體外HPV感染皮膚粘膜細(xì)胞及器官模型的研究進(jìn)展

唐奕, 陳荃, 彭麗倩, 陳教全, 李華平, 朱慧蘭

1.廣州醫(yī)科大學(xué)，廣東 廣州 511436;2.廣州市皮膚病防治所，廣東 廣州 510095

人乳頭瘤病毒(human papillomavirus，HPV)是一種雙鏈閉環(huán)的小型無包膜DNA病毒，包括兩百多種不同的分型，具有嚴(yán)格的種屬和組織特異性。HPV基因組全長約7.9 kb，其早期基因編碼區(qū)具有6個開放閱讀框，其中 E1和E2可調(diào)節(jié)病毒的復(fù)制和早期蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄，E5-E7可誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生以及調(diào)節(jié)后期角質(zhì)形成細(xì)胞的分化和免疫逃逸。E6、E7蛋白介導(dǎo)抑癌蛋白p53和pRb的降解，增加致癌基因蛋白間質(zhì)表皮轉(zhuǎn)化因子(cellular mesenchymal-epithelial transition factor, c-Met)的表達(dá)[1]，從而促進(jìn)細(xì)胞的增殖和擴(kuò)散，是重要的致癌蛋白[2]。HPV基因組的晚期基因編碼區(qū)包含兩個部分：L1和L2，L1編碼主要病毒衣殼蛋白L1蛋白，是HPV疫苗的靶抗原，而L2編碼次要病毒衣殼蛋白L2蛋白[2-3]。根據(jù)L1、E6、E7基因間核苷酸序列的同源性差異分為5個屬，其中α、β屬HPV感染最為常見。根據(jù)HPV感染部位的不同分為黏膜型、皮膚型，黏膜型HPV多屬于α屬，皮膚型HPV多屬于β屬。根據(jù)致癌性分為高危型、低危型，高危型如HPV16、HPV18可導(dǎo)致大多數(shù)宮頸、陰莖、會陰部及口咽部癌和癌前病變[4]；β屬如HPV5、HPV8與疣狀表皮發(fā)育不良患者繼發(fā)鱗狀細(xì)胞癌(squamous cell carcinoma, SCC)、基底細(xì)胞癌(basal cell carcinoma, BCC)的發(fā)生有關(guān)，且在紫外線照射共同作用下可使光線性角化病發(fā)病(actinic keratosis, AK)的風(fēng)險(xiǎn)增加13倍，與皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞腫瘤發(fā)生相關(guān)[5]；低危型如HPV6、HPV11可導(dǎo)致尖銳濕疣等[6]。

早期HPV相關(guān)細(xì)胞系主要是宮頸癌等腫瘤細(xì)胞系，HeLa細(xì)胞系是人類最早的體外培養(yǎng)成功的腫瘤細(xì)胞系，整合了HPV18型的相關(guān)基因，P53表達(dá)水平較低，目前應(yīng)用較多的還有HPV16型陽性的SiHa、含有HPV16型病毒基因組及HPV18型相關(guān)基因的CaSki等細(xì)胞系。HPV陽性的腫瘤細(xì)胞系易于培養(yǎng)，成本較低，為研究HPV感染相關(guān)腫瘤中的細(xì)胞生物學(xué)如腫瘤細(xì)胞周期、基因表達(dá)和治療藥物靶標(biāo)等提供了大量的研究材料。腫瘤細(xì)胞系中高危型HPV的E6和/或E7基因已整合到人染色體并持續(xù)高表達(dá)，無法模擬HPV感染中病毒和宿主的相互作用和HPV感染生命周期中病毒基因組的突變，并且有研究指出腫瘤細(xì)胞系在培養(yǎng)中存在顯著基因組的變異和潛在功能的差異，導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)不可重復(fù)的情況[7]。為研究HPV感染的致病機(jī)制、臨床表現(xiàn)等，國內(nèi)外學(xué)者建立了體外HPV感染模型，對HPV感染的治療藥物及疫苗等研究具有重要的意義。本文對目前體外HPV感染皮膚粘膜細(xì)胞及器官模型加以綜述。

1 皮膚黏膜細(xì)胞模型

HPV的生命周期與受感染上皮細(xì)胞的分化密切相關(guān)。正常狀態(tài)下，基底層細(xì)胞分裂、分化成熟為角質(zhì)層細(xì)胞時，細(xì)胞周期停止，進(jìn)入不可逆的分化過程。為了達(dá)到持續(xù)性感染和異常增殖，HPV從基底層進(jìn)入細(xì)胞，隨著被感染的上皮細(xì)胞向角質(zhì)層移動，E6和E7被激活，導(dǎo)致正常細(xì)胞周期抑制，并影響多種細(xì)胞信號通路[8]。含有HPV的基底層細(xì)胞移行時，上層細(xì)胞持續(xù)分裂，HPV晚期啟動子被激活，病毒DNA復(fù)制出現(xiàn)高拷貝量擴(kuò)增，表達(dá)晚期L1和L2衣殼蛋白。病毒組裝完成后，細(xì)胞釋放出成熟的病毒顆粒，引起持續(xù)感染[9]。HPV皮膚黏膜細(xì)胞模型為研究HPV感染提供了合適的培養(yǎng)模型，使用最廣泛的是原代人包皮角質(zhì)形成細(xì)胞(human foreskin keratinocytes,HFK)、正常永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(normal immortalized keratinocytes,NIKS)和轉(zhuǎn)化的人永生化角質(zhì)形成細(xì)胞(human immortalized keratinocytes,HaCaT)。然而，過往的研究結(jié)果顯示，不同的細(xì)胞模型在模擬HPV感染中病毒與宿主相互作用的過程中，會產(chǎn)生不同的影響。HaCaT是目前應(yīng)用最廣泛的細(xì)胞，與HFK和NIKS相比更易擴(kuò)增培養(yǎng)，HPV的感染性更高，對于轉(zhuǎn)染等操作具有更高的耐受性，且經(jīng)濟(jì)成本更低[10]。應(yīng)用HaCaT建立高危型如HPV16、HPV18的細(xì)胞模型已多有研究報(bào)道，由于低危型HPV的E6、E7基因缺乏轉(zhuǎn)化活性和永生化能力，病毒基因在細(xì)胞模型中的穩(wěn)定性較低，這也是導(dǎo)致低危型HPV體外模型難以研究的瓶頸問題。Wang等[11]采用了脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)染法導(dǎo)入HPV11全基因組，構(gòu)建重組細(xì)胞，以及HPV11 DNA和質(zhì)粒載體pTK-neo共轉(zhuǎn)染方式，構(gòu)建了含有HPV11基因組的HaCaT重組細(xì)胞。HFK的生物學(xué)特征最接近于正常人皮膚角質(zhì)細(xì)胞，但是HPV難以感染HFK，在高自噬水平HFK中HPV16的感染力得到了顯著增強(qiáng)，與低自噬水平的NIKS和HaCaT呈負(fù)相關(guān)性；然而，HPV16誘導(dǎo)自噬是宿主的防御機(jī)制，高自噬水平抑制了HPV感染，限制了HPV感染效率[12]。另一方面，HFK細(xì)胞的存活時間非常短暫，用含有HPV E6、E7基因的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染HFK細(xì)胞，可導(dǎo)致p53和pRb抑癌基因失活，建立永生化的HFK，其分化能力優(yōu)于HaCaT[13]。NIKS是近二倍體，保留了對接觸抑制的正常反應(yīng)，并且可以支持多種高危HPV類型的生命周期，包括HPV16、HPV18、HPV31、HPV45和HPV58等，多用于HPV感染的器官型培養(yǎng)中。Klymenko等[14]發(fā)現(xiàn)HPV感染改變NIKS的近3 000個基因的表達(dá)，破壞了NIKS的上皮屏障功能相關(guān)的基因表達(dá)，例如下調(diào)朗格漢斯細(xì)胞趨化因子(CC chemokine ligand 20,CCL20)和促炎細(xì)胞因子白介素1α的表達(dá)，從而認(rèn)為通過對NIKS基因的操縱分化，促使NIKS提供更利于HPV復(fù)制和釋放的環(huán)境，從而完成HPV的生命周期。永生化角質(zhì)形成細(xì)胞系的優(yōu)勢是，它們提供了相同基因的細(xì)胞背景，可在其中比較不同HPV感染類型的或相同HPV類型的突變基因組的表達(dá)。雖然可以減少因使用來自不同患病部位的角質(zhì)形成細(xì)胞而產(chǎn)生的批量效應(yīng)，但由于宿主細(xì)胞已經(jīng)永生，與正常人體細(xì)胞的感染仍存在區(qū)別，這也是目前模型系統(tǒng)研究中的難點(diǎn)[15]。

可通過多種方法建立模擬HPV感染的細(xì)胞模型，主要有基因轉(zhuǎn)染法、實(shí)驗(yàn)性感染法等。基因轉(zhuǎn)染法是最為常用的構(gòu)建途徑，可通過電穿孔法、逆轉(zhuǎn)錄病毒感染法和脂質(zhì)體法將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染后，可以檢測細(xì)胞中瞬時基因的表達(dá)，也可以使用適當(dāng)?shù)暮Y選系統(tǒng)篩選穩(wěn)定攜帶目的基因的細(xì)胞。脂質(zhì)體與電穿孔兩種方法轉(zhuǎn)染SiHa細(xì)胞，效率無明顯差別，然而脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞大部分呈圓形或類圓形改變，電穿孔轉(zhuǎn)染后SiHa細(xì)胞形態(tài)更多呈現(xiàn)正常形態(tài)[16]。質(zhì)粒載體通常用于將編碼shRNA或ORF的質(zhì)粒遞送至HFK和NIKS中，HaCaT轉(zhuǎn)導(dǎo)效率較低[17]。目前轉(zhuǎn)染方法多應(yīng)用于全基因組轉(zhuǎn)染與基因片段轉(zhuǎn)染兩類。Biryukov等[18]培養(yǎng)了HPV16、HPV18共感染模型，模型中產(chǎn)生重復(fù)感染排斥效應(yīng)，HPV18的感染性顯著降低，他們認(rèn)為HPV16阻止或延遲了HPV18的進(jìn)入或HPV16能夠部分阻斷HPV18的轉(zhuǎn)錄，并提出L2介導(dǎo)了HPV感染的重復(fù)感染排斥的觀點(diǎn)。

2 器官型培養(yǎng)模型

器官型培養(yǎng)是指在體外環(huán)境下，將細(xì)胞與具有三維結(jié)構(gòu)的材料共同培養(yǎng)，建立細(xì)胞-細(xì)胞或細(xì)胞-載體復(fù)合物，在三維立體的空間中促進(jìn)細(xì)胞遷移、生長、增殖以及信號傳導(dǎo)的過程，從而使細(xì)胞在體內(nèi)的生長環(huán)境模擬更全面以重現(xiàn)HPV感染的生命周期，器官型培養(yǎng)中的筏式培養(yǎng)是現(xiàn)階段研究的主要培養(yǎng)方式[19]。為了闡明病毒蛋白在病毒生命周期中的詳細(xì)作用和分子機(jī)制，Asselineau和Prunieras提出器官型筏式培養(yǎng)，使上皮細(xì)胞有序的增殖和達(dá)到終末的鱗狀分化[20]。筏式培養(yǎng)的主要方法是通過成纖維細(xì)胞Swiss 3T3 J2或Balb/C 3T3 JCA31與作為飼養(yǎng)細(xì)胞的1型大鼠尾膠原混勻培養(yǎng)、產(chǎn)生有孔徑的基質(zhì)樣真皮等效物后，將角質(zhì)形成細(xì)胞種植在該真皮等效物表面。首先進(jìn)行單層培養(yǎng)，24 h左右細(xì)胞達(dá)到融合，將其在氣液界面的金屬網(wǎng)格上接種培養(yǎng)，上皮細(xì)胞暴露于空氣中，通過下層具有穩(wěn)定性的纖維細(xì)胞毛細(xì)作用吸取營養(yǎng)，促進(jìn)角質(zhì)形成細(xì)胞的增殖。培養(yǎng)8～24 d，上皮細(xì)胞成長分化為復(fù)層鱗狀上皮[21]。Bedell等[22]用筏式培養(yǎng)CIN612細(xì)胞系，經(jīng)TPA處理促進(jìn)突變的終末端分化，產(chǎn)生了子代病毒顆粒。Wang等[23]通過使用Cre-Lox P系統(tǒng)在轉(zhuǎn)染的角質(zhì)形成細(xì)胞中生成大量HPV18病毒顆粒。Cre-Lox P可保留HPV18的超螺旋性，使病毒基因組更接近轉(zhuǎn)錄和復(fù)制的原始狀態(tài)，在2周的培養(yǎng)后HPV18在復(fù)層上皮中增殖明顯并在表層中聚集，并表達(dá)大量的L1衣殼蛋白[24]。Cre-Lox P系統(tǒng)為HPV18突變體的研究提供了有效的模型，例如p53被證明是E6蛋白的關(guān)鍵靶點(diǎn)之一，在病毒DNA擴(kuò)增中受損的HPV18 E6突變體，無法有效破壞p53穩(wěn)定性，而p53 shRNA可以降低p53蛋白的含量，則使它很大程度恢復(fù)[23]。通過Cre-LoxP系統(tǒng)可以在轉(zhuǎn)染細(xì)胞中去除質(zhì)粒并重新環(huán)化HPV的附加體，不需要純化和連接程序。Villa等[25]使用宮頸活檢中新鮮切除的宮頸角質(zhì)形成細(xì)胞進(jìn)行筏式培養(yǎng)，以助于研究與持續(xù)性HPV感染相關(guān)宮頸癌的分子轉(zhuǎn)化機(jī)制。

由于不能在細(xì)胞單層培養(yǎng)物中繁殖，因此產(chǎn)生分層和分化上皮的器官型筏式培養(yǎng)已被廣泛應(yīng)用于研究HPV生命周期、感染和傳播。研究人員也進(jìn)一步使用器官型筏式培養(yǎng)來研究HPV與其他上皮性病毒的相互作用，例如單純皰疹病毒和HPV，腺病毒相關(guān)病毒和HPV的相互作用[26]，使用的還有以及多種細(xì)胞共培養(yǎng)模型，如腫瘤細(xì)胞、免疫細(xì)胞等共培養(yǎng)，以明確細(xì)胞之間相互作用的影響。器官型筏式培養(yǎng)的主要優(yōu)點(diǎn)是可以選定病毒基因轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞中建立，合并不同類型的細(xì)胞并研究不同組織中細(xì)胞相互作用的影響。最近一項(xiàng)研究表明，HPV16的E8^E2C融合蛋白在終末上皮分化的條件下，對病毒的擴(kuò)增復(fù)制過程有調(diào)節(jié)作用[27]。一些實(shí)驗(yàn)室已應(yīng)用該系統(tǒng)的變體來實(shí)現(xiàn)體外生產(chǎn)HPV11和一些主要的高危HPV型病毒粒子，包括HPV16，HPV18和HPV45[28]。

3 結(jié)語

HPV體外模型在研究HPV的理化特性、相關(guān)疾病的致病機(jī)制以及抗HPV感染藥物和疫苗中發(fā)揮了重要的作用。HPV皮膚黏膜細(xì)胞模型是應(yīng)用最廣泛的模型，目前已構(gòu)建多種HPV亞型的細(xì)胞感染模型，但存在因不同細(xì)胞系和轉(zhuǎn)染方法導(dǎo)致HPV感染效果不一致、不能模擬HPV感染的完整過程、與人的正常細(xì)胞感染仍有區(qū)別等局限性；器官型模型是目前模擬HPV生命周期最理想的HPV體外模型，但更合適的細(xì)胞系、感染方法和構(gòu)建器官型模型的方法有待進(jìn)一步研究。