蛋黃餾油納米類成分治療濕疹的藥效評價(jià)及機(jī)制研究

鐘琪 趙金莉 李偉洋 寇秘榔 劉楚妤 趙琰 屈會(huì)化 孔慧

摘要 目的：探索蛋黃餾油中納米類成分治療濕疹的作用及其機(jī)制。方法：蛋黃餾油經(jīng)過水萃取，得到富含納米類成分的蛋黃餾油水溶液（EYO-CDs）。利用2，4-二硝基氯苯乙醇溶液建立小鼠慢性濕疹模型，以復(fù)方醋酸地塞米松乳膏為陽性對照，評價(jià)EYO-CDs治療濕疹的作用及機(jī)制。結(jié)果：EYO-CDs能減輕慢性濕疹小鼠耳腫脹度，降低血清及組織中白細(xì)胞介素-4（IL-4），白細(xì)胞介素-17（IL-17）及升高γ干擾素（INF-γ）水平。HE染色結(jié)果顯示，給藥后耳組織表皮角化、水腫、淋巴細(xì)胞浸潤、真皮血管擴(kuò)張充血等病理現(xiàn)象均有不同程度緩解。治療效果與給藥濃度具有一定的量效關(guān)系。結(jié)論：蛋黃餾油中的EYO-CDs對小鼠慢性濕疹具有治療作用，主要通過抑制炎癥介質(zhì)，調(diào)節(jié)免疫因子起效，為臨床推廣應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

關(guān)鍵詞 蛋黃餾油;炭點(diǎn);蛋黃餾油水溶液;表征;濕疹;白細(xì)胞介素-4;白細(xì)胞介素-17;γ干擾素

Abstract Objective：To explore the effect and mechanism of nano-components in distilled egg yolk in the treatment of eczema.Methods：Distillate egg yolk was extracted with water to obtain an aqueous solution of distilled egg yolk（EYO-CDs） rich in nano-components.A mouse model of chronic eczema was established with 2，4-dinitrochlorobenzene alcohol solution，and the compound dexamethasone acetate cream was used as a positive control to evaluate the action and mechanism of EYO-CDs in the treatment of eczema.Results：EYO-CDs can reduce ear swelling in mice with chronic eczema，reduce interleukin-4（IL-4），interleukin-17（IL-17） and increase interferon-γ（INF-γ） in serum and tissues.The results of HE staining showed that pathological phenomena such as epidermal keratosis，edema，lymphocyte infiltration，dermal vasodilation and congestion in ear tissues were relieved to varying degrees after administration.The therapeutic effect has a certain dose-effect relationship with the administration concentration.Conclusion：EYO-CDs in distilled egg yolk has a therapeutic effect on chronic eczema in mice，mainly by inhibiting inflammatory factors and regulating immune factors，providing experimental evidence for clinical application.

Keywords Egg yolk oil; Carbon dots; EYO-CDs; Characterization; Eczema; IL-4; IL-17; INF-γ

中圖分類號：R284;R751文獻(xiàn)標(biāo)識碼：Adoi：10.3969/j.issn.1673-7202.2021.20.008

濕疹是一種常見的過敏性炎癥性皮膚病，近年來發(fā)病率急劇增高，占皮膚科門診病例的15%～30%[1]，發(fā)病人群廣，可發(fā)于任何年齡性別，發(fā)病部位不一，甚至全身發(fā)病。其主要特點(diǎn)呈現(xiàn)為劇烈瘙癢，呈現(xiàn)多種形態(tài)的皮損，具有滲出傾向，急性與慢性反復(fù)發(fā)作，容易慢性化[2]。因其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，內(nèi)在因素與外在因素相互作用是誘發(fā)本病的主要原因。治療濕疹多用抗組胺藥，激素類藥物等，雖短期內(nèi)可改善瘙癢和皮損癥狀，但是停藥后容易復(fù)發(fā)，或產(chǎn)生耐藥現(xiàn)象導(dǎo)致復(fù)發(fā)，長期使用易造成毛細(xì)血管擴(kuò)張、皮膚萎縮、色素沉著等[3]。

濕疹在中醫(yī)學(xué)屬于“濕瘡”“浸淫瘡”等范疇。中醫(yī)治療濕疹具有悠久的歷史，積累了豐富的臨床經(jīng)驗(yàn)，不僅能有效改善濕疹癥狀，而且降低復(fù)發(fā)率，治療宜內(nèi)外兼顧，然而中藥外用散劑或霜?jiǎng)?、軟膏等種類還不夠豐富，因此開發(fā)使用方便、療效顯著、無不良反應(yīng)、安全性高的中藥外用制劑能夠?yàn)榕R床提供一種新的選擇。

蛋黃油為雉科動(dòng)物家雞鮮卵的卵黃提取物[4]，主要含有卵磷脂、脂肪酸、膽固醇、葉酸、胡蘿卜素、鈣、磷、鐵等多種藥用和營養(yǎng)成分[5]?，F(xiàn)代臨床實(shí)驗(yàn)證明蛋黃餾油具有保護(hù)和營養(yǎng)皮膚黏膜，促進(jìn)創(chuàng)面愈合的作用，可治療多種皮膚和黏膜疾病[6]。傳統(tǒng)的蛋黃餾油是用干餾法制備而得，其工藝簡單但是難以去除毒性致癌物苯并[α]芘和強(qiáng)烈的焦臭味，制約了臨床應(yīng)用，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)蛋黃餾油中含有納米類成分[7]。為探索蛋黃餾油納米類成分是否為治療濕疹的物質(zhì)基礎(chǔ)。本實(shí)驗(yàn)用萃取法得到蛋黃餾油水溶性成分，并對萃取液中碳納米類成分（EYO-CDs）進(jìn)行表征，通過建立小鼠慢性濕疹模型，觀察EYO-CDs對慢性濕疹小鼠的治療作用，檢測血清及皮膚組織中白細(xì)胞介素-4（IL-4）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）和γ干擾素（IFN-γ）的含量變化，為研究蛋黃餾油治療濕疹的物質(zhì)基礎(chǔ)打開了新視野。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級ICR小鼠，2 025 g，78周齡，雄性（倫理審批號：BUCM-4-2019121201-4081，購于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0006），飼養(yǎng)于安靜的環(huán)境，室內(nèi)溫度（24±1）℃，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.1.2 藥物 蛋黃粉（北京奧博星生物科技有限責(zé)任公司，批號：20200827）;復(fù)方醋酸地塞米松乳膏（華潤三九醫(yī)藥股份有限公司，批號：1904019X）;2，4-二硝基氯苯（北京伊諾凱科技有限公司，批號：10220820）。

1.1.3 試劑與儀器 IL-4試劑盒;IL-17試劑盒;INF-γ試劑盒（武漢云克隆科技技術(shù)有限公司，批號：191029753），馬弗爐（北京中科奧博科技有限公司，型號：PXR-9）;TecnaiG220低分辨透射電子顯微鏡（FEI公司，美國，型號：TecnaiG220）;CECI紫外分光光度計(jì)（CECI公司，英國，型號：CECIL）;F-4500熒光分光光度計(jì)（Thermo公司，美國，型號：F-4500）;離心機(jī)（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司，型號：HC-2518R）;電子天平（賽多利斯，德國，型號：BS124-S）

1.2 方法

1.2.1 分組與模型制備 選取SPF級ICR小鼠42只，隨機(jī)分為6組，每組7只，分別為空白組，2，4-二硝基氯苯（DNCB）致慢性濕疹模型組，復(fù)方醋酸地塞米松乳膏陽性藥對照組，按照人的外用劑量對小鼠用藥劑量進(jìn)行換算EYO-CDs低10.8 g/mL、中21.6 g/mL、高43.2 g/mL劑量組[8]。實(shí)驗(yàn)前1 d小鼠腹部脫毛2 cm×2 cm。除空白組外，其余各組小鼠均于實(shí)驗(yàn)第1天在腹部脫毛處涂以7%DNCB乙醇溶液100 μL致敏。第5天在小鼠右耳內(nèi)外側(cè)耳面及腹部脫毛處均勻給以1%DNCB乙醇溶液10 μL進(jìn)行激發(fā)，此后每隔1 d激發(fā)1次，共激發(fā)4次。

1.2.2 給藥方法 初次激發(fā)24 h后，各組小鼠右耳正反面給藥，空白組和模型組給生理鹽水10 μL，陽性藥組給復(fù)方醋酸地塞米松乳膏20 mg/耳，EYO-CDs組分別按低中高劑量給藥，每只10 μL，此后每隔1 d給藥1次，共給藥4次。末次給藥后24 h摘眼球取血，隨后處死小鼠，切取雙耳，檢測相應(yīng)指標(biāo)。

1.2.3 蛋黃餾油萃取液的制備 按照前期確定的蛋黃餾油制備工藝燒制蛋黃油并制備EYO-CDs[7]。制備過程如下：稱取蛋黃粉60 g，放入坩堝中，鋁箔紙密封并加蓋后放入馬弗爐中燒制。1 h內(nèi)將溫度升至260 ℃，維持1 h，然后冷卻到室溫，從坩堝底部提取蛋黃油（大約25 mL或25 g）。用去離子水的（DW）萃取4次，合并水溶液部分，濃縮至與蛋黃餾油原始體積一致（濃度2.4 g/mL），4 ℃保存，留置待用。

1.2.4 EYO-CDs的表征 通過TEM觀察EYO-CDs的外貌形態(tài)、粒徑分布，微觀結(jié)構(gòu)特征利用HR-TEM觀察。具體操作如下：EYO-CDs水溶液倍比稀釋后離心，過濾，然后取少量待測樣品放置在銅網(wǎng)格上，自然風(fēng)干。將銅網(wǎng)放置于TEM中觀察其形貌，粒徑分布及結(jié)構(gòu)特征。用紫外分光光度法和熒光分光光度法分析EYO-CDs的光學(xué)特征。紫外分光光度計(jì)開機(jī)預(yù)熱，先取3 mL去離子水于石英比色皿中，測定基線，再將EYO-CDs水溶液樣品稀釋至合適的濃度進(jìn)行檢測，波長范圍為200 600 nm。放入熒光分光光度計(jì)測試EYO-CDs熒光光譜。

1.2.5 指標(biāo)檢測 末次給藥后24 h摘眼球取血，隨后處死小鼠，血液靜置半小時(shí)后，3 000 r/min離心15 min，離心半徑15 cm，取上清液，按照ELISA試劑盒要求檢測血液中IL-4、IFN-γ。打孔器切取雙耳中部同樣位置組織，稱重，千分卡尺測量厚度，最后將右耳組織固定在10%的多聚甲醛中，石蠟包埋，HE染色，200×光鏡下觀察。切取剩下右耳全部組織，生理鹽水漂洗，擦干，稱重，加入9倍生理鹽水，組織搗碎機(jī)研磨，3 000 r/min離心10 min，離心半徑15 cm，取上清液。按試劑盒要求，檢測小鼠耳組織勻漿中IL-4、IL-17。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用PASS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組比較采用單因素方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 EYO-CDs的表征結(jié)果

2.1.1 TEM觀察結(jié)果 通過TEM觀察EYO-CDs的微觀結(jié)構(gòu)，如圖1A低分辨電鏡結(jié)果顯示EYO-CDs的分散度良好。圖1B顯示EYO-CDs粒徑分布在12.8 nm之間。主要集中在1.9 nm左右。如圖1C所示，EYO-CDs近似球形，晶格清晰，晶格間距為0.291 nm。電鏡檢測結(jié)果說明EYO-CDs具有典型的碳點(diǎn)結(jié)構(gòu)特征。

2.1.2 EYO-CDs的光學(xué)特征分析 紫外分光光度計(jì)測得結(jié)果如圖1D所示，EYO-CDs在370 nm左右有微弱的紫外線吸收，這可能是由于C=C引起的π-π躍遷所致。EYO-CDs的熒光光譜圖見圖1E，EYO-CDs的熒光光譜的最大激發(fā)波長出現(xiàn)在354 nm左右，最大發(fā)射波長出現(xiàn)在439 nm左右。EYO-CDs紅外光譜圖見圖1F，EYO-CDs分別在3 425、2 923、2 852、1 634、1 384、1 040/cm處有吸收峰。分析可知3 425/cm峰為O-H，N-H鍵，2 923/cm峰為-CH3鍵，2 852/cm峰為-CH2鍵，1 634/cm峰為-C=O鍵，1 384/cm強(qiáng)吸收峰為C-O鍵，1 040/cm弱吸收峰處為C-O-C鍵。結(jié)果表明，炭化后產(chǎn)生的EYO-CDs具有-OH，-C=O，-NH等官能團(tuán)。

2.2 EYO-CDs對慢性濕疹小鼠右耳部厚度和重量的影響

與空白組比較，模型組小鼠右耳腫脹厚度及重量明顯增加（P<0.01），提示小鼠濕疹實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ驮炷３晒Α＝?jīng)過4次給藥后，陽性藥組與模型組比較，小鼠的右耳腫脹厚度及重量均有明顯的降低，EYO-CDs各劑量組與模型組比較，小鼠的右耳腫脹厚度及重量也都有不同程度的降低，且存在一定的量效關(guān)系，濃度越高耳腫脹厚度及耳重量減輕的效果越好。與模型組比較，各組差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.05或P<0.01）。與陽性藥組比較，EYO-CDs低劑量組耳重量大于陽性藥組（P<0.05）。EYO-CDs低劑量組和中劑量組耳厚度大于陽性藥組（P<0.05）。EYO-CDs高劑量組與陽性藥組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表1。

2.3 EYO-CDs對慢性濕疹小鼠耳組織病理學(xué)變化的影響

空白組小鼠耳部組織結(jié)構(gòu)正常，表皮厚度正常，無水腫，無明顯淋巴細(xì)胞浸潤，血管形態(tài)正常。慢性濕疹模型組小鼠耳部表皮壞死，顆粒層增厚，棘層增厚，細(xì)胞內(nèi)及細(xì)胞間水腫，真皮大量炎癥細(xì)胞，淋巴細(xì)胞浸潤，真皮血管擴(kuò)張充血明顯。陽性藥物組小鼠表皮結(jié)構(gòu)正常，略有角化，表皮及真皮水腫明顯減輕，炎癥細(xì)胞明顯減少。EYO-CDs低劑量組表皮角化稍有減輕，水腫及炎癥細(xì)胞浸潤稍有減少，EYO-CDs中劑量組表皮角化減輕，結(jié)構(gòu)清晰，炎癥介質(zhì)明顯減少，稍有水腫。EYO-CDs高劑量組耳組織表皮結(jié)構(gòu)正常，角化減輕明顯，水腫、淋巴細(xì)胞浸潤大量減少、增厚程度減少明顯，血管形態(tài)正常。見圖2。

2.4 各組小鼠血清中IL-4、IFN-γ含量比較

與空白組比較，模型組小鼠血清中IL-4含量明顯升高，IFN-γ含量明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，陽性藥組、EYO-CDs各劑量組小鼠血清中IL-4含量均有不同程度降低（P<0.01），與模型組比較，陽性藥組、EYO-CDs中、高劑量組IFN-γ含量均有不同程度的提高（P<0.01），低劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與各處理組比較，EYO-CDs高中低劑量組小鼠血清中IL-4含量高于陽性藥組，IFN-γ含量均低于陽性藥組（P<0.01），EYO-CDs組濃度越高，IL-4降低與IFN-γ升高程度越大。與陽性藥組比較，EYO-CDs低中濃度IL-4、INF-γ差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P<0.01），EYO-CDs高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表2。

2.5 各組小鼠耳組織中IL-4、IL-17含量比較

與空白組比較，模型組小鼠耳組織中IL-4和IL-17含量明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，各給藥組IL-4，IL-17均有不同程度降低，陽性藥組IL-4，IL-17含量最低，EYO-CDs各劑量組隨著藥物濃度的升高，小鼠耳組織中IL-4和IL-17含量降低（P<0.01或P<0.05）。與陽性藥組比較，EYO-CDs低中劑量組IL-4、IL-17差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01），EYO-CDs高劑量組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。見表3。

3 討論

蛋黃油也被稱為“鳳凰油”“雞蛋油”“雞卵油”“雞子油”等[10]。蛋黃油最早出自北周姚僧垣的《集驗(yàn)方》，治湯火燒瘡方，第一次確切的指出蛋黃油具有治燙傷，斂瘡祛瘢痕的效果。此后便廣泛地運(yùn)用于治療瘡癬、燒燙傷、皮膚瘙癢等皮膚病。研究表明蛋黃餾油具有促進(jìn)創(chuàng)面愈合，抗氧化，降血脂[11]，促進(jìn)血管內(nèi)皮生長因子表達(dá)等功效[12]。并且制作工藝簡單，安全性高，不僅被運(yùn)用于治療胃潰瘍，心悸，小兒百日咳等多種疾病[13]，更多用于治療濕疹，燒燙傷，乳頭皸裂等疾病?；谀壳岸嗉杏谂R床報(bào)道，藥理藥效研究不夠深入，本課題組前期通過對蛋黃餾油萃取、透析，發(fā)現(xiàn)蛋黃餾油中含有碳點(diǎn)EYO-CDs。本實(shí)驗(yàn)通過對蛋黃餾油萃取液進(jìn)行重新表征，分別利用低分辨和高分辨電鏡觀察其微觀結(jié)構(gòu)，紫外光譜及熒光光譜顯示有熒光現(xiàn)象，驗(yàn)證了蛋黃餾油萃取液中EYO-CDs的存在。EYO-CDs粒徑分布在1～2.8 nm之間，近似球形，晶格清晰，晶格間距為0.291 nm。熒光光譜最大激發(fā)波長為354 nm，最大發(fā)射波長為439 nm。前期研究結(jié)果：EYO-CDs粒徑分布評價(jià)小于10 nm，近似球形，晶格清晰，晶格間距為0.267 nm。熒光光譜最大激發(fā)波長為366 nm，最大發(fā)射波長為450 nm。本研究中EYO-CDs與前期研究制備的EYO-CDs差異不大，重復(fù)性良好，說明本實(shí)驗(yàn)室對炭藥的制備具有穩(wěn)定性。蛋黃餾油中含有致癌物苯并（α）芘，且具有難聞的氣味，制約了其制劑的發(fā)展和應(yīng)用，本實(shí)驗(yàn)通過水萃取法可以有效去除苯并（α）芘及難聞的氣味。

對于濕疹的發(fā)病機(jī)制尚未完全明確，普遍認(rèn)為與炎癥感染，遺傳和環(huán)境因素有關(guān)[14-15]。目前研究發(fā)現(xiàn)，IL-4，IL-17等炎癥介質(zhì)的增加是慢性濕疹重要發(fā)病機(jī)制之一[16]。INF-γ等淋巴因子的分泌是減少變態(tài)反應(yīng)，治療濕疹的方法之一。Th1細(xì)胞分泌INF-γ可抑制Th2細(xì)胞所分泌的IL-4等炎癥介質(zhì)[17]。Th1占優(yōu)勢時(shí)預(yù)后良好，Th2占優(yōu)勢時(shí)預(yù)后不良，二者是相互制衡的關(guān)系[18]。IL-17在濕疹的病理生理學(xué)上發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，在濕疹的急性期和復(fù)發(fā)期其明顯升高，可能是濕疹的持續(xù)和加劇的因素之一[19]。本研究結(jié)果顯示EYO-CDs能有效下調(diào)慢性濕疹小鼠血清及耳組織中IL-4水平，上調(diào)INF-γ水平，促進(jìn)Th1增殖，抑制Th2的分泌，使Th1與Th2達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡，從而抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，降低炎癥反應(yīng)。慢性濕疹模型小鼠耳組織中EYO-CDs組IL-17含量明顯下降，說明EYO-CDs對濕疹模型小鼠IL-17的表達(dá)有明顯的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，小鼠耳組織中IL-4的含量明顯高于血清中IL-4的含量，血清中IL-17含量低于試劑盒檢測最低值，由此可以看出耳組織中IL-4與IL-17均高于血清中的含量，IL-4、IL-17在局部病變組織、血液中表達(dá)量不同[20]。HE染色結(jié)果顯示，給藥后耳組織表皮角化、水腫、淋巴細(xì)胞浸潤、血管充血等病理現(xiàn)象均有不同程度緩解。治療效果與給藥濃度具有一定的量效關(guān)系。

綜上所述，本研究對EYO-CDs進(jìn)行表征，通過小鼠濕疹模型發(fā)現(xiàn)EYO-CDs是通過下調(diào)IL-4、IL-17，上調(diào)INF-γ，調(diào)節(jié)Th1與Th2的平衡，抑制炎癥介質(zhì)的表達(dá)，調(diào)節(jié)免疫因子，從而達(dá)到治療慢性濕疹的作用，過萃取去除其中致癌物苯并[α]芘，增加了其安全性，并去除其難聞的氣味。

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（2020-11-10收稿 責(zé)任編輯：楊覺雄）