2型糖尿病大血管病變大鼠模型的研究進(jìn)展

彭思涵 徐剛 謝菊 梁小利 王紅艷 謝春光

糖尿病大血管病變是糖尿病主要慢性并發(fā)癥之一，是糖脂代謝紊亂的綜合后果，其實(shí)質(zhì)是動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)病變，主要表現(xiàn)為心、腦、下肢大血管及糖尿病足的病變。較非糖尿病患者而言，糖尿病動(dòng)脈粥樣硬化的特點(diǎn)在于受累血管更加廣泛、粥樣病變更加彌漫、管腔狹窄更加嚴(yán)重以及斑塊破裂更易發(fā)生[1]。血管并發(fā)癥是糖尿病患者死亡和致殘的主要原因[2]，研究表明糖尿病人群中冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病死亡率是正常人群的2～3倍[3]，糖尿病大血管病變的防治是糖尿病治療的重要內(nèi)容。故建立理想的2 型糖尿病(T2DM)大血管病變動(dòng)物模型對(duì)深入研究糖尿病大血管病變有較為深遠(yuǎn)的意義。

在常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中，猴和豬的系統(tǒng)發(fā)育及飲食結(jié)構(gòu)與人類相似，而且可以產(chǎn)生自發(fā)性AS，是理想的大血管病變實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，但由于其購買難度較大、飼養(yǎng)費(fèi)用昂貴，目前難以作為普遍推廣的模型使用[4-5]。家兔和大鼠是研究AS最常用的模型動(dòng)物，兩者均有各自的特點(diǎn)：家兔對(duì)高脂飲食尤為敏感，在高膽固醇飲食喂養(yǎng)下能快速形成以高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein-C，HDL-C)為主的高膽固醇血癥，但僅能形成早期脂質(zhì)條紋，不能形成纖維斑塊，故家兔不易產(chǎn)生自發(fā)性AS[5-6]；大鼠雖然具有天然抗AS性，但由于其易獲得、易飼養(yǎng)以及生理結(jié)構(gòu)、食性與人類相似，具有經(jīng)濟(jì)效益高、生存能力強(qiáng)等特點(diǎn)，故人們還是在不斷摸索建立合適的大鼠T2DM大血管病變模型。

目前T2DM鼠類模型分為自發(fā)性T2DM模型、誘發(fā)性T2DM模型、轉(zhuǎn)基因/基因敲除T2DM模型三大類，其中T2DM大血管病變建模主要應(yīng)用自發(fā)性與誘發(fā)性糖尿病模型，常用GK大鼠、SD大鼠及Wistar大鼠等進(jìn)行造模。本文將從自發(fā)性、誘發(fā)性T2DM大血管病變大鼠模型的構(gòu)建、應(yīng)用、注意事項(xiàng)等多方面進(jìn)行闡述，歸納其研究進(jìn)展，為研究人員選擇合適的動(dòng)物模型提供參考。

1 運(yùn)用GK大鼠進(jìn)行自發(fā)性T2DM大血管病變模型的建立

鐘惠菊等[7]采用6月齡雄性GK大鼠作為研究對(duì)象，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，隨機(jī)選取血糖值大于11.1 mmol/L的GK大鼠，同時(shí)喂飼高脂飼料(成分比例為：普通飼料87.5%、精煉豬油10.0%、膽固醇2.0%、豬膽鹽0.3%，丙基硫氧嘧啶0.2%)。在喂飼高脂飼料的基礎(chǔ)上加用10 mg/(kg·d)一氧化氮合成酶抑制劑-N-硝基-L-精氨酸甲酯(L-NAME)灌胃。連續(xù)8周。結(jié)果顯示模型組GK大鼠和正常組比較，三酰甘油(triglyceride，TG)、總膽固醇(total cholesterol，TC)、低密度脂蛋白(low density lipoprotein，LDL)升高，HDL-C明顯下降；光鏡下模型組可見內(nèi)皮細(xì)胞腫脹，其下聚集大量泡沫細(xì)胞，膠原纖維玻璃樣變，平滑肌細(xì)胞排列紊亂，為AS早中期典型病變。

劉椏[8]選用5月齡雄性GK大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后，將隨機(jī)血糖值大于11.1 mmol/L的GK大鼠納入實(shí)驗(yàn)。模型組喂飼高脂飼料(成分比例為：普通飼料88.2%、精煉豬油10.0%、膽固醇1.5%、豬膽鹽0.3%)的同時(shí)將濃度為0.1 mg/(mL·d)的一氧化氮合成酶抑制劑L-NAME加入大鼠飲用水中供其自由飲用。造模時(shí)間為5周。結(jié)果顯示模型組TC、TG、C反應(yīng)蛋白明顯升高；HE染色觀察模型組腹主動(dòng)脈有多少不等的內(nèi)膜增厚病灶，內(nèi)皮下細(xì)胞浸潤(rùn)，內(nèi)膜斷裂不平整，脂質(zhì)沉積較明顯等改變。證明可成功復(fù)制T2DM早期大血管病變模型。

GK大鼠是1973年在日本仙臺(tái)由Goto及Kakizaki等人通過選擇糖耐量處于上限的Wistar大鼠近交繁殖重復(fù)數(shù)代所形成的自發(fā)性非肥胖T2DM大鼠[9]，近年來在糖尿病及相關(guān)并發(fā)癥的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究過程中得到廣泛應(yīng)用。GK大鼠具有血糖輕度升高、胰腺β細(xì)胞團(tuán)塊量減少、葡萄糖刺激的胰島素分泌能力受損等特點(diǎn)，其嚴(yán)格的篩選方式和漫長(zhǎng)的繁育時(shí)間決定了GK大鼠穩(wěn)定的生物學(xué)特性、較高的存活率及類似于人類T2DM的血糖水平與胰島素分泌的特點(diǎn)[9]，其穩(wěn)定的高血糖和體質(zhì)量減輕的特征使GK大鼠在高脂飼料喂養(yǎng)的造模過程中避免肥胖因素產(chǎn)生的干擾。研究表明，幼年期(3～8周齡) 的GK大鼠適用于糖尿病前期相關(guān)研究的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)；14周齡時(shí)GK大鼠葡萄糖刺激的胰島素分泌明顯下降，為正常Wistar大鼠的25%～50%；成年(尤其是16～20周齡)的GK大鼠可作為研究胰島細(xì)胞凋亡、炎癥與纖維化的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)對(duì)象[10]。

關(guān)于AS的形成機(jī)制，目前廣泛認(rèn)為細(xì)胞內(nèi)皮功能受損是早期動(dòng)脈硬化的標(biāo)志之一，脂質(zhì)代謝紊亂所致的高脂血癥是引發(fā)動(dòng)脈硬化的始動(dòng)因素。AS早期由于內(nèi)皮細(xì)胞損傷，炎癥細(xì)胞和脂質(zhì)在內(nèi)皮下沉積，巨噬細(xì)胞吞噬脂質(zhì)變?yōu)榕菽?xì)胞，隨著炎癥加重斑塊逐漸進(jìn)展成為早期的脂質(zhì)條紋；而后在AS中期，隨著生長(zhǎng)因子和炎癥介質(zhì)的不斷增加，平滑肌細(xì)胞由中膜向內(nèi)膜遷移并增生，攝取脂質(zhì)成為泡沫細(xì)胞，在炎癥作用下產(chǎn)生大量彈性蛋白和膠原纖維，早期的脂質(zhì)條紋逐漸變?yōu)槔w維斑塊；在AS晚期，斑塊增大、管腔變窄，血流動(dòng)力學(xué)改變，纖維帽變薄，斑塊破裂繼發(fā)形成血栓[11-12]。綜上，脂質(zhì)紊亂可明顯損傷動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞，引發(fā)血管內(nèi)皮功能受損進(jìn)而導(dǎo)致AS。

L-NAME是近年來報(bào)道較多的研究造模劑，通過競(jìng)爭(zhēng)性與一氧化氮合成酶結(jié)合，從而抑制一氧化氮的合成，進(jìn)而損傷血管內(nèi)皮功能，誘導(dǎo)早期血管炎癥以及加速AS的發(fā)生。成年GK大鼠高脂飼料聯(lián)合L-NAME喂養(yǎng)5周以上的造模方法，具有造模時(shí)間穩(wěn)定、成功率高、易于推廣等特點(diǎn)，可作為糖尿病大血管病變的優(yōu)良動(dòng)物模型。

2 運(yùn)用SD大鼠、Wistar大鼠進(jìn)行誘發(fā)性T2DM大血管病變模型的建立

文隆等[13]選用8周齡成年雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組。模型組予高糖高脂飼料(成分比例為：普通飼料66.5%，豬油10.0%，蔗糖20.0%，膽固醇2.3%，膽酸鹽1.0%，丙硫0.2%)喂養(yǎng)。4周后模型組腹腔一次注射鏈脲佐菌素(STZ)35 mg/kg，72 h 后大鼠測(cè)隨機(jī)血糖≥16.7 mmol/L，判斷糖尿病大鼠模型成立。模型組繼續(xù)喂養(yǎng)高糖高脂飼料8周后檢測(cè)TC、TG、LDL升高，HDL下降，光鏡下內(nèi)膜厚度增加，有脂斑突向管腔或斑塊形成，主動(dòng)脈粥樣硬化病變明顯。

姚賀之[14]將Wistar雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，禁食不禁水12 h，腹腔注射2% STZ(50 mg/kg體質(zhì)量)復(fù)制糖尿病模型。1周后尾靜脈采血，以隨機(jī)血糖≥16.9 mmol/L為糖尿病造模成功標(biāo)準(zhǔn)。糖尿病造模成功后給予維生素D3注射液(VitD3)總量60萬IU/kg體質(zhì)量灌胃，平均分為3 d進(jìn)行，同時(shí)予以高脂飼料喂養(yǎng)(成分比例為：基礎(chǔ)飼料81.3%，膽固醇3.0%，膽酸鈉0.5%，丙基硫氧嘧啶0.2%，白糖5.0%，豬油10.0%)。實(shí)驗(yàn)周期14周。飼料中加入膽酸鈉以促進(jìn)膽固醇的吸收，加入丙基硫氧嘧啶以抑制甲狀腺功能、減少膽固醇代謝、升高血清膽固醇含量，其中加入高糖飲食以達(dá)到誘導(dǎo)AS病變的目的，加入VitD3以破壞血管壁、利于脂質(zhì)沉積。高脂飼料聯(lián)合維生素D誘導(dǎo)建模的大鼠在第14周檢測(cè)發(fā)現(xiàn)TC、TG、LDL等水平較空白組顯著升高，HDL水平顯著降低；主動(dòng)脈HE染色光鏡下可見血管內(nèi)膜增厚，有凸向管腔的脂質(zhì)斑塊形成。表明實(shí)驗(yàn)T2DM大血管病變大鼠模型成功。

黃霖等[15]將1月齡SD大鼠喂飼高脂高糖飼料(成分比例為：基礎(chǔ)飼料加入脂肪15.0%、蔗糖20.0%、雞蛋5.0%、膽固醇1.0%、食鹽0.1%)4周以誘導(dǎo)胰島素抵抗，并將SD大鼠空腹12 h后于右側(cè)腹腔注射2%STZ 30 mg/kg (未成模者在注射1周后再注射1次)，并繼續(xù)喂以高糖高脂飼料直至第6周。糖尿病判定標(biāo)準(zhǔn)為：注射后第3、7、14日測(cè)定血糖，大鼠隨機(jī)血糖≥16.9 mmol/L，或出現(xiàn)多飲、多尿、多食、懶動(dòng)、消瘦等糖尿病癥狀且連續(xù)2次隨機(jī)血糖＞11.1 mmol/L。該實(shí)驗(yàn)采用1月齡大鼠通過高糖高脂飲食誘發(fā)高胰島素血癥和胰島素抵抗大鼠模型，再通過注射低劑量STZ破壞胰島功能，并繼續(xù)予以高脂高糖飼料誘發(fā)T2DM。大鼠在注射STZ后1周成模率達(dá)67.3%。在實(shí)驗(yàn)第6周后HDL、LDL、TG明顯增高，推測(cè)長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)刺激脂質(zhì)代謝紊亂，導(dǎo)致血管功能和結(jié)構(gòu)的改變；通過多條途徑對(duì)血管內(nèi)皮產(chǎn)生毒性作用，加速AS。光鏡下可見纖維帽，膠原纖維玻璃樣變、彈力纖維斷裂、大量泡沫細(xì)胞聚集等動(dòng)脈內(nèi)膜粥樣硬化典型病變。

運(yùn)用SD大鼠、Wistar大鼠進(jìn)行糖尿病大血管病變?cè)炷?，通常是利用高熱量飲食?lián)合化學(xué)藥物誘發(fā)T2DM，通過長(zhǎng)期高血糖狀態(tài)誘發(fā)脂質(zhì)代謝紊亂，損傷內(nèi)皮細(xì)胞以加速AS形成，建立糖尿病大血管病變模型。該方法通過高糖高脂飲食誘導(dǎo)大鼠胰島素抵抗后，再注射低劑量STZ部分損傷胰島β細(xì)胞，引發(fā)糖尿病大血管病變。鏈脲佐菌素(STZ)是氨基葡萄糖的亞硝脲衍生物，可選擇性破壞胰島β細(xì)胞，使大鼠誘發(fā)糖尿病，β細(xì)胞損傷的程度取決于STZ的劑量。采用STZ大劑量腹腔注射或STZ少量多次注射者，病理切片顯示胰島β細(xì)胞大量破壞，故認(rèn)為此方法誘發(fā)的糖尿病在發(fā)病機(jī)制上更接近于1型糖尿病[16]。目前認(rèn)為高糖高脂飲食聯(lián)合STZ復(fù)制出的糖尿病大血管病變動(dòng)物模型為較理想的模型。

3 自發(fā)性糖尿病模型與誘發(fā)性糖尿病模型對(duì)比

以GK大鼠為代表的自發(fā)性糖尿病模型，其病理特點(diǎn)與人類T2DM相似，且個(gè)體差異性較小，是T2DM病理生理研究最理想的動(dòng)物模型。但由于其飼養(yǎng)、繁殖條件嚴(yán)格、價(jià)格昂貴等因素，目前國內(nèi)尚未普及。而高糖高脂飲食聯(lián)合低劑量STZ誘發(fā)性糖尿病模型則與人類肥胖引起的糖尿病發(fā)病機(jī)制相似，具有實(shí)驗(yàn)周期短、造模成本較低等優(yōu)點(diǎn)，是國內(nèi)常用的T2DM建模方法。但由于大鼠對(duì)誘導(dǎo)劑的反應(yīng)不盡相同，導(dǎo)致個(gè)體間差異較大，故在保證成模率的前提下應(yīng)把控好STZ的劑量。

GK大鼠作為國際上公認(rèn)的自發(fā)性T2DM模型，由于其遺傳因素所決定的自發(fā)性糖尿病特征，比目前普遍使用的高糖高脂飲食誘導(dǎo)胰島素抵抗聯(lián)合化學(xué)損傷胰島β細(xì)胞的動(dòng)物模型更符合人類T2DM的病理生理，其具有個(gè)體差異小，血糖較為平穩(wěn)、可觀測(cè)性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)。

4 T2DM大血管病變?cè)炷＿^程中注意事項(xiàng)

在T2DM大血管病變的造模過程中，有以下三點(diǎn)值得注意：首先，在實(shí)驗(yàn)過程中，大鼠會(huì)在攝入高糖高脂飲食2周左右因過于油膩而影響胃口，導(dǎo)致大鼠體質(zhì)量增加減慢，可在進(jìn)食量少的白天給予5 g/只的普通飼料混合喂養(yǎng)，同時(shí)應(yīng)盡量保持飼料的干燥和香味。也有報(bào)道稱用果糖代替高糖高脂食物中的白糖會(huì)增加進(jìn)食量?；瘜W(xué)制劑STZ應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用、分批次配用，同時(shí)可用冰袋裝好保存以防失效過快。

其次，在造模實(shí)驗(yàn)中一般選用雄性大鼠。研究表明雄性老鼠更易出現(xiàn)高脂飲食所引起的血糖升高[17]。研究發(fā)現(xiàn)，雄性老鼠更容易受到高脂飲食介導(dǎo)的慢性炎癥的影響，而雌性老鼠在體質(zhì)量同樣增長(zhǎng)的情況下并沒有出現(xiàn)致病性炎癥[18-19]。

再者，目前對(duì)于大鼠T2DM成模的血糖標(biāo)準(zhǔn)尚未統(tǒng)一。大多數(shù)文獻(xiàn)以空腹血糖值作為診斷標(biāo)準(zhǔn)，空腹血糖標(biāo)準(zhǔn)在7.0～16.7 mmol/L之間均有報(bào)道，其中以空腹血糖大于11.1 mmol/L作為標(biāo)準(zhǔn)者居多。還有部分文獻(xiàn)以隨機(jī)血糖大于16.7 mmol/L作為大鼠T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn)。這種差異可能由于老鼠種屬不同所致[20-21]。

5 小結(jié)

綜上所述，動(dòng)物模型的建立首先必須符合臨床的各項(xiàng)指標(biāo)要求，并且具有標(biāo)準(zhǔn)性、可重復(fù)性、穩(wěn)定性及可靠性等特點(diǎn)。研究者通過充分了解T2DM大血管病變發(fā)病機(jī)制及造模過程中的相關(guān)影響因素，方可根據(jù)研究目的、研究方法、模型特點(diǎn)、實(shí)驗(yàn)條件、實(shí)驗(yàn)經(jīng)費(fèi)等具體情況，有針對(duì)性的選擇動(dòng)物種系、造模藥物、藥物濃度、給藥方式及造模時(shí)間等，建立高成功率的T2DM大血管病變大鼠模型，使糖尿病大血管病變大鼠造模更加標(biāo)準(zhǔn)化、客觀化，這對(duì)深入研究糖尿病大血管病變的發(fā)病機(jī)制及預(yù)防治療有著深遠(yuǎn)影響。