中藥單體成分抗白念珠菌實(shí)驗(yàn)的研究進(jìn)展

謝凌峰， 賀莉雅， 王獻(xiàn)哲， 嚴(yán)佳寶， 袁娟娜， 范瑞強(qiáng)， 謝婷

1.廣東省中醫(yī)院皮膚科，廣東 廣州 510120；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)，廣東 廣州 510006

白念珠菌(Candidaalbicans)是一種臨床常見的條件致病菌，近年來(lái)因?yàn)榧に?、生物制劑的廣泛應(yīng)用，以及癌癥、HIV和糖尿病發(fā)病率升高等，患者免疫力下降，白念珠菌發(fā)病率不斷升高[1-3]。而隨著抗真菌藥物在臨床的大量使用，白念珠菌臨床耐藥性的問(wèn)題也日漸突出，現(xiàn)在常見的抗真菌藥物面臨耐藥、治療周期長(zhǎng)和肝腎毒性等問(wèn)題[4]。中藥單體成分有良好的抗真菌作用，且具有毒副作用小、來(lái)源廣泛、較少出現(xiàn)耐藥等優(yōu)點(diǎn)，可以在抗白念珠菌中發(fā)揮重要作用。

中醫(yī)認(rèn)為白念珠菌感染引起的疾病有外因和內(nèi)因兩種，外因由寒濕襲表、濕郁蘊(yùn)熱、濕熱阻滯肌表所致；內(nèi)因由脾腎虧虛、內(nèi)生濕濁、蘊(yùn)而生蟲所致。臨床常用具清熱、祛濕、殺蟲、補(bǔ)益脾腎等功效的藥物。中藥單體成分是通過(guò)精油提取、乙醇提取、酸水溶液提取、超聲提取等方法，從中藥中提取得到的主要有效成分之一。本文綜述中藥單體成分抗白念珠菌實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)展。

1 清熱藥

1.1 小檗堿

黃連、黃柏具有清熱燥濕的功效，小檗堿是其主要有效成分之一，因提取時(shí)常用鹽酸提取，又叫鹽酸小檗堿，具有廣泛的抗菌作用。早期的體外實(shí)驗(yàn)顯示鹽酸小檗堿對(duì)白念珠菌浮游菌的MIC值平均為32 μg/mL[5]。白念珠菌的毒力與其形成菌絲、細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化以及細(xì)胞壁完整性密切相關(guān)，楊玉等[6]發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿在64～512 μg/mL時(shí)可以降低白念珠菌菌絲代謝；在256～512 μg/mL時(shí)可以抑制白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化；512 μg/mL以上則可以明顯破壞白念珠菌細(xì)胞壁完整性；通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量技術(shù)發(fā)現(xiàn)，小檗堿可以下調(diào)白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化相關(guān)基因ECE1的表達(dá)水平2.72倍；還可以降低β-葡聚糖合成酶調(diào)控相關(guān)基因FKS1和FKS2的表達(dá)，暴露β-葡聚糖進(jìn)而破壞細(xì)胞壁完整性。雍江堰等[7]發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿和氟康唑?qū)σ种瓢啄钪榫哂袇f(xié)同作用，通過(guò)免疫熒光標(biāo)記法、流式細(xì)胞技術(shù)觀測(cè)白念珠菌Ca2+內(nèi)流情況，發(fā)現(xiàn)聯(lián)用組、小檗堿組可以觀測(cè)到Ca2+內(nèi)流現(xiàn)象，而氟康唑組、空白組無(wú)該現(xiàn)象，分析小檗堿抗白念機(jī)制可能與鹽酸小檗堿破壞白念珠菌的細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)有關(guān);進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR技術(shù)，檢測(cè)發(fā)現(xiàn)聯(lián)用組菌株的基因YVC1表達(dá)量比鹽酸小檗堿組和氟康唑組分別高1.62倍、6.74倍，聯(lián)用組和鹽酸小檗堿組菌株的鈣泵相關(guān)基因PMC1表達(dá)下調(diào)，而氟康唑組表達(dá)上調(diào)，提示其協(xié)同機(jī)制與影響基因YVC1、PMC1的表達(dá)相關(guān)。

1.2 黃芩苷

黃芩具有清熱燥濕的功效。黃芩苷是源于黃芩的黃酮類化合物，常用水提法提取，對(duì)多種細(xì)菌、真菌、病毒都有抑制作用。早期的研究按照M27-A方案測(cè)定黃芩苷對(duì)白念珠菌MIC為1 mg/mL[8]。XTT法檢測(cè)黃芩苷對(duì)白念珠菌生物膜活性影響，結(jié)果顯示黃芩苷在8 mg/mL時(shí)可以使白念生物膜活性和生物量分別減少(90.6±5.2)%和(90.3±2.6)%[9]。采用流式細(xì)胞技術(shù)檢測(cè)出黃芩苷可以提高白念珠菌浮游菌的凋亡率，利用同位素標(biāo)記法測(cè)定前體3H-UdR、3H-TdR和3H-leucine，可發(fā)現(xiàn)白念珠菌浮游菌對(duì)這三種前體的攝取效率下降，提示其DNA、RNA和蛋白質(zhì)合成下降，進(jìn)一步測(cè)定其琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase, SDH)活性，發(fā)現(xiàn)黃芩苷誘導(dǎo)白念珠菌浮游菌凋亡機(jī)制可能與降低其活性有關(guān)[10]。有實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)加入黃芩苷后白念珠菌生物膜的凋亡率升高，其機(jī)制與活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)升高、線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)下降、細(xì)胞色素C由線粒體釋放入細(xì)胞質(zhì)有關(guān)，進(jìn)一步分析其中Ras-cAMP-PKA通路相關(guān)基因的表達(dá)水平，結(jié)果顯示RAS1、TPK1表達(dá)上升，CAP1、PDE2表達(dá)下降[11]。黃芩苷與氟康唑聯(lián)用抗白念珠菌浮游菌的FICI均值為0.41之間，對(duì)白念珠菌生物膜形成的FICI介于0.16～0.5之間，黃芩苷聯(lián)合氟康唑使黏附相關(guān)基因ALS1、ALS3、EAP1、SUN41和CSH1的表達(dá)分別下調(diào)6%、51%、24%、13%和39%[12]。

1.3 苦參堿

苦參具有清熱燥濕、殺蟲的功效；山豆根具有清熱解毒的功效，通過(guò)醇提法和酸提法從苦參、山豆根提取的中藥單體成分苦參堿是其主要活性成分之一，具有多種藥理作用。SHAO等[13]通過(guò)微量稀釋法測(cè)定苦參堿MIC80為1 mg/mL，苦參堿與氟康唑聯(lián)用具有協(xié)同作用(FICI=0.197)；通過(guò)Spider培養(yǎng)基培養(yǎng)，觀察白念珠菌菌絲生長(zhǎng),發(fā)現(xiàn)1 mg/mL苦參堿可以抑制白念珠菌菌絲生長(zhǎng)，進(jìn)一步通過(guò)qRT-PCR技術(shù)，發(fā)現(xiàn)苦參堿可以使菌絲形成相關(guān)基因ALS3、SUN41和PBS2下調(diào)29%、45%和61%。

1.4 穿心蓮內(nèi)酯

穿心蓮內(nèi)酯是從清熱解毒類中藥穿心蓮中提取的二萜內(nèi)酯類化合物，具有消炎抗菌、抗病毒、免疫調(diào)節(jié)等多種作用。穿心蓮內(nèi)酯可以抑制黏附基因ALS3、EAP1表達(dá)水平，從而抑制白念珠菌早期(2 h)的黏附作用，但對(duì)基因ALS1的表達(dá)水平具有促進(jìn)作用[14]。施高翔等[15]研究穿心蓮內(nèi)酯對(duì)白念珠菌生物膜分散的影響，結(jié)果顯示穿心蓮內(nèi)酯在250～1 000 μg/mL能劑量依賴性誘導(dǎo)白念珠菌生物膜分散，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，穿心蓮內(nèi)酯可以提高促分散基因HSP90表達(dá)，同時(shí)抑制抗分散基因UME6表達(dá)，雖然在該研究中另一個(gè)促分散基因PES1表達(dá)受到抑制，但穿心蓮內(nèi)酯總體發(fā)揮促白念珠菌生物膜分散的效應(yīng)。

2 祛濕藥

2.1 漢防己甲素

粉防己又叫漢防己，是防己科植物，具有祛濕祛風(fēng)的作用。漢防己甲素是來(lái)自于粉防己根部的生物堿，具有廣泛的藥理活性。在體外實(shí)驗(yàn)中，漢防己甲素對(duì)氟康唑抗白念珠菌生物膜的最初期(0 h)、早期(4 h)有增效作用；而中期(24 h)、成熟期(48 h)無(wú)增效活性[16]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)漢防己甲素在91 mg/kg時(shí)對(duì)系統(tǒng)性白念珠菌感染小鼠具有治療作用，其機(jī)制與調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫有關(guān)[17]。漢防己甲素與氟康唑在抑制播散性小鼠模型中白念珠菌感染具有協(xié)同作用(FICI<0.05)，且在CDR1/CDR2、MDR1過(guò)表達(dá)的菌株中，兩者協(xié)同作用表現(xiàn)更強(qiáng)，提示其抗耐藥機(jī)制可能與白念珠菌轉(zhuǎn)運(yùn)功能有關(guān)[18]。

2.2 土槿乙酸

中藥土槿皮具有祛濕、殺蟲的功效。土槿乙酸(PAB)是其主要有效成分之一，具有抗菌作用。土槿乙酸對(duì)白念珠菌MIC為32～128 μg/mL，且與氟康唑聯(lián)合抗白念珠菌有協(xié)同作用(FICI<0.05)[19]；對(duì)白念珠菌出芽生長(zhǎng)和生物膜形成過(guò)程有抑制作用(SMIC50為256～512 μg/mL)[20]。劉麗英等[21]通過(guò)HPLC法測(cè)定白念珠菌細(xì)胞膜中麥角淄醇含量，結(jié)果顯示PAB抑菌活性機(jī)制為抑制真菌的麥角甾醇生物合成。在槿乙酸增加油相和表面活性劑之后得到PAB-ME凝膠，體外實(shí)驗(yàn)和白念珠菌感染豚鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出抗真菌活性[22]，為臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

3 其他

3.1 大蒜素

大蒜素是百合科植物，具有抑菌、殺菌等作用，是自然界中的植物廣譜抗菌素。中醫(yī)認(rèn)為大蒜具有解毒殺蟲的作用，其有效成分是大蒜素。CLSI-M27-A3微量液基稀釋法檢測(cè)顯示大蒜素對(duì)白念珠菌的最小抑菌濃度為25 μg/mL，通過(guò)倒置顯微鏡觀察大蒜素對(duì)Spider培養(yǎng)基中白念珠菌形成的影響，同時(shí)用qRT-PCR法檢驗(yàn)其相關(guān)基因表達(dá)水平變化，發(fā)現(xiàn)大蒜素在25～100 μg/mL濃度能有效抑制白念珠菌形態(tài)轉(zhuǎn)化，其作用機(jī)制可能與相關(guān)基因HWP1、ALS1、EFG1、PDE2表達(dá)水平有關(guān)[23]。XTT法檢測(cè)顯示大蒜素對(duì)白念珠菌生物膜的SMIC80為64～256 μg/mL，且白念生物膜相關(guān)基因ALS1等表達(dá)均下調(diào)[24]。體外實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)大蒜素和制霉菌素在對(duì)白念生長(zhǎng)的抑制中有協(xié)同作用(FICI≤0.5)[25]。在白念感染免疫抑制小鼠的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，利用雙抗體夾心ELISA法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)大蒜素可以提高小鼠體液中IgG、IL-4、IL-12的水平[26]，增強(qiáng)免疫抑制小鼠的免疫功能，增加機(jī)體抗白念珠菌的能力，為臨床研究提供參考。

3.2 丁香酚

丁香具有補(bǔ)腎助陽(yáng)的功效，丁香酚是丁香提取物丁香精油的主要有效成分[27]，具有消炎、抗菌的作用。高原等[28]通過(guò)二倍稀釋法、XTT法測(cè)定丁香酚對(duì)白念珠菌的MIC為1.64 mg/mL，對(duì)白念珠菌作用24 h的SMIC50為9.80 mg/mL。丁香酚與氟康唑?qū)σ种聘∮涡桶啄钪榫袇f(xié)同作用(FICI=0.313)[29]；與兩性霉素B對(duì)抗白念珠菌具有協(xié)同作用(FICI=0.27)，其機(jī)制可能與細(xì)胞質(zhì)中細(xì)胞色素C的增加，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度上升等誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡因素相關(guān)[30]；對(duì)臨床分離的氟康唑耐藥白念珠菌具有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用，在第7～8代恢復(fù)對(duì)氟康唑敏感[31]。

3.3 白藜蘆醇等

白藜蘆醇可以誘導(dǎo)白念珠菌細(xì)胞凋亡，其機(jī)制可能與提高細(xì)胞內(nèi)ROS水平和降低MMP水平有關(guān)[32]。紫檀芪通過(guò)聚乳酸-羥基乙酸納米顆粒搭載時(shí)對(duì)白念珠菌生物膜BMIC50為16 μg/mL，其抑制生物膜活性高于游離的PTB[33]，提示搭載合適的載體后，可以增強(qiáng)有效成分對(duì)白念珠菌的抑制作用[34]。

芒果苷與氟康唑?qū)拱啄钣袇f(xié)同作用(FICI<0.2)，其機(jī)制與下調(diào)白念珠菌外排泵相關(guān)基因CDR1、MDR1的表達(dá)有關(guān)[35]。

肉桂醇對(duì)白念珠菌的MIC為160～320 μg/mL，與氟康唑具有協(xié)同作用(FICI=0.375)，進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)肉桂醇與氟康唑合用可以減少白念珠菌毒力因子磷脂酶B的釋放，機(jī)制與下調(diào)其調(diào)控基因PLB1表達(dá)有關(guān)[36]。

4 中藥單體成分抗白念珠菌機(jī)制

白念珠菌的凋亡受許多因素的影響。線粒體是為細(xì)胞供能的重要細(xì)胞器，SDH是三羧酸循環(huán)中唯一與線粒體內(nèi)膜結(jié)合的酶，可以在一定程度上反應(yīng)細(xì)胞的能量供應(yīng)能力，中藥單體成分黃芩苷加入后，白念珠菌的SDH活性下降，細(xì)胞功能受損，但目前的研究表明黃芩苷對(duì)呼吸鏈中心酶——細(xì)胞色素C氧化酶(cytochromec oxidase,COX)影響不顯著。ROS水平、MMP水平變化是白念珠菌凋亡的早期表現(xiàn)，若MMP消耗殆盡則其凋亡則無(wú)法逆轉(zhuǎn)，黃芩苷、白藜蘆醇均可使ROS水平上升，MMP水平下降[11, 32]。Ras/cAMP/PKA途徑不僅在白念珠菌的生長(zhǎng)凋亡中起關(guān)鍵調(diào)控作用，對(duì)其生物膜形成、毒力也有重要影響[37]。黃芩苷可以使Ras/cAMP/PKA途徑相關(guān)基因RAS1、TPK1表達(dá)上升，CAP1、PDE2表達(dá)下降[11]。內(nèi)環(huán)境離子穩(wěn)態(tài)對(duì)細(xì)胞活性至關(guān)重要，Ca2+-Mg2+ATP酶可以通過(guò)將細(xì)胞內(nèi)多余的Ca2+泵到細(xì)胞外來(lái)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，黃芩苷加入后可以下調(diào)Ca2+-Mg2+ATP酶活性，從而破壞離子穩(wěn)態(tài)使白念珠菌壞死[10]。土槿皮乙酸則可以發(fā)揮類似吡咯類藥物的作用，減少白念珠菌細(xì)胞膜上麥角脂醇含量[20]，但其上游機(jī)制是否與14α-去甲基化酶(14DM)相關(guān)尚未得到深入研究。

白念珠菌的形態(tài)轉(zhuǎn)化、生物膜形成與黏附、菌絲形成和細(xì)胞壁功能相關(guān)。白念珠菌的孢子或浮游菌的黏附是形成生物膜的起點(diǎn)，體外實(shí)驗(yàn)中，黃芩苷可以抑制白念珠菌對(duì)口腔上皮細(xì)胞和陰道上皮細(xì)胞的黏附能力，黃芩苷、苦參堿和大蒜素可以抑制白念珠菌黏附相關(guān)基因ALS1、ALS3、ALS4、SUN41、EAP1、CSH1的表達(dá)[12-13, 38]。黏附后可形成芽孢酵母的微菌落，而出芽形成菌絲，由酵母相向菌絲相轉(zhuǎn)化是白念珠菌增強(qiáng)毒力的關(guān)鍵。小檗堿、苦參堿可以下調(diào)菌絲形成相關(guān)基因ECE1、ALS3、SUN41和PBS2[13]。細(xì)胞壁不僅可以維持細(xì)胞形態(tài)，還參與白念珠菌的黏附和毒力因子的釋放，小檗堿可以破壞細(xì)胞壁的完整性。在胞外聚集基質(zhì)中，菌絲相和酵母相細(xì)胞構(gòu)建起一個(gè)復(fù)雜的三維結(jié)構(gòu)，白念珠菌由浮游菌向生物膜完成形態(tài)轉(zhuǎn)化，形成白念珠菌生物膜后，其毒力和耐藥性都會(huì)提高。穿心蓮內(nèi)酯則可以促進(jìn)白念珠菌生物膜分散至浮游菌狀態(tài)[15]。

在細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)化過(guò)程中，白念珠菌的耐藥能力不斷增強(qiáng)，其耐藥性與抗菌藥結(jié)合位點(diǎn)的表達(dá)、外排泵轉(zhuǎn)運(yùn)藥物能力和細(xì)胞器膜轉(zhuǎn)運(yùn)離子能力相關(guān)。白念珠菌外排泵主要受兩種類型基因調(diào)控，一種為ATP依賴型CDR1和CDR2；另一種則是質(zhì)子交換型MDR1和FLU1;芒果苷可以下調(diào)兩種基因的表達(dá)[35]。因?yàn)樵谛纬缮锬さ脑缙冢馀疟玫哪芰?duì)耐藥性影響較大，所以有研究推測(cè)只在形成生物膜的早期和中期對(duì)氟康唑有協(xié)同作用的漢防己甲素的作用位點(diǎn)在外排泵上[16]。

液泡是白念珠菌內(nèi)儲(chǔ)存Ca2+的主要細(xì)胞器，液泡膜上鈣離子調(diào)節(jié)器/通道蛋白Pmclp Vcxlp可以將細(xì)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+轉(zhuǎn)運(yùn)至液泡中；調(diào)節(jié)器Yvcxlp則可以將Ca2+從液泡轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，氟康唑可以抑制Vvcxlp的功能打破白念珠菌Ca2+穩(wěn)態(tài)達(dá)到抗菌目的，但白念珠菌高表達(dá)Pmclp時(shí)則可以代償被抑制的調(diào)節(jié)器Vcxlp的功能從而對(duì)氟康唑耐藥[39]，中藥單體成分小檗堿不僅可以下調(diào)基因PMC1表達(dá)，抑制Pmclp轉(zhuǎn)運(yùn)能力，還能上調(diào)基因YVC1表達(dá)，促進(jìn)Yvclp向內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)Ca2+與氟康唑發(fā)揮協(xié)同抑菌作用[7]。抗真菌藥物在白念珠菌上的結(jié)合位點(diǎn)通常是麥角脂醇及其上游調(diào)節(jié)酶，EGR11基因編碼14DM的構(gòu)象，當(dāng)它發(fā)生突變時(shí)，白念珠菌因無(wú)法被吡咯類藥物結(jié)合而形成耐藥。目前針對(duì)EGR11基因表達(dá)的中藥單體成分研究較少，尚有待進(jìn)一步深入。

5 結(jié)語(yǔ)

白念珠菌的常規(guī)抗真菌治療方法常面臨肝腎損害、耐藥和可選擇藥物較局限等問(wèn)題的困擾，中藥單體成分與氟康唑、兩性霉素B等抗真菌藥物對(duì)耐藥標(biāo)準(zhǔn)株有協(xié)同作用，能降低其MIC，并可能對(duì)臨床耐藥菌有逆轉(zhuǎn)耐藥的作用。中藥單體成分的抗白念珠菌機(jī)制與抑制菌絲形成、阻滯白念珠菌形態(tài)改變、破壞細(xì)胞壁完整性和改變胞內(nèi)離子穩(wěn)態(tài)有關(guān)。在體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中，中藥單體成分能提高免疫抑制型小鼠的IgG、IL-4、IL-12水平，增強(qiáng)其免疫力進(jìn)而抗擊白念珠菌。中藥單體成分抗白念珠菌具有許多優(yōu)勢(shì)，且中藥單體成分豐富多樣、來(lái)源廣泛，對(duì)白念珠菌的臨床治療有重要意義，但很多機(jī)制尚未完全明確，有待于進(jìn)一步深入研究。