JNK可以使位于c-Jun蛋白N端的氨基酸殘基63和73磷酸化，上調(diào)caspase-3和Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。此外，Wang等[42]報(bào)道了上調(diào)Notch信號(hào)通路，激活外源性細(xì)胞凋亡途徑，促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的研究。研究人員將NICD轉(zhuǎn)染到肝癌SMMC7721 細(xì)胞中，結(jié)果轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h、48 h和72 h的細(xì)胞凋亡率呈現(xiàn)NICD劑量依賴性升高，其機(jī)制是上調(diào)的Notch信號(hào)通路，增加肝癌細(xì)胞p53表達(dá)，p53 的上調(diào)增加外源性細(xì)胞凋亡途徑TRAIL/DR5的表達(dá)，促進(jìn)TRAIL誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。已有研究表明，TRAIL觸發(fā)的細(xì)胞凋亡是通過(guò)與死亡受體（DR4和DR5）結(jié)合并激活死亡受體來(lái)實(shí)現(xiàn)的，死亡受體屬于腫瘤壞死因子受體基因超家族；死亡受體位于細(xì)胞表面，通過(guò)與配體TRAIL結(jié)合而變得三聚化，然后通過(guò)胱天蛋白酶級(jí)聯(lián)反應(yīng)快速激活來(lái)傳遞凋亡信號(hào)[43]。Qi等[44]激活Notch信號(hào)通路在體內(nèi)體外均能誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制是上調(diào)Notch信號(hào)通路增加p53的表達(dá)，高表達(dá)的p53可以通過(guò)上調(diào)Bax和下調(diào)Bcl-2表達(dá)水平促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡。

上調(diào)Notch信號(hào)通路促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡，下調(diào)Notch信號(hào)通路亦可以誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞凋亡。Notch信號(hào)通路對(duì)肝癌細(xì)胞的雙向作用，體現(xiàn)出Notch信號(hào)通路的傳導(dǎo)簡(jiǎn)單性和作用復(fù)雜性的特點(diǎn)。進(jìn)一步對(duì)Notch信號(hào)通路與其他細(xì)胞信號(hào)的“串話”研究，可能是解開Notch信號(hào)通路雙向調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵所在。

3 小結(jié)與展望

肝癌細(xì)胞凋亡是一個(gè)復(fù)雜的生理過(guò)程，需要大量的信號(hào)通路共同作用。Notch信號(hào)通路與其他信號(hào)通路“串話”，表現(xiàn)出既抑制又促進(jìn)肝癌細(xì)胞凋亡的雙向調(diào)控作用，這與肝癌細(xì)胞異質(zhì)性密切相關(guān)，但詳細(xì)的分子機(jī)制尚需進(jìn)一步研究。尋找Notch信號(hào)通路雙向調(diào)控肝癌細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵點(diǎn)，打開Notch信號(hào)通路的細(xì)胞信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，將為肝癌的靶向治療提供更廣闊的應(yīng)用前景。