Calpain 10在糖尿病腎病中的研究進(jìn)展*

吳 進(jìn) 鄭艷輝 吳雪楠

1 南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇省南京市 210000； 2 南京中醫(yī)藥大學(xué)附屬南京中醫(yī)院腎病科

糖尿病腎病是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的慢性并發(fā)癥之一,也是導(dǎo)致糖尿病患者死亡的主要原因。截至2017年,全世界有4.51億糖尿病患者,成人糖尿病患病率為8.4%,預(yù)計(jì)到2045年,患者人數(shù)將增加到6.93億,患病率將升至9.9%[1]。在我國,18歲及以上人群糖尿病患病率為10.4%,有20%～40%的糖尿病患者合并糖尿病腎病[2]，由糖尿病腎病導(dǎo)致的終末期腎病(ESRD)在我國占16.4%[3], 并呈現(xiàn)逐年增長趨勢。糖尿病腎病的主要表現(xiàn)是持續(xù)性白蛋白尿、高血壓、進(jìn)行性腎功能受損，如病情無法及時獲得有效控制，隨著病情進(jìn)一步惡化，患者會出現(xiàn)高血壓、蛋白尿、水腫等癥狀，甚至可引起尿毒癥、腎功能不全等，威脅患者生命[4]。目前糖尿病腎病已經(jīng)成為全球慢性腎臟病(Chronic kidney disease, CKD)和終末期腎病的主要原因[5]。目前糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制并未闡明,現(xiàn)有研究數(shù)據(jù)表明,血液動力學(xué)因素、糖代謝紊亂、遺傳因素、組織缺氧及炎性細(xì)胞浸潤等均能引起糖尿病腎病[6]?，F(xiàn)目前對于糖尿病腎病的治療主要是降糖類藥物、選擇性內(nèi)皮素(ETA)受體拮抗劑、鹽皮質(zhì)激素受體拮抗劑、磷酸二酯酶抑制劑、抗炎類藥物、抗血小板藥物、單克隆抗體治療[7]。Calpain 10通過在腎組織的異常表達(dá)參與糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制，為糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的研究提供了新靶點(diǎn)。

1 Calpain 10的分子特點(diǎn)、生物學(xué)特性及蛋白表達(dá)

1.1 Calpain 10的分子特點(diǎn)和生物學(xué)特性 Calpain 10是Calpains(鈣蛋白酶)家族的一員，是一種廣泛表達(dá)的線粒體和胞漿Ca2+調(diào)節(jié)的半胱氨酸蛋白酶[8]，Calpains是Ca2+激活的非溶酶體半胱氨酸蛋白酶[9]，定位于胞漿和線粒體，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡和壞死[10],參與了疾病的發(fā)展，如2型糖尿病、阿爾茨海默病、心肌梗死、急性腎損傷和調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡[11-14]。2006年，Arrington DD等[8]首次發(fā)現(xiàn)線粒體內(nèi)存在Calpain 10，利用兔線粒體，Calpain 10在所有的線粒體室中都被發(fā)現(xiàn)，大部分活性在線粒體基。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，N端的前15個氨基酸作為線粒體靶向序列。Calpain 10有8個剪接變異體，大小15～75kDA不等，并且用酶譜顯示75、56和50kDA大小的Calpain 10的變異體在線粒體中。Calpain 10底物中含有大量脯氨酸、谷氨酸、絲氨酸的蛋白質(zhì)，并且蘇氨酸殘留體被鈣蛋白酶快速降解[15-17]。

1.2 Calpain 10的蛋白表達(dá) Calpain 10的蛋白表達(dá)在多個領(lǐng)域都有研究，可能參與多種疾病狀態(tài),有廣泛意義。迄今為止，Calpain 10與線粒體功能障礙、細(xì)胞凋亡、GLUT4囊泡移位、胰島素β細(xì)胞胞吐、白內(nèi)障、高甘油三酯血癥有關(guān),并且與2型糖尿病有遺傳關(guān)系[18]，Calpain 10對糖尿病易感基因的全基因組連鎖掃描顯示Calpain 10與2型糖尿病的風(fēng)險增加有關(guān)[19]。近年來，有研究表明Calpain 10在腎臟組織也有變表達(dá)，Calpain 10 蛋白在衰老或疾病期間的表達(dá)減少會導(dǎo)致腎細(xì)胞死亡、動態(tài)功能和/或增加腎臟對損傷的易感性。Marisa D等人[18]實(shí)驗(yàn)中利用腎功能不全的腎組織樣本來檢測老年雄性大鼠中Calpain 10的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)大鼠腎臟Calpain 10的蛋白表達(dá)在開始19個月時下降，在24個月時進(jìn)一步下降，表明Calpain 10隨著時間的增加而下降，同時檢測腎SGLT1(腎小管上皮標(biāo)志物)和podocin(腎小球標(biāo)志物)的蛋白表達(dá)，結(jié)果顯示SGLT1和podocin也隨時間的增加不斷下降。為了研究Calpain 10在人腎臟中的表達(dá)，Marisa D等人[18]檢測了不同年齡段人腎臟樣本Calpain 10水平，21～77歲人類女性腎臟樣本中Calpain 10蛋白表達(dá)呈線性下降；在38～77歲男性腎臟腎組織中，Calpain 10表達(dá)也有類似下降，這種人類男性和女性腎臟Calpain10蛋白表達(dá)丟失，是Calpain 10表達(dá)的特異性缺失造成的，表明Calpain10是腎功能所必需的，是腎衰老的標(biāo)志物。Calpain10電子傳遞鏈蛋白，Calpain10的過度表達(dá)或敲除導(dǎo)致線粒體功能障礙和腎細(xì)胞受損和凋亡[10],雖然Calpain 10在腎臟老化中發(fā)揮了重要作用，腎臟的大小和功能隨著老化而退化，但是其具體機(jī)制目前尚未有人報道，尚不清楚[20]。

2 Calpain 10與糖尿病腎病

糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多樣，至今仍不明確，隨著糖尿病腎病腎臟組織特異性蛋白分子的發(fā)現(xiàn)，為糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制的研究提供了新方向。Calpain 10作為Calpains家族中一個亞型，被發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病腎臟組織中有異常表達(dá)。但目前關(guān)于Calpain 10在糖尿病腎病腎臟中異常表達(dá)以及異常表達(dá)加劇糖尿病腎病腎損傷機(jī)制的研究和報道甚少，有研究發(fā)現(xiàn)Calpain 10在糖尿病腎病腎組織的表達(dá)與年齡有關(guān)，Marisa D等[18]研究表明隨著熱量限制Calpain 10減弱的老年人、小鼠、大鼠，Calpain 10蛋白和RNA表達(dá)降低，并與腎功能的下降有關(guān)。Covington MD等[21]研究表明慢性高糖降低了糖尿病腎病腎組織中的Calpain 10，使Calpain 10蛋白和mRNA在體內(nèi)外均隨慢性葡萄糖升高而降低，從而導(dǎo)致腎細(xì)胞死亡和糖尿病腎病腎損傷。通過建立腎小管細(xì)胞(RPTC)體外模型和Calpain 10基因敲除后大鼠體內(nèi)腎臟模型，來確定Calpain 10在糖尿病腎病腎功能障礙作用，結(jié)果：(1)慢性高糖降低了RPTC中Calpain 10的mRNA表達(dá)，慢性高糖暴露的RPTC線粒體功能下降，從而引起RPTC的凋亡；(2)大鼠腎Calpain 10基因敲除后肌酐、Caspase 3裂解增加，導(dǎo)致大鼠腎功能不全。結(jié)果證明Calpain 10是腎功能所必需的，腎Calpain 10的丟失是引起腎細(xì)胞損傷的關(guān)鍵。

然而在最新研究中，Wang Tao等人[23]發(fā)現(xiàn)Calpain 10在糖尿病腎病大鼠腎臟和永生的小鼠足細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，高水平的Calpain 10導(dǎo)致大鼠、小鼠腎功能不全、腎組織破壞、足細(xì)胞凋亡，Calpain 10表達(dá)增加降低了腎小球足細(xì)胞內(nèi)nephrin蛋白的表達(dá)，通過敲除大鼠、小鼠腎臟中Calpain 10基因可以上調(diào)nephrin保護(hù)足細(xì)胞。足細(xì)胞位于腎臟的腎小球毛細(xì)血管壁中形成最后一層，它們與腎小球基底膜和腎小球內(nèi)皮細(xì)胞一起構(gòu)成了腎小球?yàn)V過屏障，可以使水和小分子通過，并且在健康個體中，可以阻止白蛋白和其他關(guān)鍵蛋白質(zhì)通過，對于維持健康腎臟中的腎小球功能和完整性至關(guān)重要。足細(xì)胞是腎小球?yàn)V過膜的主要細(xì)胞，其破壞是糖尿病腎病早期尿蛋白的主要原因[23]。為了進(jìn)一步證實(shí)Calpain 10在足細(xì)胞損傷中的作用，Wang Tao等人用小siRNA抑制其在足細(xì)胞中的表達(dá)，并用CCK-8法分析其活性，敲除Calpain 10后，結(jié)果顯示足細(xì)胞的活力顯著高于健康狀態(tài)下的足細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病大鼠Calpain 10水平與腎功能呈負(fù)相關(guān)，然而糖尿病腎病大鼠腎功能不全出現(xiàn)的時間比Calpain 10上調(diào)晚，Wang Tao等猜測可能是由于腎臟代償機(jī)制引起的[22]。

也有研究表明Calpain 10與細(xì)胞分化有關(guān)，隨著年齡的增長，這種分化會逐漸減少。研究發(fā)現(xiàn)[24]Calpain 10在成熟大鼠中表達(dá)很高，這可能與分化是的細(xì)胞重塑有關(guān)，然而大多數(shù)腎細(xì)胞(包括足細(xì)胞)屬于終末分化的細(xì)胞，由此猜測這也可能是導(dǎo)致Calpain 10在腎組織中過表達(dá)的原因之一。Matthew A等[10]研究發(fā)現(xiàn)大鼠糖尿病腎病模型，10周后大鼠腎臟Calpain 10蛋白和mRNA均下降，對腎Calpain 1和2無影響，Calpain 10 siRNA的敲除導(dǎo)致大鼠腎Calpain 10凋亡，數(shù)據(jù)表明，糖尿病導(dǎo)致腎Calpain 10 mRNA和蛋白質(zhì)減少，細(xì)胞凋亡，腎功能下降。

綜上所述，Calpain 10表達(dá)增加，降低腎小球足細(xì)胞內(nèi)的nephrin蛋白表達(dá)，提示Calpain 10參與了足細(xì)胞損傷，體內(nèi)和體外足細(xì)胞內(nèi)的nephrin水平顯著降低，表明足細(xì)胞損傷、功能障礙和腎功能不全是由Calpain 10上調(diào)引起的。

3 小結(jié)

Calpain 10在糖尿病腎病腎損傷的具體機(jī)制尚不清楚，需要進(jìn)一步研究。目前研究認(rèn)為Calpain 10作為糖尿病腎病腎損傷的標(biāo)志物之一，在糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制、評價藥物療效和判斷預(yù)后方面可能發(fā)揮重要的作用。鑒于上述研究表明，Calpain 10在糖尿病腎病、特別是足細(xì)胞中的表達(dá)，無論是Calpain 10蛋白的過表達(dá)還是缺失，均表明Calpain 10參與糖尿病腎病的發(fā)病，提示Calpain 10有可能成為糖尿病腎病治療的靶目標(biāo)。但Calpain 10除了通過上調(diào)nephrin蛋白導(dǎo)致足細(xì)胞損傷，是否通過其他特異性分子蛋白、炎癥因子損傷腎小球其他細(xì)胞參與糖尿病腎病腎損傷尚未報道，因此Calpain 10的價值有待進(jìn)一步研究。