細胞外囊泡在胰腺癌中的作用研究進展

彭青俠，許小凡，段麗芳，張 紅,

(1.陜西中醫(yī)藥大學基礎醫(yī)學院，陜西 西安 712046;2.陜西中醫(yī)藥大學醫(yī)學科研實驗中心，陜西 西安 712046)

胰腺癌(pancreatic cancer，PC)是一種常見的惡性程度高且預后差的消化系統(tǒng)惡性腫瘤，據2018年全球癌癥統(tǒng)計學數據顯示，PC是世界上第七大最常見的惡性腫瘤，在美國和中國，分別是癌癥相關死亡的第四和第六大原因[1]。目前，手術在PC早期具有積極的治療意義，但由于大多數PC起病隱匿，無法實現(xiàn)早期發(fā)現(xiàn)，大多數患者確診時已處于疾病的中晚期，錯過了最佳的手術治療時期。早期檢出率低是PC患者預后差的主要原因之一[2]，此外，PC患者預后不良的主要原因還包括遠處轉移風險高、化學治療效果不理想等。因此，早期診斷、抑制轉移、探索有效的治療方法是PC治療中亟待解決的問題。近年來，細胞外囊泡(extracellular vesicle，EV)在PC發(fā)生、發(fā)展和治療中的作用引起了廣泛關注。本文對EV在PC發(fā)展、轉移以及診斷和治療中的研究進展進行綜述。

1 EV

EV可參與細胞通訊，在細胞間運輸DNA、RNA和蛋白質等物質。根據生物學特性或釋放途徑不同可將EV分為微囊泡(microvesicle，MV)、外泌體、內體和凋亡小體[3]。MV直接從細胞膜釋放，直徑為100 nm～1 μm[4]；外泌體直徑為30～120 nm，由細胞內多泡體釋放；內體主要由惡性組織細胞產生，直徑為1～10 μm；凋亡小體直徑為50 nm～2 μm，由凋亡細胞釋放[5]。EV幾乎由所有類型的細胞分泌，存在于多種體液，如血漿、唾液、尿液和母乳等[6]。盡管EV的確切生理作用還不清楚，但其被公認為可介導細胞間的特異性通訊，并激活細胞中信號通路的融合或相互作用[7]。大量研究證實，EV存在于腫瘤微環(huán)境(tumor micro-environment,TME)中，其主要功能是促進癌癥的發(fā)展、刺激血管生成、激活TME中的成纖維細胞、產生腫瘤轉移前的利基環(huán)境并抑制宿主免疫反應等[8-11]。

2 EV促進PC發(fā)展及轉移的機制

2.1 腫瘤細胞源性EV抑制免疫細胞功能免疫細胞浸潤腫瘤是TME的重要組成部分[12]。自然殺傷(natural killer，NK)細胞是先天性淋巴細胞，具有識別和清除病毒感染細胞和惡性細胞的能力[13]。但大量研究顯示，在TME中NK細胞處于功能失調狀態(tài)[14-15]。ZHAO 等[16]采用超速離心法從高轉移性PC細胞系L3.6pl 中分離出EV并與NK細胞共培養(yǎng)，結果發(fā)現(xiàn)，NK細胞中的天然殺傷基團2D、CD107a、腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、血清干擾素(interferon，INF)-γ以及CD71和CD98的表達水平降低，葡萄糖攝取能力受損，使得NK細胞對PC干細胞的細胞毒性減弱，提示PC細胞衍生的EV具有免疫抑制作用。SHEN等[17]研究發(fā)現(xiàn)，T淋巴細胞攝取PC外泌體后，PC外泌體可以通過激活p38絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)誘導內質網應激介導T淋巴細胞凋亡，最終導致免疫抑制。肥大細胞(mast cells，MCs)與過敏反應相關，多項研究表明，MCs在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用[18-19]。一方面，MCs釋放趨化因子和啟動免疫反應，可能根除腫瘤；另一方面，MCs釋放的血管生成因子、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和免疫抑制性細胞因子可為腫瘤提供支持性環(huán)境[20]。有研究發(fā)現(xiàn)，在重現(xiàn)細胞間接觸的條件下，癌細胞不但可以直接激活MCs，其驅動的EV還具有激活腫瘤周圍MCs的可能性[21-22]。以上研究說明，腫瘤源性EV可以通過多種途徑作用于多種免疫細胞，使機體免疫功能受到抑制，從而促進腫瘤的發(fā)展。

2.2 EV介導的特殊蛋白傳遞促進PC的轉移WEI等[23]研究發(fā)現(xiàn)，酪氨酸激酶Eph受體A2(tyrosine kinase Eph receptor A2，EphA2)在高轉移PC細胞Panc-1的外泌體中過表達，且EphA2可提高PC細胞的遷移能力。CHE等[24]研究發(fā)現(xiàn)，從表達組織因子的胰腺腫瘤細胞株中獲得的EV可通過產生活化因子X和裂解蛋白酶激活受體-1激活靜息內皮細胞，上調E-選擇素并誘導IL-8分泌，將靜息的內皮細胞轉化為活化的表型從而促進胰腺腫瘤細胞轉移。有研究發(fā)現(xiàn)，PC細胞PK-45H釋放的EV可增強PK-45P細胞MAPK通路的磷酸化，并通過MAPK依賴途徑刺激PK-45P細胞遷移，提示PC細胞釋放的EV可作用于周圍其他PC細胞，這可能是TME中腫瘤細胞轉移的重要誘因[25]。

2.3 EV促進腫瘤血管形成血管生成是從現(xiàn)有的內皮細胞中生成新的血管，并向腫瘤組織提供充足氧氣和營養(yǎng)的過程，在腫瘤的生長和轉移中發(fā)揮重要作用[26]。有研究發(fā)現(xiàn)，將人微血管內皮細胞(human microvascular endothelial cell，HMVEC)暴露于PC細胞系PANC-1衍生的攜帶miR-27a的外泌體中，攜帶miR-27a的PC細胞來源的外泌體可促進HMVEC的增殖、侵襲和血管生成；而將敲除miR-27a基因的PANC-1細胞植入裸鼠體內后，可抑制裸鼠體內PC腫瘤的形成和微血管密度，由此可見，攜帶miR-27a的細胞源性外泌體在PC血管生成中起著促進作用[27]。另有研究發(fā)現(xiàn)，與敲除膜聯(lián)蛋白 A1(annexin A1,ANXA1)的PC細胞MIA paca-2相比，野生型MIA paca-2細胞能釋放更多富含外泌體的EV，且細胞的遷移和侵襲能力更強；而與野生型MIA paca-2細胞釋放的 EV共培養(yǎng)后，敲除ANXA1的MIA paca-2細胞遷移和侵襲能力會顯著提高，且HMVEC 生成的更快，提示EV相關的ANXA1能夠促進PC細胞遷移、侵襲和血管生成[28]。COSTA-SILVA等[29]研究發(fā)現(xiàn)，與未發(fā)生轉移的胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)患者相比，發(fā)生肝臟轉移的PDAS患者的外泌體中巨噬細胞移動抑制因子(macrophage migration inhibitory factor，MIF)表達較高，其機制可能為庫普弗細胞(肝巨噬細胞)攝取PDAC衍生的外泌體，導致肝星狀細胞分泌轉化生長因子-β和上調纖維連接蛋白的表達，這種纖維化的微環(huán)境增強了骨髓源性巨噬細胞的募集，使促炎細胞因子MIF水平升高，促進腫瘤血管生成和增殖，從而導致肝轉移。

3 EV在PC診斷中的作用

EV是一種有前景的人類腫瘤診斷生物標志物。研究發(fā)現(xiàn)，EV蛋白標記物磷脂酰肌醇蛋白聚糖-1(glypican-1，GPC-1)單獨或聯(lián)合其他蛋白標記物，如表皮生長因子受體、上皮細胞黏附分子，可用于診斷PDAC[30]。MELO等[8]研究發(fā)現(xiàn)，GPC-1特異性地富集在癌細胞來源的外泌體上，PC患者血清中GPC-1聯(lián)合循環(huán)外泌體(circulating exosomes,crExos)具有絕對特異性和敏感性，可用于鑒別診斷健康人、胰腺良性疾病患者與早、晚期PC患者，提示GPC-1聯(lián)合crExos可能作為一種潛在的非侵入性診斷和篩查工具來檢測早期PC。但LUCIEN等[31]研究發(fā)現(xiàn)，PDAC患者血液中的GPC-1陽性EV和糖蛋白2/GPC-1陽性EV均有不同程度的表達，且與良性胰腺疾病患者比較差異無統(tǒng)計學意義，認為GPC-1陽性EV單獨或聯(lián)合糖蛋白2不能有效區(qū)分良性胰腺疾病患者和PC。因此，關于GPC-1是否可以成為PC診斷的生物學標志物，仍需進一步研究。

SHIN等[32]研究發(fā)現(xiàn)，轉染堿性磷酸酶胎盤樣蛋白2的PDAC panc-1細胞的生長和侵襲能力高于未轉染的 panc-1細胞，且堿性磷酸酶胎盤樣蛋白2在panc-1細胞中呈陽性表達,而在胰腺正常導管上皮細胞中未表達，提示堿性磷酸酶胎盤樣蛋白可作為早期診斷PDAC的生物標志物。LECA等[33]研究發(fā)現(xiàn)，膜聯(lián)蛋白A6/低密度脂蛋白受體相關蛋白1/血小板反應素1復合物可使PDAC細胞的侵襲能力提高，而PDAC相關成纖維細胞中缺乏ANXA6會抑制該復合體的形成，進而抑制PDAC的侵襲和轉移，同時還發(fā)現(xiàn)膜聯(lián)蛋白A6+EV僅存在于PDAC患者的血清中，提示膜聯(lián)蛋白A6可作為PDAC診斷的潛在生物標志物。

4 EV參與PC化學治療耐藥的誘導

吉西他濱(gemcitabine，GEM)單藥或聯(lián)合用藥仍是PC化學治療的一線方案，但患者對藥物的耐藥性是目前影響PC治療效果的關鍵因素之一[34]。有研究發(fā)現(xiàn)，使用GEM干預PC相關成纖維細胞后，外泌體的釋放顯著增加；將PC相關成纖維細胞釋放的外泌體與PC細胞共培養(yǎng)后發(fā)現(xiàn)，PC細胞中耐藥誘導因子Snail的表達和PC細胞的增殖能力升高；而用外泌體釋放抑制劑GW4869干預PC相關成纖維細胞后，可顯著降低該細胞的存活率，表明癌相關成纖維細胞外泌體在PC化學治療耐藥中起促進作用，也顯示了外泌體抑制劑與化學治療藥物聯(lián)合克服PDAC化學治療耐藥的潛力[35]。YANG等[36]研究發(fā)現(xiàn)，GEM抗性PC細胞來源的外泌體可通過miR-210介導GEM敏感的PC細胞的耐藥性。

FAN等[37]從3株表現(xiàn)出不同程度GEM耐藥的PC細胞系(panc-1、MIA-PaCa-2和BxPC-3)中分離出外泌體，檢測外泌體在這些細胞系間的耐藥性傳播能力，結果顯示，耐藥性PANC-1細胞的外泌體增加了MIA PaCa-2和BxPC-3細胞的GEM抗性；與MIA-PaCa-2和BxPC-3細胞相比，panc-1細胞的外泌體過表達了外泌體EphA2；在panc-1細胞中，敲除EphA2基因抑制了其向MIA-PaCa-2和BxPC-3細胞傳遞外泌體介導的耐藥性；表明外泌體EphA2可以傳遞耐藥性。

5 EV在PC中的潛在治療作用

KIMURA等[38]研究發(fā)現(xiàn)，不同表位的抗分泌細胞骨架相關蛋白4(cytoskeleton-associated protein 4，CKAP4)單抗對Dickkopf1和CKAP4的結合、蛋白激酶B活性以及PDAC細胞的增殖和遷移均有抑制作用，且具有良好的抗腫瘤效果，因此推測抗CKAP4單抗可用于PC的分子靶向治療和輔助診斷。YING 等[39]研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤常見致癌基因KRAS的突變形式是PC的關鍵驅動因素，同時也是一個具有挑戰(zhàn)性的PC治療靶點。KAMERKAR等[40]將來自正常成纖維細胞樣間充質細胞的外泌體設計成攜帶短干擾RNA或短發(fā)夾RNA(工程外泌體)，可靶向于特異性致癌基因KrasG12D(這是PC中常見的突變基因)。研究發(fā)現(xiàn)，工程外泌體治療可顯著抑制PC小鼠腫瘤生長并顯著提高小鼠的總生存率，此研究提供了一種使用工程外泌體直接和特異性靶向PC中致癌基因KRAS的方法[40]。

6 小結

EV在介導PC進展和轉移中發(fā)揮多重作用，可作為治療PC的潛在靶點。盡管大量研究都強調了EV在胰腺組織生理和病理條件下的潛在重要作用，但其作為PC早期診斷的生物標志物的相關性研究仍非常局限。這在很大程度上是由于分離高濃度EV存在困難性。目前，關于EV的研究面臨的主要挑戰(zhàn)之一是缺乏標準化和特征化的分離方法，因此，開拓高質量、標準化的EV的提取方法，是EV研究中最亟待解決的問題。