電化學(xué)傳感器在赭曲霉毒素A檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展

高棟，陳秀金,2*，李兆周,2，王耀,2，何凱鋒，王靜，黃正迪，孫鳳霞

1(河南科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，河南 洛陽(yáng)，471000) 2(食品加工與安全國(guó)家級(jí)實(shí)驗(yàn)教學(xué)示范中心，河南 洛陽(yáng)，471000) 3(石河子大學(xué) 食品學(xué)院，新疆 石河子，832003)

赭曲霉毒素A (ochratoxin A，OTA) 是一種由曲霉屬和青霉屬的某些產(chǎn)毒菌株產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物,是已知的6種赭曲霉毒素中毒性最強(qiáng)的一種，廣泛存在于咖啡、啤酒、紅酒、玉米、小麥、燕麥和蔬菜中[1]。毒理學(xué)研究表明，OTA被人體吸收后，對(duì)人體腎臟和肝臟有強(qiáng)烈的毒性，同時(shí)具有免疫抑制、致癌、致畸和致突變作用[2], 對(duì)人體健康造成嚴(yán)重威脅。因此，對(duì)食品中的OTA含量進(jìn)行檢測(cè)具有重要意義。為了更好地監(jiān)控食品中的OTA含量，世界各國(guó)規(guī)定了OTA在食品及谷物等農(nóng)產(chǎn)品中的限量標(biāo)準(zhǔn)，如歐盟委員會(huì)規(guī)定供幼兒食用的谷類食品中OTA限量0.5 μg/kg，葡萄汁和葡萄酒中OTA限量2 μg/kg，谷物加工食品中OTA限量3 μg/kg，原始谷物和焙烤咖啡中OTA限量5 μg/kg 和干果中OTA限量10 μg/kg[3-4]。同時(shí)，我國(guó)也制定了食品及其原料中OTA含量的限量標(biāo)準(zhǔn)，如葡萄酒中OTA限量2 μg/kg，谷物及其制品、大豆和咖啡中OTA限量5 μg/kg[5]。

現(xiàn)用于檢測(cè)食品及農(nóng)產(chǎn)品中OTA含量的方法有儀器分析法、膠體金側(cè)流層析法和電化學(xué)傳感器。儀器分析法包括高效液相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、超高效液相色譜-熒光法、超高效液相色譜-電噴霧電離串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用法、氣相色譜-質(zhì)譜法等。盡管這些方法靈敏度和準(zhǔn)確性高，但檢測(cè)時(shí)需要專業(yè)人員操作昂貴的大型儀器，而且制備樣品的過(guò)程復(fù)雜。膠體金側(cè)流層析法不需要大型儀器檢測(cè)，操作簡(jiǎn)單，可用肉眼直接對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定。但膠體金弱的光學(xué)性能以及低的生物分子結(jié)合率導(dǎo)致其靈敏度偏低[6]，影響了其在OTA快速檢測(cè)中的應(yīng)用和發(fā)展。而電化學(xué)傳感器具有便攜、快速和經(jīng)濟(jì)的優(yōu)勢(shì)，可以彌補(bǔ)上述方法的缺點(diǎn)，目前已用于食品及農(nóng)產(chǎn)品中OTA含量的檢測(cè)。因此，本文對(duì)電化學(xué)傳感器在OTA檢測(cè)中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行了綜述，以期為開(kāi)發(fā)OTA檢測(cè)新方法提供理論支撐。

1 電化學(xué)傳感器

電化學(xué)傳感器主要是基于待測(cè)物的電化學(xué)性質(zhì)將待測(cè)物的化學(xué)量轉(zhuǎn)為電學(xué)量，然后對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的一種傳感器。其工作原理就是將化學(xué)復(fù)合材料或生物活性物質(zhì)固定在電極表面，利用其對(duì)分析物的特異性進(jìn)行識(shí)別，識(shí)別信息經(jīng)電極傳遞給信息轉(zhuǎn)換部分，然后被轉(zhuǎn)換成檢測(cè)信號(hào)，最后根據(jù)特異性識(shí)別前后電信號(hào)的變化量，對(duì)分析物進(jìn)行定性和定量分析[7]。與其他傳統(tǒng)的檢測(cè)分析方法相比，電化學(xué)傳感器具有便攜、選擇性好、靈敏度高及可進(jìn)行現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的優(yōu)勢(shì)。

2 電化學(xué)傳感器在OTA檢測(cè)中的應(yīng)用

電化學(xué)傳感器按照修飾材料或識(shí)別活性物質(zhì)的不同分為電化學(xué)免疫傳感器、分子印跡電化學(xué)傳感器、電化學(xué)適配體傳感器和其他電化學(xué)傳感器4種類型。

2.1 電化學(xué)免疫傳感器

電化學(xué)免疫傳感器是一種將免疫分析技術(shù)與電化學(xué)檢測(cè)技術(shù)相結(jié)合建立的傳感檢測(cè)方法[8]。其主要工作原理是通過(guò)固定在電極表面上的抗體對(duì)抗原進(jìn)行特異性識(shí)別，將抗原濃度轉(zhuǎn)化為電信號(hào)，再對(duì)電信號(hào)進(jìn)行處理以數(shù)字的方式呈現(xiàn)檢測(cè)結(jié)果，從而對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行定量檢測(cè)[9]。在電化學(xué)免疫傳感器中, 抗體作為識(shí)別元件，其固定化方法、固定量和抗體活性均會(huì)影響傳感器性能。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于抗原與抗體的特異性識(shí)別，避免了檢測(cè)過(guò)程中的非特異性干擾。

根據(jù)是否對(duì)免疫分子標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器可分為標(biāo)記型和無(wú)標(biāo)記型2種。標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器在檢測(cè)前需要對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，操作步驟較多，檢測(cè)過(guò)程較復(fù)雜。如LIU等[10]構(gòu)建了一種間接競(jìng)爭(zhēng)法檢測(cè)OTA的電化學(xué)免疫傳感器，該傳感器用堿性磷酸酶標(biāo)記抗體，檢測(cè)范圍為1.00～1.00×103ng/mL，檢測(cè)限低至2.00×10-1ng/mL，具有良好的重現(xiàn)性和高選擇性。而無(wú)標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器是直接檢測(cè)抗原抗體反應(yīng)時(shí)造成的電學(xué)量變化，極大地簡(jiǎn)化了操作過(guò)程。如MALVANO等[11]開(kāi)發(fā)了一種基于絲網(wǎng)印刷碳電極的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器，并將其用于紅酒中OTA的定量檢測(cè)。試驗(yàn)將OTA抗體修飾到絲網(wǎng)印刷電極表面，采用循環(huán)伏安法對(duì)修飾電極進(jìn)行表征，運(yùn)用阻抗法對(duì)紅酒中OTA的含量進(jìn)行檢測(cè)。優(yōu)化條件下，該傳感器在3.00×10-1～20 ng/mL范圍內(nèi)可對(duì)OTA進(jìn)行準(zhǔn)確快速的檢測(cè)，檢測(cè)限2.50×10-1ng/mL。KNENE等[12]建立了一種對(duì)咖啡中OTA含量檢測(cè)的無(wú)標(biāo)記電化學(xué)免疫傳感器，檢測(cè)范圍5.00×10-1～20 ng/mL， 檢測(cè)限9.60×10-2ng/mL。與標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器相比，無(wú)標(biāo)記型電化學(xué)免疫傳感器的檢測(cè)范圍較小，但其無(wú)需對(duì)抗體進(jìn)行標(biāo)記，操作更簡(jiǎn)便。

近年來(lái)，金納米粒子、碳納米材料、磁性納米粒子和納米雜化材料已用于電化學(xué)免疫傳感器中，這些納米材料為固定抗體提供了良好的生物相容性表面，提高了檢測(cè)靈敏度[13]，其中磁性納米粒子和金納米粒子用于檢測(cè)OTA的電化學(xué)免疫傳感器，如ZHANG等[14]研制了一種基于磁性納米粒子的電化學(xué)免疫傳感器，該研究結(jié)合酶聯(lián)免疫吸附法對(duì)OTA含量進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)范圍為1.00×10-2～8.20×10-1ng/mL，檢測(cè)限7.00×10-3ng/mL。選擇谷物和飼料樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，結(jié)果表明，加標(biāo)回收率為78.7%～113.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在3.60%～9.8%，變異系數(shù)小于15%。HOU等[15]開(kāi)發(fā)了一種基于噬菌體展示模擬表位肽的超靈敏電化學(xué)免疫傳感器，以O(shè)TA模擬表位肽作為識(shí)別元件，用金納米粒子修飾玻碳電極，構(gòu)建檢測(cè)OTA的電化學(xué)免疫傳感器，檢測(cè)范圍為7.17×10-6～5.49×10-4ng/mL，檢測(cè)限2.04×10-6ng/mL；對(duì)玉米樣品和啤酒樣品進(jìn)行添加回收試驗(yàn)，回收率分別為89.6% ～107.4%和99.3%～104.3%。和傳統(tǒng)的OTA電化學(xué)免疫傳感器(檢測(cè)限8×10-2ng/mL)相比[16]，基于磁性納米粒子構(gòu)建的OTA電化學(xué)免疫傳感器靈敏度提高了近9倍。與磁性納米粒子的信號(hào)放大相比，基于金納米粒子的OTA電化學(xué)免疫傳感器的信號(hào)放大效果更好，其靈敏度提高了近300倍。綜上，用磁性納米粒子和金納米粒子均可提高OTA電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度?；诮鸺{米粒子電化學(xué)免疫傳感器的靈敏度提高可能是因?yàn)榻鸺{米粒子具有良好的導(dǎo)電性，修飾到電極上提高了電子傳遞速率，從而提高電化學(xué)免疫傳感器靈敏度。磁性納米粒子提高傳感器的靈敏度可能是因?yàn)榇判约{米粒子具有類似過(guò)氧化物酶的催化性能[17]，故在電化學(xué)免疫傳感器中可作為催化劑，加快反應(yīng)速度，從而使傳感器的靈敏度得到提高。相比之下，基于金納米粒子構(gòu)建的電化學(xué)免疫傳感器檢測(cè)范圍更寬，檢測(cè)限更低。

2.2 分子印跡電化學(xué)傳感器

分子印跡電化學(xué)傳感器是一種將分子印跡技術(shù)和電化學(xué)傳感技術(shù)相結(jié)合的分析方法。分子印跡技術(shù)是指制備能識(shí)別目標(biāo)分子聚合物的技術(shù)[18]。所制備的聚合物作為分子印跡電化學(xué)傳感器的識(shí)別元件，具有專一性強(qiáng)，穩(wěn)定性高，可重復(fù)使用，檢測(cè)靈敏，成本低，同時(shí)還克服了電化學(xué)檢測(cè)方法受雜質(zhì)干擾的不足[19]。近年來(lái)，研究者還通過(guò)引入各種納米材料來(lái)進(jìn)一步提高分子印跡電化學(xué)傳感器的檢測(cè)性能，現(xiàn)用于電化學(xué)傳感器的納米材料有碳納米材料、金屬納米材料、磁性納米材料、金屬氧化物以及復(fù)合納米材料[20]，其中用于檢測(cè)OTA分子印跡電化學(xué)傳感器的納米材料有多壁碳納米管和銀納米粒子。

多壁碳納米管比表面積大，穩(wěn)定性好，具有良好的生物相容性和導(dǎo)電性，在分子印跡電化學(xué)傳感器中，其作為良好的載體材料和印跡基質(zhì)用于修飾電極[20-21]，能提高OTA分子印跡電化學(xué)傳感器的靈敏度。如PACHECO等[22]用多壁碳納米管和分子印跡聚合物修飾玻碳電極，用OTA印跡的聚吡咯作為識(shí)別元件，制備了檢測(cè)OTA含量的分子印跡電化學(xué)傳感器，原理如圖1所示。檢測(cè)范圍為2.02～4.04 ng/mL， 檢測(cè)限1.70 ng/mL。在啤酒和葡萄酒樣品中檢測(cè)的加標(biāo)回收率為84%～104%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.2%～7.5%。

圖1 基于多壁碳納米管的分子印跡傳感器原理圖

銀納米粒子用于分子印跡電化學(xué)傳感器能夠增加電極的比表面積，增強(qiáng)識(shí)別位點(diǎn)與電化學(xué)換能器之間的電子傳遞速度，從而放大分子印跡電化學(xué)傳感器的檢測(cè)信號(hào)[20]。然而，銀納米粒子單獨(dú)修飾電極穩(wěn)定性差，往往需要與其他材料相結(jié)合，形成雜化銀納米粒子，摻入分子印跡膜提高分子印跡電化學(xué)傳感器靈敏度。YOLA等[23]設(shè)計(jì)了一種基于銀納米粒子的分子印跡電化學(xué)傳感器，用于葡萄汁和葡萄酒樣品中OTA的檢測(cè)，試驗(yàn)原理見(jiàn)圖2。該分子印跡電化學(xué)傳感器摻雜多金屬氧酸鹽H3PW12O40和功能化的還原氧化石墨烯修飾玻碳電極，其中還原氧化石墨烯能加快傳感器的電子傳遞速率，提高傳感器的靈敏度。經(jīng)優(yōu)化，該傳感器在2.02×10-2～6.06×10-1ng/mL范圍內(nèi)能對(duì)OTA進(jìn)行靈敏的快速分析，檢測(cè)限低至6.46×10-3ng/mL。

圖2 基于還原氧化石墨烯分子印跡傳感器原理圖

和多壁碳納米管構(gòu)建的OTA分子印跡電化學(xué)傳感器相比，銀納米粒子構(gòu)建的傳感器檢測(cè)限更低，這可能是因?yàn)樵阢y納米粒子中摻雜金屬氧酸鹽和功能化的還原氧化石墨烯在增加電子傳遞速率的基礎(chǔ)上既克服了銀納米粒子修飾電極穩(wěn)定性差的缺陷，又增大了電極的比表面積，同時(shí)還提高了反應(yīng)過(guò)程中的催化性能，從而使OTA分子印跡電化學(xué)傳感器的靈敏度更高。

2.3 電化學(xué)適配體傳感器

適配體是通過(guò)指數(shù)富集配體系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)從體外人工合成的單鏈核酸文庫(kù)中篩選出來(lái)的寡核苷酸片段[24],是由20～80個(gè)核苷酸組成的RNA或單鏈DNA，可以折疊構(gòu)成熱力學(xué)穩(wěn)定的三維結(jié)構(gòu)，通過(guò)氫鍵、范德華力、靜電作用等與靶分子(如金屬離子、氨基酸、蛋白質(zhì)、酶等)特異性結(jié)合[25]。適配體又被稱為“化學(xué)抗體”[24]，與傳統(tǒng)抗體相比，適配體的特異性強(qiáng)、靶物質(zhì)范圍廣、易修飾、穩(wěn)定性強(qiáng)且可在常溫下運(yùn)輸、篩選周期短、易獲得和成本低。鑒于這些優(yōu)勢(shì)，適配體已被廣泛地用作電化學(xué)傳感器的識(shí)別元件。根據(jù)工作方式不同可將其分為親合型、構(gòu)型變換型和混合型3種類型。本文總結(jié)了電化學(xué)適配體傳感器在OTA檢測(cè)中的應(yīng)用(表1)。

由表1可見(jiàn)，電化學(xué)適配體傳感器已廣泛的用于小麥、玉米、紅酒、白酒、葡萄酒、啤酒、咖啡等樣品中OTA含量的檢測(cè)。用于電化學(xué)適配體傳感器的納米材料有金屬納米材料、碳納米材料、金屬氧化物和復(fù)合納米材料等，其中金納米粒子、銀納米粒子、石墨烯和納米復(fù)合材料材料等用于OTA電化學(xué)適配體傳感器中。應(yīng)用納米材料構(gòu)建的大部分電化學(xué)適配體傳感器比未應(yīng)用納米材料的電化學(xué)適配體傳感器檢測(cè)限低，如MAZAAFRIANTO等[30]設(shè)計(jì)了一種無(wú)標(biāo)記的電化學(xué)適配體傳感器，在咖啡和啤酒樣品中的檢測(cè)限為7.83×10-2ng/mL；KAUR等[26]設(shè)計(jì)了一種基于石墨烯的電化學(xué)適配體傳感器用于葡萄汁中OTA的檢測(cè)，檢測(cè)限為1.00×10-7ng/mL。應(yīng)用了石墨烯的電化學(xué)適配體傳感器檢測(cè)限低，可能是因?yàn)槭┚哂辛己玫纳锛嫒菪院蛯?dǎo)電性，同時(shí)還具有較大的比表面積[44]。同時(shí)還可以看出，在上述的納米材料中，金納米粒子應(yīng)用較多，主要因?yàn)槠渚哂辛己玫纳锛嫒菪院蛯?dǎo)電性，制備過(guò)程簡(jiǎn)單和粒徑可控優(yōu)點(diǎn)[45]。另外，在電化學(xué)適配體傳感器中使用金納米粒子，檢測(cè)限更低，無(wú)論是單獨(dú)使用還是與其他納米材料組成納米復(fù)合材料使用，均可使電化學(xué)傳感器具有較低的檢測(cè)限，這主要取決于其具有良好的導(dǎo)電性和較大的比表面積。

表1 電化學(xué)適配體傳感器在OTA檢測(cè)中的應(yīng)用

2.4 其他電化學(xué)傳感器

除了上述的三類電化學(xué)傳感器，還有研究者應(yīng)用其他修飾材料或識(shí)別物質(zhì)構(gòu)建檢測(cè)OTA的電化學(xué)傳感器，如XIANG等[46]利用黑磷烯具有良好的電化學(xué)穩(wěn)定性、電催化活性和優(yōu)良的防垢性能等性質(zhì)，設(shè)計(jì)了一種檢測(cè)OTA的電化學(xué)傳感器。采用微分伏安脈沖法對(duì)啤酒和葡萄汁中的OTA進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)范圍為3×102～1×104ng/mL，檢測(cè)限1.8×102ng/mL。DRIDI等[47]設(shè)計(jì)了一種基于熱裂解酶的電化學(xué)傳感器，對(duì)橄欖油中的OTA進(jìn)行檢測(cè)。該方法對(duì)OTA濃度在8.08×10-1～40.38 ng/mL范圍呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，檢測(cè)限4.38×10-1ng/mL。AFZALI等[48]利用金納米顆粒的高比表面積、電催化和吸附特性，設(shè)計(jì)了一種選擇性強(qiáng)、操作簡(jiǎn)單的電化學(xué)傳感器，該傳感器在谷類食品和啤酒樣品中的檢測(cè)范圍為2.02×10-1～40.38 ng/mL，檢測(cè)限為8.08×10-2ng/mL。JALALVAND[49]將石墨烯、多壁碳納米管、殼聚糖、離子液體、膠原-離子液體和氧化鎳納米材料結(jié)合在一起修飾玻碳電極，構(gòu)建了一種用于果汁樣品中OTA檢測(cè)的電化學(xué)傳感器，其中膠原中含有大量的氧和氮原子，使其與金屬氧化物具有良好的親和力，避免了金屬氧化物納米粒子的聚集，提高了傳感器的穩(wěn)定性，檢測(cè)范圍為4.04×10-3～4.04 ng/mL，檢測(cè)限2.02×10-3ng/mL， 該傳感器的重現(xiàn)性好且成本低。

3 展望

近年來(lái)，隨著各種納米材料或識(shí)別元件的應(yīng)用，OTA電化學(xué)傳感器的靈敏度正在逐步改善，提高了OTA電化學(xué)傳感器的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性，但仍有一些性能需要繼續(xù)改進(jìn)：(1)在電化學(xué)免疫傳感器中，抗原抗體在電極表面固載的穩(wěn)定性仍需提高；(2)在分子印跡電化學(xué)傳感器中，功能單體種類單一，構(gòu)建方法較為復(fù)雜；(3)開(kāi)發(fā)無(wú)毒無(wú)害、價(jià)格低廉、生物兼容性更好的納米材料，如可開(kāi)發(fā)新的納米復(fù)合材料，提高電化學(xué)傳感器的檢測(cè)性能。

電化學(xué)傳感器在OTA檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景，未來(lái)有取代傳統(tǒng)的檢測(cè)技術(shù)的潛力，因此，研發(fā)快速、靈敏、綠色、可用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的電化學(xué)傳感器將是OTA檢測(cè)未來(lái)研究發(fā)展方向。