Dickkopf家族蛋白在非小細(xì)胞肺癌中的作用機(jī)制和治療應(yīng)用的研究進(jìn)展

董程 綜述 段勇 審校

肺癌仍然是世界范圍內(nèi)重要的公共衛(wèi)生問題，其發(fā)病率和死亡率都位居惡性腫瘤的第1位，其中非小細(xì)胞肺癌(Non-small cell lung cancer，NSCLC)約占肺癌的80%～85%[1-3]。在我國，由于汽車尾氣、控?zé)煵涣Α⑶嗌倌晡鼰熑藬?shù)劇增等諸多因素，我國肺癌發(fā)病率更是呈現(xiàn)有增無減的趨勢(shì)[4]。

目前NSCLC的化療方案通常由順鉑或卡鉑雙聯(lián)體聯(lián)合吉西他濱、長(zhǎng)春瑞濱、紫杉醇、培美曲塞或多西他賽組成[5]。不幸的是，許多NSCLC患者表現(xiàn)出對(duì)化療的耐藥性。在過去的20年里，幾種基于分子的靶向藥物已用于NSCLC的治療，包括突變、免疫檢查點(diǎn)分子、與癌細(xì)胞增殖和存活有關(guān)的分子等[6]。最初反應(yīng)良好，但是《ASCO年度報(bào)告：2018臨床腫瘤學(xué)進(jìn)展》指出[7]，有部分患者在接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療時(shí)沒有反應(yīng)或疾病仍在進(jìn)展。且隨著免疫檢查點(diǎn)抑制劑的廣泛批準(zhǔn)使用，其相關(guān)的并發(fā)癥逐漸浮出水面。因此，有必要研究有效且新穎的治療方法，特別是在肺癌相關(guān)信號(hào)通路領(lǐng)域。

既往研究已證實(shí)幾種經(jīng)典Wnt信號(hào)通路抑制劑對(duì)NSCLC具有抗癌作用，包括Dickkopf家族蛋白(DKKs)、分泌型卷曲相關(guān)蛋白(SFRP)和Wnt抑制因子1(WIT-1)[8]。其中，DKKs參與多種人類腫瘤的發(fā)生發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程，特別是與NSCLC的關(guān)系，一直是人們關(guān)注的焦點(diǎn)。本文對(duì)DKKs在NSCLC中的作用機(jī)制和治療潛力進(jìn)行綜述。

1 DKKs的概況

DKKs是一類含有255～350個(gè)氨基酸的分泌糖蛋白，是Wnt/β-catenin通路的重要調(diào)節(jié)因子[9]。DKKs家族有DKK-1、DKK-2、DKK-3、DKK-4及DKKL-1/SGY-1等成員。DKK-1、DKK-2和DKK-4的分子量為25～29 kDa，DKK-3的分子量為38 kDa，除SGY-1外，其他家族成員在結(jié)構(gòu)上均含有一個(gè)N端信號(hào)肽和兩個(gè)保守的富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域(CRD)，即Cys1和Cys2，但這些成員間的氨基酸序列差異較大[10]。Cys1和Cys2被一個(gè)長(zhǎng)度不同的連接區(qū)域隔開，這一連接區(qū)域在DKK-1、DKK-2和DKK-4之間較為接近，由51～56個(gè)氨基酸組成，在DKK-3中僅有13個(gè)氨基酸組成，故其他成員間的相似性要高于DKK-3。DKK-1、DKK-2和DKK-4之間的序列同源性為46%～50%，DKK-3和其他成員之間的序列同源性為37%～40%[11]。目前，對(duì)SGY-1相關(guān)的結(jié)構(gòu)功能和相關(guān)的生物學(xué)作用知之甚少。

2 DKKs在NSCLC中的作用機(jī)制

2.1 DKK-1蛋白在NSCLC中的作用機(jī)制

DKK-1是經(jīng)典Wnt信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)最有特點(diǎn)的拮抗劑之一[12]。DKK-1在正常成人組織中的表達(dá)非常低，而在胚胎組織中的表達(dá)則很高[13]。據(jù)報(bào)道，與正常對(duì)照組相比，DKK-1通常在大部分肺癌細(xì)胞系中高度激活，并在肺癌組織和肺癌患者的血清中高表達(dá)[13-15，20]。重要的是，許多研究認(rèn)為DKK-1與肺癌的分類、分期和腫瘤轉(zhuǎn)移有相關(guān)[8]，并可能促進(jìn)肺癌細(xì)胞的遷移、侵襲、增殖和上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)[16-19]，表明DKK-1可能是NSCLC進(jìn)展中至關(guān)重要的致癌調(diào)節(jié)劑，并且在NSCLC免疫療法中可能是不同于經(jīng)典Wnt途徑抑制劑的新型生物標(biāo)志物和治療靶標(biāo)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DKK-1啟動(dòng)子甲基化于大多數(shù)NSCLC細(xì)胞系和組織中[8]。Na等[20]研究NSCLC早期病變發(fā)現(xiàn)，DKK-1啟動(dòng)子的甲基化與肺癌發(fā)病有關(guān)，在NSCLC中DKK-1功能被抑制，其表達(dá)下調(diào)。Xu等[21]研究發(fā)現(xiàn)，NSCLC患者血清DKK-1也是低表達(dá)。但是，Dong等[22]提出了不同看法，他們發(fā)現(xiàn)NSCLC患者血清中DKK-1過表達(dá)，且預(yù)示疾病的預(yù)后不良。這可能與DKK-1在NSCLC不同時(shí)期的表達(dá)量不同有關(guān)。Bhavanasi等[23]發(fā)現(xiàn)DKK-1與細(xì)胞骨架相關(guān)蛋白4(CKAP4)結(jié)合后，CKAP 4通過與PI3K的P85α亞基的SH3結(jié)構(gòu)域相互作用，將磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)激活到細(xì)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域。通過這種機(jī)制，DKK-1激活A(yù)KT并促進(jìn)細(xì)胞增殖。此外，DKK-1與CKAP 4的結(jié)合具有與輔助受體低密度脂蛋白受體相關(guān)蛋白5/6(LRP 5/6)相互作用無關(guān)的高親和力。因此，DKK-1/CKAP4相互作用可能成為NSCLC的治療靶標(biāo)。

2.2 DKK-2蛋白在NSCLC中的作用機(jī)制

DKK-2作為Wnt信號(hào)通路拮抗劑，通過與LRP5和LRP6結(jié)合抑制Wnt/β-catenin信號(hào)傳導(dǎo)。Shen等[24]發(fā)現(xiàn)DKK-2表達(dá)的上調(diào)存在于具有APC突變的人NSCLC和由APC缺失引起的小鼠肺腫瘤中，敲除DKK-2不改變LLC肺癌細(xì)胞的體外細(xì)胞增殖或凋亡，因此，DKK-2不直接影響腫瘤細(xì)胞本身的增殖和凋亡。然而實(shí)驗(yàn)報(bào)道在動(dòng)物體內(nèi)敲低DKK-2明顯抑制腫瘤的進(jìn)展，并推測(cè)DKK-2可能通過改變腫瘤微環(huán)境調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)。同時(shí)使用DKK-2單克隆抗體5F8，觀察到5F8抗體在原位腫瘤模型和基因工程小鼠肺癌模型中能夠明顯抑制體內(nèi)肺癌細(xì)胞生長(zhǎng)，再次佐證了這一推測(cè)。進(jìn)一步用流式細(xì)胞術(shù)分析腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(TILs)，發(fā)現(xiàn)抗DKK-2抗體處理的腫瘤樣品中NK細(xì)胞數(shù)量顯著增加。顯然，DKK-2抗體可以直接增強(qiáng)對(duì)小鼠NK細(xì)胞的活化，活化的細(xì)胞毒性NK細(xì)胞在抑制腫瘤形成中具有重要作用，結(jié)果表明DKK-2抗體可用于APC突變NSCLC的靶向治療。

2.3 DKK-3蛋白在NSCLC中的作用機(jī)制

DKK-3屬于細(xì)胞外Wnt信號(hào)傳導(dǎo)通路抑制劑，在包括肺癌在內(nèi)的多種癌癥中由于啟動(dòng)子甲基化而下調(diào)表達(dá)，低表達(dá)的DKK-3可能參與Wnt信號(hào)的激活，從而影響NSCLC的發(fā)生。同時(shí)，DKK-3能夠抑制細(xì)胞增殖和促進(jìn)血管形成，生物功能較為復(fù)雜。Yue等[25]對(duì)Wnt/β-catenin信號(hào)通路在肺癌中異常激活的機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)在肺癌組織中DKK-3基因因啟動(dòng)子甲基化而失活，表明DKK-3在肺癌中呈表達(dá)抑制狀態(tài)。同時(shí)雷艷榮等[26]采用實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)NSCLC患者腫瘤組織和癌旁組織DKK-3 mRNA表達(dá)，發(fā)現(xiàn)NSCLC腫瘤組織DKK-3 mRNA顯著低于癌旁組織。據(jù)Li等[27]研究報(bào)道，DKK-3蛋白在高度血管化的腫瘤血管中表達(dá)，在體外對(duì)原代內(nèi)皮細(xì)胞形成的集落細(xì)胞繼續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，用siRNA敲低DKK-3基因并不顯著影響細(xì)胞增殖，但可以降低基質(zhì)中血管的形成。這一發(fā)現(xiàn)給NSCLC的抗血管生成治療帶來了新的可能。另據(jù)報(bào)道，DKK-3的重新激活可能是由于β-catenin、MMP-7、Survivin、c-Myc和Cyclin D1等基因的表達(dá)降低所致，表明DKK-3能通過誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞生長(zhǎng)[8]。Song等[8]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)miR-582-3p的過度表達(dá)可抑制Wnt通路的多個(gè)負(fù)調(diào)控因子，包括DKK-3、AXIN 2和SFRP 1，并過度刺激Wnt信號(hào)維持NSCLC的癌癥干細(xì)胞樣(Cancer stem cell like，CSC like)特性。因此，靶向miR-582-3p治療可能是NSCLC治療的新方法。

2.4 DKK-4蛋白在NSCLC中的作用機(jī)制

DKK-4是DKK家族蛋白中最小的成員，也是研究最少的成員。Sima等[28]發(fā)現(xiàn)DKK-1和DKK-4在各種Wnt信號(hào)通路上存在特征性的活性差異，DKK-4的作用僅限于某些Wnt信號(hào)通路，包括Wnt1、Wnt10a和Wnt10b，而不是既往所認(rèn)知的規(guī)范Wnt3a信號(hào)通路，DKK-4對(duì)Wnt信號(hào)通路的選擇性抑制作用提供了更多細(xì)微調(diào)節(jié)的可能性。另據(jù)報(bào)道，DKK-4由兩個(gè)獨(dú)立的折疊域(CRD1和CRD2)組成，折疊域之間由高度靈活的非結(jié)構(gòu)化連接子連接。其中CRD2介導(dǎo)了LDL受體相關(guān)蛋白6的E1E2區(qū)域(LRP6 E1E2)和胞外結(jié)構(gòu)域Kremen1蛋白(Krm1)的高親和力結(jié)合。相反，CRD1僅與LRP6 E1E2具有中等親和力，且不與Krm蛋白相互作用。還發(fā)現(xiàn)DKK-4和Krm家族蛋白協(xié)同作用，并形成包括DKK-4、Krm和LRP5/6蛋白在內(nèi)的多種三元復(fù)合物，從而可以微調(diào)Wnt信號(hào)的傳導(dǎo)[29]。

3 DKKs在NSCLC治療方面的研究

3.1 DKKs在NSCLC化療方面的研究

目前NSCLC的化療面臨巨大挑戰(zhàn)，很多NSCLC患者表現(xiàn)出對(duì)化療的耐藥性，治療失敗仍然是一個(gè)關(guān)鍵問題。然而，有報(bào)道發(fā)現(xiàn)DKKs在NSCLC的化療方面已經(jīng)取得了研究進(jìn)展，可能對(duì)NSCLC的化療起到新的指導(dǎo)作用。

順鉑(DDP)是一種靶向DNA的細(xì)胞毒性藥物，可抑制RNA轉(zhuǎn)錄，誘導(dǎo)細(xì)胞周期紊亂和細(xì)胞凋亡。順鉑在體內(nèi)的耐藥性很大程度上歸因于DNA修復(fù)的增加，及促進(jìn)凋亡-抗凋亡信號(hào)的失衡，這些信號(hào)由Wnt信號(hào)介導(dǎo)[30]。Cheng等[31]采用qRT-PCR檢測(cè)30例晚期肺腺癌患者肺癌組織中DKK-1 mRNA的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)與DDP不敏感NSCLC樣品比較，DKK-1 mRNA在DDP敏感的NSCLC樣品中表達(dá)水平較低(P<0.05)，表明DKK-1可能與順鉑耐藥機(jī)制有關(guān)。Salim等[32]進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)DKK1可能是順鉑難治性NSCLC的標(biāo)志物，并且是改善順鉑難治性NSCLC細(xì)胞對(duì)順鉑敏感性的潛在治療靶標(biāo)。另據(jù)報(bào)道，DKK-3通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)通路，與順鉑協(xié)同作用，抑制NSCLC細(xì)胞的生長(zhǎng)和遷移運(yùn)動(dòng)，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[30]。DKK-3對(duì)順鉑耐藥的NSCLC具有良好的化療增敏作用，是開發(fā)針對(duì)順鉑耐藥NSCLC治療和預(yù)防策略的理想靶點(diǎn)。

多西他賽(Docetaxel)是紫杉醇的半合成類似物，多西他賽通過抑制微管解聚，激活紡錘體裝配檢查點(diǎn)，隨后引起細(xì)胞凋亡[33-34]。但是，在腫瘤晚期病灶擴(kuò)散到肺部以外時(shí)，化療藥物變得越來越無效[35]。Tao等[36]發(fā)現(xiàn)，在多西他賽耐藥的人肺癌細(xì)胞中，DNA甲基化誘導(dǎo)DKK-3下調(diào)，并通過上調(diào)MDR-1和P-gp的表達(dá)增強(qiáng)細(xì)胞耐藥性。隨后重新上調(diào)了DKK-3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)人NSCLC細(xì)胞增強(qiáng)了對(duì)多西他賽的化療敏感性。表明DKK-3將來可能成為NSCLC患者逆轉(zhuǎn)多西他賽耐藥的潛在靶標(biāo)。Yang等[37]將A549細(xì)胞以及多西他賽耐藥的人肺腺癌(A549/DTX)細(xì)胞的培養(yǎng)上清液進(jìn)行對(duì)比，發(fā)現(xiàn)DKK-4在A549/DTX細(xì)胞中的表達(dá)明顯增加，并觀察到DKK-4的敲低促進(jìn)多西他賽抑制A549/DTX細(xì)胞的生長(zhǎng)，增強(qiáng)多西他賽的促凋亡作用。這表明DKK-4在A549細(xì)胞對(duì)多西他賽耐藥性中具有關(guān)鍵作用，并提供了多西他賽聯(lián)合DKK-4治療NSCLC的潛力。

3.2 DKKs在NSCLC靶向治療方面的研究

在過去的20年中，基于分子的靶向藥物已用于NSCLC的治療[6]。然而，盡管現(xiàn)有的靶向療法發(fā)展迅速，仍不能滿足NSCLC治療的需要。值得高興的是，新的研究表明DKKs可能在NSCLC靶向治療方面有所突破。

郭夢(mèng)楠等[38]在四唑鹽(MTT)比色法檢測(cè)煙酸硒氰化合物SLL-1A-16對(duì)肺癌細(xì)胞A549、NCI-H460細(xì)胞增殖影響的實(shí)驗(yàn)中觀察到，在兩種肺癌細(xì)胞中化合物SLL-1A-16通過上調(diào)抑癌因子DKK-3，下調(diào)磷酸化信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(p-STAT)蛋白表達(dá)，阻止mTOR信號(hào)通路的激活從而抑制NSCLC細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)NSCLC細(xì)胞凋亡。結(jié)果表明，在未來化合物SLL-1A-16可作為一種靶向調(diào)節(jié)DKK-3表達(dá)的藥物應(yīng)用于NSCLC的治療。此外，楊茜等[39]發(fā)現(xiàn)，左旋一葉萩堿可通過誘導(dǎo)SFRP-1基因和DKK-1基因的甲基化調(diào)節(jié)Wnt信號(hào)通路，最終抑制A549細(xì)胞的增殖。因此，左旋一葉萩堿擁有靶向調(diào)節(jié)DKK-1基因治療NSCLC的潛力。

3.3 DKKs在NSCLC免疫治療方面的研究

隨著以PD-1單抗、PD-L1單抗和CTLA-4單抗為代表的免疫檢查點(diǎn)抑制劑的使用，對(duì)NSCLC的治療取得了明顯的臨床獲益。但是，有部分患者在接受免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療時(shí)沒有反應(yīng)或疾病仍在進(jìn)展。既往研究對(duì)DKKs在腫瘤的免疫調(diào)節(jié)方面進(jìn)行了探索。Maria等[40]發(fā)現(xiàn)，抑制DKK-3的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)CD8+T細(xì)胞的自身耐受性，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)小鼠對(duì)腫瘤的排斥反應(yīng)。相反，促進(jìn)DKK-3的表達(dá)可抑制CD8+T細(xì)胞上述反應(yīng)。類似地，Suzawa等[41]的研究發(fā)現(xiàn)，DKK-3也在局部微環(huán)境中起作用，DKK-3通過抑制外周T細(xì)胞的活化和分化來控制NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞的應(yīng)答，不僅具有直接的抗腫瘤作用，還通過刺激免疫系統(tǒng)產(chǎn)生間接的抗腫瘤效應(yīng)。研究結(jié)果表明，DKK-3是免疫反應(yīng)的新型調(diào)節(jié)劑，并且DKK-3可能是用于控制腫瘤的免疫抑制靶標(biāo)。Xiao等[42]發(fā)現(xiàn)，DKK-2通過與LRP5結(jié)合，抑制NK細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞活化，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，DKK-2可以抑制PD-1單抗對(duì)腫瘤浸潤(rùn)免疫效應(yīng)細(xì)胞的活化作用。因此，DKK-2可能是調(diào)節(jié)免疫檢查點(diǎn)抑制劑治療的潛在靶點(diǎn)。

4 小結(jié)與展望

DKKs包括DKK-1、DKK-2、DKK-3、DKK-4及DKKL-1/SGY-1等成員，與NSCLC細(xì)胞增殖、轉(zhuǎn)移、侵襲密切相關(guān)。DKKs各成員在NSCLC中的表達(dá)和作用機(jī)制不同，某些作用機(jī)制有望為NSCLC的防治提供新的理論依據(jù)。但是，DKK-1在NSCLC中的表達(dá)和調(diào)控存在爭(zhēng)議，DKK-4在NSCLC中的研究較少，說明DKKs在NSCLC中作用機(jī)制的復(fù)雜性及部分研究的不全面。治療方面，DKKs可增強(qiáng)耐藥NSCLC對(duì)化療藥物敏感性，證實(shí)DKKs在NSCLC靶向治療和免疫治療中的潛力。但是能否通過檢測(cè)DKKs在不同個(gè)體中的表達(dá)，預(yù)測(cè)不同個(gè)體對(duì)化療藥的敏感性，實(shí)現(xiàn)最佳的個(gè)體化療方案，還需繼續(xù)探索。此外，在腫瘤靶向治療和免疫治療發(fā)揮巨大潛力的今天，還缺乏更大隊(duì)列的實(shí)驗(yàn)性研究和臨床觀察支持DKKs在NSCLC靶向治療和免疫治療的臨床應(yīng)用?？傊?，對(duì)于DKKs在NSCLC中的研究還處于起步階段，關(guān)于DKKs在NSCLC的作用機(jī)制還未完全明確，未來DKKs可能在NSCLC靶向治療和免疫治療中成為研究熱點(diǎn)。