菌斑微生物群落構(gòu)成變化與兒童齲病相關(guān)研究進(jìn)展

周慶楠， 尚佳健

首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京口腔醫(yī)院兒童口腔科，北京（100050）

齲病是常見的兒童口腔疾病，我國(guó)兒童齲病高發(fā)，根據(jù)第四次全國(guó)口腔健康流行病學(xué)調(diào)查報(bào)告［1］，3 歲、4 歲、5 歲兒童的患齲率分別為50.8%、63.6%、71.9%，相較于第三次流調(diào)結(jié)果呈上升趨勢(shì)，患齲狀況不容樂觀。兒童齲病存在患病率高、進(jìn)展快的特點(diǎn)，容易發(fā)展為多發(fā)齲，治療后仍有較高的復(fù)發(fā)率。細(xì)菌是齲病發(fā)生的始動(dòng)因素，以變異鏈球菌為代表的產(chǎn)酸菌以及個(gè)別致齲菌落一直被認(rèn)為是齲病的主要病因，生態(tài)菌斑學(xué)說的提出，強(qiáng)調(diào)了口腔微生物群落整體平衡的維系，微生物區(qū)系平衡的改變才會(huì)導(dǎo)致齲病發(fā)生。第二代測(cè)序技術(shù)、宏基因組學(xué)等現(xiàn)代分子生物學(xué)手段的應(yīng)用，使得口腔微生物群落在兒童齲病發(fā)生發(fā)展過程中的具體作用機(jī)制得以探究，為齲病病因?qū)W研究和齲病的微生態(tài)防治提供了新的思路。學(xué)者們發(fā)現(xiàn)患齲和無齲兒童菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)存在差異，在不同患齲程度兒童的菌斑中優(yōu)勢(shì)菌種類也不同，菌斑微生物群落變化與兒童齲病密切相關(guān)，本文將針對(duì)相關(guān)研究進(jìn)行綜述。

1 生態(tài)菌斑學(xué)說

菌斑生物膜在齲病發(fā)生過程中起到至關(guān)重要的作用。Marsh［2］經(jīng)過大量研究，提出生態(tài)菌斑學(xué)說，認(rèn)為菌斑微生物區(qū)系平衡的改變導(dǎo)致齲病發(fā)生。微生物間、宿主與牙菌斑間的相互作用共同維持微生態(tài)的動(dòng)態(tài)平衡，但當(dāng)局部環(huán)境因素的改變超過了微生態(tài)的調(diào)節(jié)能力，動(dòng)態(tài)平衡被打破，致齲菌的數(shù)量增多致使齲病發(fā)生。這一學(xué)說得到了眾多學(xué)者的研究支持，在正常部位通?？梢詸z測(cè)到少量的假定病原體，患齲牙面菌斑生物膜的微生物區(qū)系不同于健康牙面菌斑生物膜。Takahashi等［3］同樣認(rèn)為，不同階段和部位齲損的主要齲病相關(guān)微生物群落的變化是由環(huán)境生態(tài)因素決定的。齲齒可能是由微生物群落構(gòu)成變化引起的，牙菌斑微生態(tài)失衡，使得致齲菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，從而導(dǎo)致齲病發(fā)生。微生態(tài)學(xué)和生態(tài)菌斑學(xué)說從微生物角度探索齲病發(fā)生發(fā)展過程中的口腔微生物區(qū)系構(gòu)成變化，為齲病病因?qū)W研究和齲病預(yù)防提供了新的切入點(diǎn)。

2 與兒童齲病相關(guān)的菌斑微生物群落變化

齲病的發(fā)生發(fā)展是動(dòng)態(tài)變化過程，對(duì)不同程度齲病菌群構(gòu)成差異、齲病發(fā)生過程中口腔微生物區(qū)系構(gòu)成的縱向研究可以為齲病病因?qū)W提供更有價(jià)值的信息。

2.1 口腔核心微生物群

對(duì)菌斑和唾液微生物組成的高通量研究顯示，正常的人類口腔微生物區(qū)系一旦建立，可在幾個(gè)月甚至幾年內(nèi)保持穩(wěn)定［4］，口腔微生物區(qū)系在8～32 個(gè)月齡時(shí)具有較高的個(gè)體內(nèi)相似性［5］，提示口腔微生物可能存在核心微生物群維持結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。肖小芬等［6］通過主成分分析發(fā)現(xiàn)學(xué)齡前無齲、低齡兒童齲（early childhood caries，ECC）、重度低齡兒童齲（serious early childhood caries，SECC）組牙菌斑的微生物組成在系統(tǒng)發(fā)育上相同，總體微生物構(gòu)成相似，共有的9 個(gè)優(yōu)勢(shì)菌屬包括纖毛菌屬、鏈球菌屬、二氧化碳噬纖維菌屬、奈瑟菌屬、放線菌屬、韋榮菌屬等；阮文華等［7］發(fā)現(xiàn)變形菌門、厚壁菌門、擬桿菌門、放線菌門以及肺炎鏈球菌、乳糖奈瑟氏菌、流感嗜血桿菌等在無齲和重度齲病兒童唾液微生物中均為高豐度生物類群。核心微生物群的存在為生態(tài)菌斑學(xué)說提供了證據(jù)支持，在平衡狀態(tài)下口腔微生物共同維持口腔健康，環(huán)境的改變使微生物組成變化，無齲菌斑轉(zhuǎn)化成致齲菌斑，導(dǎo)致齲病發(fā)生，致病菌群為機(jī)會(huì)致病菌或條件致病菌。

口腔核心微生物群的構(gòu)成由于采集位置不同、樣本人群生活飲食差異、分析方式的不同等，眾多研究得到的結(jié)果不盡相同，核心微生物群的構(gòu)成也會(huì)隨著齲病的發(fā)展而變化［8］。在大樣本人群中進(jìn)一步驗(yàn)證口腔核心微生物群的存在，探究無齲狀態(tài)下菌斑微生物組成，是齲病病因?qū)W研究和生態(tài)防治的重點(diǎn)。

2.2 齲病的發(fā)生伴隨著菌斑微生物群落多樣性的下降

目前國(guó)內(nèi)外眾多學(xué)者應(yīng)用現(xiàn)代分子生物學(xué)手段，對(duì)有齲和無齲兒童口腔菌斑微生物群落的差異進(jìn)一步研究。黃春雅［9］等應(yīng)用基因芯片雜交技術(shù)檢測(cè)牙菌斑菌屬，發(fā)現(xiàn)齲病組細(xì)菌的種系型少于無齲組，經(jīng)過進(jìn)一步的種屬差異分析，相比有齲組在進(jìn)化分支圖中分屬有限的門、屬，無齲組的細(xì)菌分布更為廣泛，具有更明顯的微生物多樣性。Hurley 等［10］發(fā)現(xiàn)齲壞牙本質(zhì)部位菌斑內(nèi)微生物群落多樣性顯著低于齲病和無齲兒童唾液內(nèi)微生物群落多樣性水平，在年輕恒牙中也發(fā)現(xiàn)隨著牙齒從健康到脫礦為白堊斑、成洞化改變和牙本質(zhì)深層病變的發(fā)展，微生物群落多樣性水平顯著降低［11］。

Tian 等［12］觀察到在接受治療后的兒童齲病無復(fù)發(fā)組菌斑微生物的豐富度和多樣性高于齲病復(fù)發(fā)組，齲病復(fù)發(fā)時(shí)兩組的菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著不同。在唾液微生物區(qū)系中也觀察到ECC 在有無復(fù)發(fā)時(shí)微生物群落結(jié)構(gòu)有顯著不同，微生物多樣性在ECC 復(fù)發(fā)和進(jìn)展過程中呈下降趨勢(shì)［8］。

Tao 等［5］監(jiān)測(cè)SECC 發(fā)生過程中口腔微生物群落動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)齲病的發(fā)生伴隨著微生物多樣性的下降，與無齲兒童相比，SECC 兒童的菌斑微生物多樣性有所下降，在齲病發(fā)生前至少6 個(gè)月檢測(cè)到微生物豐富度下降。另一研究也表明菌斑中的微生物豐富度在齲齒發(fā)生前6 個(gè)月時(shí)就已經(jīng)下降，DGGE 圖譜在從無齲狀態(tài)到齲齒狀態(tài)的發(fā)展過程中觀察到了顯著的變化，初步證實(shí)了微生物豐富度的降低與齲病的發(fā)生有關(guān)［13］。

Teng 等［14］認(rèn)為微生物區(qū)系的改變?cè)缬邶x病癥狀的發(fā)生，最深刻的變化發(fā)生在ECC 開始時(shí)，而不是ECC 進(jìn)展期間。他認(rèn)為，在ECC 開始時(shí)（宿主癥狀尚未檢測(cè)到時(shí)），微生物多樣性隨著ECC 嚴(yán)重程度變化而顯著增加；但在齲病進(jìn)展階段（宿主癥狀可檢測(cè)到時(shí)），微生物多樣性趨于穩(wěn)定。微生物區(qū)系空間和時(shí)間上的變化可以用于菌斑相關(guān)疾病的預(yù)測(cè)建模，并成功預(yù)測(cè)了齲病的發(fā)生。

根據(jù)生態(tài)菌斑學(xué)說，長(zhǎng)期高糖飲食致微生物大量產(chǎn)酸且超過唾液緩沖能力時(shí)，菌斑中對(duì)酸性環(huán)境敏感的細(xì)菌（如血鏈菌、口腔鏈球菌等）生長(zhǎng)被抑制，而產(chǎn)酸耐酸菌的革蘭氏陽(yáng)性菌（如變異鏈球菌和乳酸桿菌等）因競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)則大量繁殖，成為牙菌斑微生物區(qū)系中的優(yōu)勢(shì)菌群，維持牙菌斑的致齲性，各細(xì)菌間比例改變，菌群成分由平衡狀態(tài)向脫礦能力強(qiáng)傾斜，當(dāng)pH 低于脫礦臨界值時(shí)，牙體硬組織脫礦，能夠在惡劣條件下生存的微生物數(shù)量不斷減少，菌斑微生物群落多樣性減少，不斷惡性循環(huán)，齲壞發(fā)生。這些研究證實(shí)了齲病微生物學(xué)的生態(tài)破壞模型，為齲病監(jiān)測(cè)、針對(duì)性設(shè)計(jì)更有效的干預(yù)措施提供新的研究方向。

2.3 齲病特異性生物標(biāo)記物

根據(jù)以往的報(bào)道，行為因素和微生物因素均與齲病的發(fā)展有關(guān)，從微生物角度來看，齲病是由多菌種構(gòu)成的致病群落引起的，對(duì)微生物多樣性進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，盡管有齲組、無齲組有許多共同的類群，患齲和無齲兒童的微生物群落結(jié)構(gòu)、組間菌群存在統(tǒng)計(jì)學(xué)意義上的顯著分離，代表了不同的菌斑微生物群落。厚壁菌門、變形菌門、放線菌門、擬桿菌門、梭桿菌門5 個(gè)主要優(yōu)勢(shì)菌門在不同程度齲病組菌斑中都占有97%以上的序列數(shù)，且隨著年齡的改變這些種群的轉(zhuǎn)換在ECC、SECC 患者中基本上未發(fā)生有差異的改變［15］，表明包含這些菌群在內(nèi)的菌斑與齲病的進(jìn)展高度相關(guān)；Xu等［8］發(fā)現(xiàn)以普氏菌屬、奈瑟氏菌屬、威氏菌屬、鏈球菌屬等為主的11 個(gè)菌屬在有齲無齲組間顯示出不同的相對(duì)豐度；相反，細(xì)毛菌屬、羅氏菌屬、棒狀桿菌屬、放線菌屬、血液鏈球菌屬、心臟桿菌屬和TM7 屬常在無齲人群菌斑中被發(fā)現(xiàn)，通常含量較高，證實(shí)與無齲狀態(tài)相關(guān)［16-18］。

因此有學(xué)者認(rèn)為致齲微生物組和正常微生物組在群落結(jié)構(gòu)和基因功能上有顯著的鑒別特征，差異菌屬及其在內(nèi)的牙菌斑微生物群落可能與兒童齲病的發(fā)生有關(guān)，可能潛在地存在一個(gè)不同的致齲群落，可以作為齲病防治的生物標(biāo)記，最終可以被識(shí)別并用于齲病診斷、監(jiān)測(cè)和預(yù)后。

2.3.1 鏈球菌、乳桿菌、放線菌（Streptococcus、Lactobacillus、Actinomyces） 齲齒是由菌斑生物膜群落內(nèi)菌群的改變?cè)斐傻?，產(chǎn)酸菌一直被認(rèn)為是齲病的病原菌，了解多種產(chǎn)酸菌屬在菌斑微生物群落中的分布、構(gòu)成改變與齲病發(fā)生間的關(guān)系對(duì)于制定生物干預(yù)措施非常重要。

研究發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬在有齲、無齲兒童牙菌斑中含量差異明顯，為齲病優(yōu)勢(shì)菌屬；在白堊斑病變、開放性牙本質(zhì)齲或牙釉質(zhì)-牙本質(zhì)齲（隱性齲）中均表現(xiàn)出較高的豐度，表現(xiàn)出與齲病的相關(guān)性［6，19］。變異鏈球菌是鏈球菌屬中的一種，被公認(rèn)為是主要致齲菌之一，Agnello 等［20］發(fā)現(xiàn)患有SECC的原住民兒童與無齲兒童相比，菌斑微生物群落明顯不同，SECC 組菌斑中可以檢測(cè)到極高豐度的變異鏈球菌。但因人群特征以及分析手段的不同，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)齲病發(fā)生時(shí)，菌斑中的鏈球菌相對(duì)豐度下降［21］；在許多健康受試者中，變異鏈球菌的含量高于在白堊斑病變、牙本質(zhì)齲壞病損中檢測(cè)到的水平［11，17］。不同程度齲病患者的菌斑中高豐度的變異鏈球菌并不總是存在［22］，其在群落中的百分比與齲病從健康到深齲的進(jìn)展程度不是呈線性相關(guān)的［11］，因此有學(xué)者認(rèn)為變異鏈球菌的含量水平與齲病嚴(yán)重程度并無顯著的相關(guān)性，流行病學(xué)及齲風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估資料也顯示近幾十年以變異鏈球菌為主要對(duì)象的控齲手段收效甚微［23］。

變異鏈球菌是許多（但不是全部）齲病患者的優(yōu)勢(shì)菌種，它與其他生物體相互作用，形成一種動(dòng)態(tài)的、協(xié)調(diào)一致的多微生物群落，在特定狀況下形成致齲生物膜［21］，這與生態(tài)菌斑學(xué)說一致，導(dǎo)致齲病發(fā)生的酸可能來自幾種產(chǎn)酸菌中的任何一種或全部，變異鏈球菌只是作為復(fù)雜的致齲微生物群落中的一部分出現(xiàn)。不同類型、不同基因型的鏈球菌可能在兒童早期齲病中起重要作用，在未檢出或僅檢測(cè)到低水平變異鏈球菌的受試者中，唾液鏈球菌、戈登鏈球菌水平的升高被證實(shí)與齲病有關(guān)［9］。在以遠(yuǎn)緣鏈球菌為主的大多數(shù)樣本中，也存在低水平的變異鏈球菌，在一名患有活動(dòng)性齲齒的受試者中，隨著時(shí)間的推移，觀察到變異鏈球菌被遠(yuǎn)緣鏈球菌所取代［24］。這些菌種與齲病的關(guān)系還有待于進(jìn)一步的研究，可能這些菌種是變異鏈球菌的替代病原菌，推測(cè)其致齲機(jī)制并不是通過單純的變異鏈球菌含量升高而導(dǎo)致齲病，可能是與整個(gè)微生物群落結(jié)構(gòu)變化相關(guān)，但目前的研究尚不足以證明。

乳桿菌是齲活躍兒童齦上菌斑中的主要微生物組成之一，與齲病進(jìn)展有關(guān)［25-26］。Gross 等［11］發(fā)現(xiàn)菌斑中的乳桿菌和丙酸桿菌水平隨著齲病嚴(yán)重程度的增加而顯著升高，與無齲狀態(tài)相比，在齲壞牙本質(zhì)部位的菌斑中，變異鏈球菌水平下降，乳桿菌水平急劇上升，乳桿菌在齲病過程的后期成為優(yōu)勢(shì)菌群。乳桿菌在群落中的比例隨著齲病從牙釉質(zhì)病變進(jìn)展為牙本質(zhì)病變而顯著升高［27］，在齲病患者健康牙面的菌斑中很少發(fā)現(xiàn)，齲壞早期白堊斑病變中，也幾乎沒有乳桿菌存在，證明依賴于乳桿菌的微生物篩查試驗(yàn)對(duì)已發(fā)生齲病的診斷具有較高特異性［11］。Sidhu 等［27］研究發(fā)現(xiàn)，兒童長(zhǎng)期攝入一定量的益生菌如雙歧桿菌、鼠李糖乳桿菌、羅伊氏乳桿菌等，可明顯降低口內(nèi)變異鏈球菌的水平，抑制口腔內(nèi)致病菌的生長(zhǎng)，從而抑制齲病的發(fā)展。變異鏈球菌與乳桿菌之間的相互作用具體機(jī)制不詳，有乳桿菌是弱粘附的，因而需要依賴變異鏈球菌和其他產(chǎn)酸菌來啟動(dòng)齲損的觀點(diǎn)，也有乳桿菌具有抗菌特性，并能抑制變異鏈球菌的生長(zhǎng)的觀點(diǎn)。這也在一定程度上佐證了生態(tài)菌斑學(xué)說，菌群間相互作用致使微生物群落構(gòu)成發(fā)生改變，從而導(dǎo)致了齲病的發(fā)生發(fā)展過程。

放線菌屬作為早期定植于齦上菌斑的菌屬之一，多在無齲患者中豐度較高，往往被認(rèn)為與兒童齲病呈負(fù)相關(guān)，被證實(shí)與健康有關(guān)［16-17］，在幼兒中進(jìn)行的一項(xiàng)縱向研究也表明隨著齲病程度加重，放線菌屬豐度減少［24］。但同時(shí)也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)SECC 和ECC 兒童菌斑和唾液中放線菌的豐度水平高于健康兒童［28］，人群特征以及所應(yīng)用的檢測(cè)手段等因素不同可能導(dǎo)致不同實(shí)驗(yàn)結(jié)果，現(xiàn)有證據(jù)只能表明放線菌屬作為兒童齲病的生物標(biāo)記物敏感性有限。

2.3.2 韋榮球菌（Veillonella） 有研究顯示韋榮球菌屬在齲活躍者口腔中的相對(duì)豐度較無齲者高［29］，在無患齲史的兒童口腔中，韋榮球菌豐度較高者后來患齲率更高［30］，進(jìn)一步說明韋榮球菌與兒童齲病相關(guān)。韋榮球菌被認(rèn)為是口腔生物膜中的橋梁生物，可利用乳酸作為能量來源，這一特性曾被認(rèn)為可抑制齲病發(fā)展進(jìn)程，但并未得到充分證實(shí)［31］。它依賴于產(chǎn)生大量乳酸的鏈球菌，其分布水平與乳桿菌、變異鏈球菌和放線菌等產(chǎn)酸菌的分布存在高度相關(guān)性［32］，證據(jù)表明，韋榮球菌水平與齲損高度相關(guān)［28］，為致齲條件下菌群的優(yōu)勢(shì)成員之一，可以在低pH 值環(huán)境下，誘導(dǎo)變異鏈球菌等優(yōu)勢(shì)產(chǎn)酸菌代謝產(chǎn)酸［29］，促進(jìn)變異鏈球菌的生長(zhǎng)［31］，可作為齲病早期的預(yù)警生物標(biāo)記物，預(yù)測(cè)齲病發(fā)生［29-30］。在致齲環(huán)境中，該菌屬中只有部分菌種具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)而得以長(zhǎng)期存活，這部分菌種對(duì)齲病的意義值得研究。目前韋榮球菌在齲病發(fā)生中的作用及相關(guān)機(jī)制尚不明確，但其高耐酸能力、在牙菌斑形成中的作用、在齲患口腔及齲壞位點(diǎn)的高豐度水平等特點(diǎn)提示其在齲病發(fā)生機(jī)制的探討中不可忽略。

2.3.3 普雷沃菌屬（Prevoella） 普雷沃菌屬是革蘭氏陰性厭氧菌，主要發(fā)酵產(chǎn)物包括乙酸和少量的乳酸，常被認(rèn)為是牙周疾病的優(yōu)勢(shì)菌屬，但有研究表明其也可能是齲病優(yōu)勢(shì)菌屬［26］，在齲病活躍期牙本質(zhì)微生物群落中，可以檢測(cè)到高豐度的普雷沃菌屬，提示其可能與齲病發(fā)生有關(guān)［10］。Teng等［14］發(fā)現(xiàn)在6～12 個(gè)月觀察期內(nèi)出現(xiàn)齲齒的人群中，普雷沃菌屬的豐度水平顯著高于6～12 個(gè)月持續(xù)保持健康的人群，認(rèn)為其具有ECC 生物標(biāo)記物的潛力，可起到齲病預(yù)測(cè)模型中的關(guān)鍵標(biāo)記作用；Zhu 等［33］研究表明唾液中普雷沃菌屬的相對(duì)豐度及其與梭桿菌、細(xì)毛菌等的組合對(duì)ECC 復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性較好，具有預(yù)測(cè)潛力。作為與菌斑微生物群落相關(guān)的兩種疾病，目前齲病和牙周疾病相互影響機(jī)制尚不清楚，普雷沃菌屬在兩種疾病中的高豐度表達(dá)值得進(jìn)行深入研究，以探究其作為生物標(biāo)記物的優(yōu)勢(shì)和潛力。

3 小 結(jié)

隨著分子生物學(xué)技術(shù)和微生物功能基因組學(xué)的發(fā)展進(jìn)步，學(xué)者們得以對(duì)菌斑微生物群落中細(xì)菌的種群分布、微生物多樣性、可能的齲病生物標(biāo)記物及致齲機(jī)制進(jìn)行了更深入的探討，但目前口腔微生物群落在齲病發(fā)生中的作用和機(jī)制尚未闡明，仍有很大的研究空間。深入了解齲病發(fā)生過程中口腔微生態(tài)和菌斑微生物群落結(jié)構(gòu)變化，將從微生物角度進(jìn)一步揭示齲病病因；關(guān)注齲病發(fā)生乃至發(fā)生前微生物多樣性的變化，構(gòu)建正常和齲病兒童菌斑微生物圖譜，篩選特異性的齲病生物標(biāo)記物，將有助于控制與管理兒童口腔微生態(tài)，為兒童齲病監(jiān)測(cè)、生態(tài)防齲和患齲風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估，提供新的方向及治療構(gòu)想。

【Author contributions】Zhou QN collected the references, and wrote the article, Shang JJ revised the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.