兩種制備海藻糖的生物酶轉(zhuǎn)化工藝技術(shù)

曹媛，李瑛

(南京凱通糧食生化研究設(shè)計有限公司，江蘇 南京，210012)

海藻糖是2個吡喃葡萄糖分子以α,α-1,1-糖苷鍵連接而成的非還原性雙糖，甜度約為蔗糖的45%。海藻糖可以調(diào)節(jié)植物響應(yīng)各類非生物脅迫[1]，在高溫、極寒、高滲透壓和干燥失水等惡劣條件下能有效保護細胞。如：在干燥狀態(tài)下可以起到生物體膜水代替物的作用[2]；在冷凍狀態(tài)下可以抑制胞外冰晶對細胞的抑制作用[3]，提高冷凍水產(chǎn)品的保水效果和穩(wěn)定的疏水性，有助于提高益生菌類飲料的貯存穩(wěn)定性[4]。海藻糖能夠保持食品在凍融期間的穩(wěn)定性[5]，可以增加非均質(zhì)化作用下益生菌的疏水性，從而作為安全的冷凍食品的保水劑使用[6]。由于這些特殊的生物保護功能，海藻糖被作為穩(wěn)定劑、保護劑和甜味劑等廣泛應(yīng)用于食品、農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥及化妝品等行業(yè)中。

目前，海藻糖的生產(chǎn)方法主要有酵母提取法[7-10]、發(fā)酵法[11-12]、基因重組法[13-14]和生物酶轉(zhuǎn)化法[14-15]；其中生物酶轉(zhuǎn)化法由于具有相對收率高、成本低和專一性強等特點，愈發(fā)受到青睞。酶法制備海藻糖的方法研究依據(jù)于生物體內(nèi)的海藻糖合成途徑，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的海藻糖合成途徑主要包括OtsAB途徑、TreYZ兩步催化途徑、海藻糖合酶(trehalose synthase，TreS)途徑、海藻糖糖基轉(zhuǎn)移酶(trehalose glycosyltransferase，TreT)途徑和海藻糖磷酸化酶(trehalose phosphorylase，TreP)途徑等[16]。其中TreYZ途徑和TreS途徑所分別對應(yīng)的雙酶法和單酶法是目前認為最具工業(yè)化價值的2種方法。雙酶法指在2種酶的協(xié)同作用下將一定鏈長的直鏈淀粉轉(zhuǎn)化為海藻糖的方法；單酶法一般指以麥芽糖為底物，利用一種海藻糖合酶轉(zhuǎn)化生成海藻糖的方法；這2種方法在工業(yè)制備中各具優(yōu)勢，受到廣泛關(guān)注。

1 雙酶法

1.1 雙酶法原理

日本林原生物化學研究所于20世紀90年代發(fā)現(xiàn)2種酶：低聚麥芽糖基海藻糖合成酶(maltooligosyl trahalose synthase, MTSase)和低聚麥芽糖基海藻糖水解酶(maltooligosyl trahalose trahalohydrolase, MTHase)。其中，MTSase可以作用于一定長度的直鏈淀粉，在其末端生成具有海藻糖結(jié)構(gòu)的α,α-1,1-葡萄糖苷鍵；MTHase能將α,α-1,1-葡萄糖苷鍵特異性的從直鏈末端切掉，生成海藻糖(圖1)[1]。這種制備海藻糖的方法也被簡稱為雙酶法。

圖1 淀粉雙酶法生產(chǎn)海藻糖反應(yīng)過程

1.2 雙酶法工藝

雙酶法可以使用多種淀粉作為底物，淀粉經(jīng)酶反應(yīng)后得到海藻糖和副產(chǎn)物葡萄糖、麥芽糖、麥芽寡糖、а-葡萄糖基海藻糖和а-麥芽糖基海藻糖等，一般再采用葡萄糖淀粉酶將副產(chǎn)物進一步轉(zhuǎn)化為葡萄糖和海藻糖后再分離，其MTSase和MTHase的作用溫度為35～40 ℃，pH 5.6～6.4，最終轉(zhuǎn)化率可達80%以上，專利JP3559585 (B2)或EP0628630(B1)等對該工藝進行了實例介紹。比起早期的微生物提取法，雙酶法的生產(chǎn)成本大幅降低，海藻糖價格由每千克2萬多日元下降到350日元，產(chǎn)品純度98%；由此日本成為最先實現(xiàn)以淀粉為原料工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的國家，林原生化研究所也成為當時最大的海藻糖生產(chǎn)商。

以林原公司為代表的眾多研究者不斷對淀粉生產(chǎn)海藻糖的工藝進行優(yōu)化，積極探尋有關(guān)海藻糖制備的新酶，并發(fā)現(xiàn)制備了工作溫度為75 ℃(pH 7.0)、60 ℃(pH 5.5)下的重組型耐熱海藻糖水解酶和耐熱非還原性糖質(zhì)生成酶(JP3557289B或EP0697461B1)。林原公司在原有雙酶法基礎(chǔ)上，配合使用α-淀粉酶、β-淀粉酶、淀粉脫支酶(異淀粉酶或直鏈淀粉酶)、葡萄糖淀粉酶、一種天然型或重組型環(huán)狀糊精葡萄糖苷基轉(zhuǎn)移酶(cyclomaltodextrin glucanotransferase，CGTase)或其突變體和α-葡糖苷酶和β-呋喃果糖苷酶(專利EP0990704B1、EP0691407B1)，顯著提高海藻糖產(chǎn)率，經(jīng)過液化、糖化、滅酶過濾、脫色、脫鹽及濃縮等過程得到高海藻糖漿；并在專利EP2759600A1中，進一步采用控制冷卻法得到二水合海藻糖結(jié)晶粉末，制備工藝過程如圖2所示。

圖2 CGTase參與下的雙酶法制造海藻糖基本工藝

1.3 雙酶法在國內(nèi)的應(yīng)用與研究進展

1999年，黃日波從硫礦硫化葉菌 (SulfolobussotfataricusGX×05T)中克隆到MTSase和MTHase基因并表達成功[17]。2000年，南寧中諾生物工程有限責任公司在此基礎(chǔ)上成功開發(fā)出酶法轉(zhuǎn)化木薯淀粉制備海藻糖的工藝，精制后得到純度為98%的食品級結(jié)晶海藻糖和99%高純度的結(jié)晶海藻糖；我國成為世界上第2個酶法工業(yè)化生產(chǎn)海藻糖的國家。2002年，我國結(jié)晶海藻糖價格為79元/kg[17-18]，至2010年底，海藻糖價格降低至25 000元/t。2014年，山東天力藥業(yè)有限公司完成了以淀粉為原料雙酶法生產(chǎn)海藻糖項目的中試，并在專利CN103205475A中介紹了公開了以淀粉為原料利用新型MTHase和MTSase、高溫淀粉酶及普魯蘭酶生產(chǎn)海藻糖的工藝條件，至2020年天力藥業(yè)的海藻糖產(chǎn)量達3 000 t。

MTSase和MTHase 2種酶的制備技術(shù)難度較大，前期報道的適用溫度多在50 ℃以內(nèi)，最高不超過60 ℃[19-21]。隨后日本進一步優(yōu)化并完成了耐高溫雙酶法工藝應(yīng)用，但國內(nèi)的反應(yīng)溫度普遍較低；這導(dǎo)致在實際生產(chǎn)中容易發(fā)生雜菌污染現(xiàn)象、增加生產(chǎn)控制成本。為了提高酶活及其耐高溫性能，江南大學、齊魯工業(yè)大學等研究者采用基因工程手段改造或重建MTSase和MTHase[22-24]。如:江南大學的吳世雄等將來源于嗜酸熱硫化葉菌ATCC 33909的 MTSase和MTHase在短芽孢桿菌中重組表達，并進行了酶轉(zhuǎn)化實驗，發(fā)現(xiàn)在60 ℃，pH 5.5的條件下轉(zhuǎn)化率達到80.2%[25]， 酶的耐溫性和活性都得到了顯著提高。此外，有研究采用復(fù)合酶技術(shù)[26]以及酶固定化技術(shù)或細胞固定化技術(shù)來提高酶的穩(wěn)定性。上述研究成果多在實驗室階段，但對雙酶法的工業(yè)化完善有重要意義。

2 單酶法

2.1 單酶法原理

雙酶法采用直鏈淀粉為底物，還可以采用麥芽糖作為底物制備海藻糖。以麥芽糖為底物的制備途徑主要有2種：

(1)在磷酸的作用下，先利用麥芽糖磷酸化酶生成葡萄糖和β-1-磷酸-葡萄糖，再利用海藻糖磷酸化酶將二者合成海藻糖，該方法反應(yīng)復(fù)雜，收率低，不適宜于工業(yè)制備。

(2)利用TreS的分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用，將麥芽糖分子中的α,α-1,4-糖苷鍵斷裂形成葡萄糖和葡萄糖基，隨后直接形成α, α-1,1-糖苷鍵從而將麥芽糖異構(gòu)為海藻糖，如圖3所示，該方法只需用一種酶作用于底物，常被稱作為單酶法(也被稱為TreS法)，利用TreS合成海藻糖的單酶法的轉(zhuǎn)化率要明顯大于上述磷酸作用下的方法，反應(yīng)過程更簡單，更適用于工業(yè)生產(chǎn)。

圖3 TreS作用于麥芽糖合成海藻糖

2.2 單酶法工藝

以麥芽糖為原料單酶法制備海藻糖的工藝相對簡單，酶反應(yīng)后經(jīng)過脫色、脫鹽、分離提純、濃縮、結(jié)晶后即可得到海藻糖產(chǎn)品。一般而言，原料麥芽糖可以直接采用市售麥芽糖漿或市售結(jié)晶麥芽糖，也可以利用淀粉轉(zhuǎn)化制備得到麥芽糖。麥芽糖底物的純度越高，海藻糖產(chǎn)物純度越高，副產(chǎn)物越少，專利EP0636693認為麥芽糖底物純度優(yōu)選為70%及以上(以干燥固體計)，從這個角度看后2種方式應(yīng)該更為可靠有效。

底物麥芽糖可由淀粉水解制備，且水解工藝已經(jīng)成熟，所以也可以直接以淀粉為原料水解成麥芽糖，然后經(jīng)過酶反應(yīng)得到海藻糖。日本林原生化所在專利JP1994014402、EP0636693和CN1281744C中介紹了來自3種不同微生物的TreS(原文稱為麥芽糖-海藻糖轉(zhuǎn)化酶)，該工藝采用先以淀粉為原料制備麥芽糖后再合成海藻糖的方法，利用α-淀粉酶、β-淀粉酶和異淀粉酶等分別對淀粉進行液化、糖化得到90%及以上的麥芽糖漿；隨后在海藻糖合酶TreS的作用下發(fā)酵轉(zhuǎn)化，對反應(yīng)混合物(組成為約73%海藻糖、22%麥芽糖和5%葡萄糖，質(zhì)量分數(shù))脫色、脫鹽和濃縮，得到富含海藻糖的糖漿，也可以一步分離純化后結(jié)晶干燥得到有水或無水結(jié)晶海藻糖(圖4)。

圖4 單酶法制備海藻糖的工藝流程

TreS對底物麥芽糖的濃度不敏感，在2.5%～40%的底物質(zhì)量分數(shù)下反應(yīng)都能得到70%～80%的轉(zhuǎn)化率。海藻糖合酶的耐溫性普遍不高，目前國內(nèi)報道的酶活性溫度范圍大多不超過45 ℃，溫度較低時反而有較好的海藻糖產(chǎn)率，當溫度升高時，酶活力下降，同時又會把部分麥芽糖底物水解為葡萄糖，降低海藻糖產(chǎn)率。目前采用TreS法制備海藻糖的轉(zhuǎn)化率基本不超過80%或在70%以下，意味著至少有20%的原料(麥芽糖)未被利用，或需要分離后再次利用，這在無形中增加了成本，需進一步提高TreS的海藻糖轉(zhuǎn)化效率。

2.3 單酶法在國內(nèi)的應(yīng)用與研究

我國對海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)起步晚于日本與歐美，相較于日本的雙酶法、歐美的轉(zhuǎn)基因植物法，國內(nèi)更傾向于工藝相對簡單的海藻糖合酶法的研究，相關(guān)報道也更多。2004年開始，南寧中諾生物工程有限公司、中國農(nóng)業(yè)科學院、長沙理工大學等在專利CN1563371A、CN1570098A、CN103215300、CN103421761B、CN102533822A、CN101100658B、CN101519652B中公布了不同TreS的制備方法或TreS轉(zhuǎn)化麥芽糖制備海藻糖的工藝。廣西大學、南京工業(yè)大學和中科院微生物研究所等也對海藻糖合酶篩選制備和應(yīng)用做了大量研究。

海藻糖合酶存在熱穩(wěn)定性差、轉(zhuǎn)化效率低于雙酶法等問題，限制了應(yīng)用范圍，探索酶的熱穩(wěn)定性機制、提高TreS的熱穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)化效率是當前國內(nèi)的研究熱點。趙曉艷等[27]和張悅[28]對60 ℃保溫3 h就會喪失酶活性TreS I進行分子改造，通過 PCR介導(dǎo)的方法對TreS II可能影響到熱穩(wěn)定性的氨基酸進行定點突變，改造TreS II在60 ℃保溫3 h條件下酶活力最多可保留68%。張悅等[28]和宿玲恰等[29]利用定點突變技術(shù)，將海藻糖合酶第251位Pro突變?yōu)長eu，突變酶轉(zhuǎn)化麥芽糖制備海藻糖的轉(zhuǎn)化率比天然酶高出13.0%。 任緒東[30]和WANG等[31]通過半理性設(shè)計結(jié)合定點飽和突變的方法，建立了針對非保守氨基酸的飽和突變，4種突變體的轉(zhuǎn)化率相比原始酶分別提高了4.38%、3.47%、2.74%和3.6%。呂鑫[32]通過預(yù)測Pseudomonas putidaP06的TreS的空間結(jié)構(gòu)，并結(jié)合分子對接和保守性分析，選擇第490位的Lys進行飽和突變，篩選突變體K490L 和K490的轉(zhuǎn)化率比原始酶分別提高了18%和15%。

除了對TreS酶活性和熱穩(wěn)定性的優(yōu)化，也有研究者通過優(yōu)化產(chǎn)酶培養(yǎng)條件來提高酶活[33]；或者通過構(gòu)建胞外產(chǎn)酶微生物來提高產(chǎn)酶效率和酶活性。如劉洪玲等[34]成功構(gòu)建了芽胞表面展示TreS的重組枯草芽胞桿菌，實現(xiàn)了TreS在胞外的應(yīng)用及避免胞內(nèi)表達的不便利。上述研究成果還處于實驗室階段，但對于TreS單酶法的工業(yè)應(yīng)用極具參考意義。

3 單酶法與雙酶法生產(chǎn)海藻糖的比較

3.1 原料

雙酶法以淀粉為原料，單酶法多采用麥芽糖為原料。淀粉原料生產(chǎn)技術(shù)成熟、來源廣、價格也低于麥芽糖，以木薯淀粉為例，售價約為2 500～4 000元/t，麥芽糖漿的售價在4 000～5 000元/t，高純麥芽糖或結(jié)晶麥芽糖的價格更高。

鑒于麥芽糖可由淀粉轉(zhuǎn)化生成，且技術(shù)成熟，也有些研究者以淀粉為原料，先將淀粉水解成麥芽糖后，再采用單酶法生產(chǎn)海藻糖。雖然原料價格下降，但增加了麥芽糖的生產(chǎn)工段的投資，且影響后續(xù)分離精制及海藻糖的純度，該方式更適用于現(xiàn)有的麥芽糖生產(chǎn)廠家拓展下游生產(chǎn)線。但隨著融合酶技術(shù)的提高，以淀粉為原料的單酶法工藝可行性也越來越高。諶芳[35]通過替換海藻糖合酶生產(chǎn)菌以及T4 連接酶插入連接肽的方式，構(gòu)建了β-淀粉酶-海藻糖合酶融合酶，該融合酶在溫度 45 ℃、pH 6.5條件下催化6%直鏈淀粉12 h的轉(zhuǎn)化率可高達86%，該研究對于單酶法工藝具有突破性的應(yīng)用價值。

3.2 產(chǎn)物組分

從產(chǎn)物組成上來看，淀粉雙酶法產(chǎn)物中的糖類組合物非常復(fù)雜，副產(chǎn)物有麥芽糖、葡萄糖、麥芽寡糖甚至糖基海藻糖(如α-葡萄糖基海藻糖、α-麥芽糖基海藻糖、α-麥芽三糖基海藻糖、α-麥芽四糖基海藻糖等)，使得生產(chǎn)分離成本較高；采用麥芽糖合成海藻糖時，反應(yīng)產(chǎn)物較為簡單：海藻糖和副產(chǎn)物葡萄糖以及剩余麥芽糖，理論上而言這一方法的后續(xù)分離工藝也會更為簡單；但實際生產(chǎn)中使用的商品麥芽糖(漿)含有很多雜糖，對反應(yīng)和后續(xù)分離會有一定程度的影響，所以更宜采用價格高的結(jié)晶麥芽糖；若采用以淀粉為原料自行制備麥芽糖使用，會相應(yīng)增加制備麥芽糖的工藝和設(shè)備成本，但同時原料成本降低，副產(chǎn)物麥芽糖等可作為第2經(jīng)濟產(chǎn)物或再次利用。

3.3 制備工藝

淀粉雙酶法制備海藻糖雖然具有原料便宜來源廣等優(yōu)點，但制備過程要用到2種酶，這2種酶的制備技術(shù)難度較大，反應(yīng)時間長、易染菌；盡管國內(nèi)有報道一些耐熱耐酸性酶，但在確保酶活性或?qū)崿F(xiàn)大規(guī)模生產(chǎn)上仍有技術(shù)難度。同時該工藝淀粉酶用量較大，對副產(chǎn)品的控制以及副產(chǎn)品中麥芽糖和海藻糖的分離難度相對較大，工藝過程較為復(fù)雜，存在技術(shù)壁壘，世界上只有少數(shù)公司企業(yè)機構(gòu)擁有該生產(chǎn)工藝。

雙酶法反應(yīng)前需要將淀粉轉(zhuǎn)化為葡萄糖聚合度為3或以上的、相對高黏度高分子量的淀粉糖，需要淀粉酶、MTHase和MTSase等多種酶的參與，造成工藝冗長。而單酶法只需要一種海藻糖合酶，所以制酶工藝更簡單；同時該酶專一性很強，只作用于麥芽糖和海藻糖，反應(yīng)過程簡單，工藝流程也更簡短，設(shè)備占用率更低；又因為無需考慮2種酶的協(xié)同作用，在工業(yè)生產(chǎn)上更容易控制調(diào)節(jié)。

無論是雙酶法還是單酶法都必然需要面對去除以葡萄糖為主的副產(chǎn)物的問題?，F(xiàn)有方法主要包括結(jié)晶分離、色譜提純(如模擬移動色譜分離技術(shù))和微生物發(fā)酵法。對于雙酶法，控制好淀粉的糊化反應(yīng)和雙酶促反應(yīng)也是降低副產(chǎn)物的關(guān)鍵。對于單酶法，除了酶促反應(yīng)過程，麥芽糖原料的純度也直接影響副產(chǎn)物水平；張曉元等[36]利用酵母發(fā)酵法預(yù)處理去除原料麥芽糖漿中的葡萄糖，以消除底物抑制提高酶法生產(chǎn)海藻糖產(chǎn)率，降低副產(chǎn)物葡萄糖水平，具備一定的工業(yè)參考意義。

3.4 轉(zhuǎn)化效率

從轉(zhuǎn)化效率上而言，研究和工業(yè)化應(yīng)用更早的雙酶法轉(zhuǎn)化率最高可達85%，而單酶法的轉(zhuǎn)化率略低一些，已報道的數(shù)據(jù)多為60%～70%，甚至更低，在工業(yè)上，不足60%的轉(zhuǎn)化率難以滿足生產(chǎn)需求，不具備競爭優(yōu)勢。少數(shù)轉(zhuǎn)化率大于80%的數(shù)據(jù)還停留在實驗室研究階段，距離工業(yè)化還有很大差距。

無論是淀粉雙酶法還是麥芽糖轉(zhuǎn)化法，其轉(zhuǎn)化效率都有進一步提升的余地，在工業(yè)化生產(chǎn)時二者都普遍存在酶反應(yīng)時間長、耐熱耐酸性較差的特點，如海藻糖合酶法的反應(yīng)時間多在48～72 h，所采用的溫度普遍較低(<50 ℃)，如若解決這一難題，將更加有利于海藻糖的大規(guī)模生產(chǎn)與推廣應(yīng)用。為了提高其轉(zhuǎn)化效率和熱穩(wěn)定性、縮短反應(yīng)時間，采用定點突破技術(shù)、易錯PCR技術(shù)等蛋白質(zhì)工程和基因工程技術(shù)手段來改造TreS是一種有效且熱門的方法，并且取得了眾多有意義的研究成果，如何將這些研究成果應(yīng)用于工業(yè)化是后續(xù)的主要研究方向。

一些研究者嘗試篩選天然微生物制備耐酸耐熱性能更好的酶，如中國科學院微生物研究所在專利CN100393873C發(fā)現(xiàn)一種淀粉海藻糖基合成酶，其可用的反應(yīng)pH為4.5～8.0，優(yōu)選7.0～6.0，優(yōu)選溫度55～70 ℃，最高達約75 ℃。專利CN1177043C中介紹了利用耐熱嗜酸型海藻糖基合成酶和海藻糖基水解酶作用于還原性淀粉水解產(chǎn)物制備海藻糖的過程。也有的研究者考慮通過固定化酶的方式來實現(xiàn)。如專利CN103981233A引入二氧化硅納米材料作為酶的固定相，專利CN104328107A通過透性化處理、并利用殼聚糖和海藻酸鈉共固定化制備形成合成海藻糖的雙酶微球。這些方法為工業(yè)生產(chǎn)提供了一種可能的方向。

4 小結(jié)與展望

目前日本主要利用淀粉雙酶法生產(chǎn)海藻糖，單酶法在國內(nèi)更受關(guān)注。2種生物酶轉(zhuǎn)化技術(shù)各有優(yōu)勢，雙酶法的原料便宜易得、工藝較成熟、轉(zhuǎn)化率較高，而單酶法具有反應(yīng)過程易控、工藝流程簡單、副產(chǎn)物少等優(yōu)點。單酶法因為其只需一步酶促反應(yīng)的簡單工藝而被國內(nèi)外眾多研究者視為未來海藻糖酶法生產(chǎn)的方向。目前2種方法在反應(yīng)機制探索、酶的耐高溫性能優(yōu)化和酶轉(zhuǎn)化率上都有需要進一步完善的地方。盡管無論是淀粉雙酶法還是單酶法都存在著一定的缺陷，但隨著基因工程和蛋白工程技術(shù)領(lǐng)域的發(fā)展、對海藻糖合成相關(guān)酶的構(gòu)建優(yōu)化以及色譜提純等配套分離技術(shù)的日益成熟與應(yīng)用，這2種海藻糖生產(chǎn)技術(shù)尤其是TreS法仍具實現(xiàn)更大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)的潛力。