金針菇多糖對(duì)三文魚(yú)片凍藏期間品質(zhì)的影響

謝晨，熊澤語(yǔ)，李慧，金素萊曼，陳百科，包海蓉,2*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306)2(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)

三文魚(yú)屬于冷水性的高度洄游魚(yú)類(lèi)，主要分布在挪威、加拿大、美國(guó)等地區(qū)。三文魚(yú)肉呈橙紅色，肉質(zhì)細(xì)膩，口感鮮美，且富含二十碳五烯酸和二十二碳六烯酸等多種不飽和脂肪酸，深受中國(guó)消費(fèi)者青睞。中國(guó)市場(chǎng)上的三文魚(yú)以進(jìn)口三文魚(yú)為主，2012—2019年中國(guó)三文魚(yú)市場(chǎng)平均增速在19%左右，2019年的進(jìn)口量達(dá)9萬(wàn)t。然而，由于三文魚(yú)具有較高的水分活性和豐富的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，在宰殺后魚(yú)體極易發(fā)生腐敗。為了延長(zhǎng)三文魚(yú)保質(zhì)期，常常將屠宰后的三文魚(yú)進(jìn)行冷凍保藏。常用的凍藏溫度有-18 ℃和超低溫(-40 ℃及以下)。與-18 ℃凍藏相比，超低溫凍藏雖能更好地保持三文魚(yú)的品質(zhì)，但其對(duì)儀器設(shè)備的要求更高，投資成本更大，而且無(wú)法精確地控制凍藏溫度[1]。三文魚(yú)在-18 ℃時(shí)，凍結(jié)率已達(dá)到90%，經(jīng)過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的凍藏，三文魚(yú)蛋白發(fā)生冷凍變性，脂肪逐步氧化，這些因素均會(huì)導(dǎo)致三文魚(yú)品質(zhì)劣變。目前添加抗凍劑是防止蛋白變性的主要方法，工業(yè)上常用的商業(yè)抗凍劑為4%蔗糖和4%山梨醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù))混合液。但由于傳統(tǒng)商業(yè)抗凍劑高甜高熱量的特點(diǎn)與如今消費(fèi)者追求健康低熱量的消費(fèi)趨勢(shì)不符，因此尋找天然、健康、高效的新型抗凍劑成了目前科研人員研究的熱點(diǎn)。

金針菇多糖(polysaccharide fromFlammulinavelutipes，F(xiàn)VP)是從金針菇中提取出的水溶性多糖，是金針菇的主要活性成分，早在1968年日本就有關(guān)于FVP的研究報(bào)導(dǎo)[2]。到如今，F(xiàn)VP雖然已經(jīng)引起了部分學(xué)者的關(guān)注，但目前關(guān)于FVP的國(guó)內(nèi)外研究均集中于抗氧化[3]，促進(jìn)腸道健康[4]，免疫調(diào)節(jié)[5]等方面，對(duì)于將多糖應(yīng)用于水產(chǎn)品抗凍劑的研究鮮有報(bào)導(dǎo)。

本文通過(guò)研究不同濃度FVP浸漬處理的三文魚(yú)片在-18 ℃凍藏4個(gè)月后的Ca2+-ATPase活性，巰基，硫代巴比妥酸反應(yīng)物(thiobarbituric acid reactive substance，TBARS)，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以及冰晶大小變化，并與蒸餾水處理以及商業(yè)抗凍劑處理進(jìn)行對(duì)比，探討將FVP作為水產(chǎn)品抗凍劑使用的可行性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冰鮮三文魚(yú)，購(gòu)于上海東方國(guó)際水產(chǎn)中心，在產(chǎn)地屠宰、去除內(nèi)臟后，冰藏，約2 d運(yùn)至上海。由商店專(zhuān)業(yè)人員進(jìn)行剔骨、去皮，只取中段背部肌肉，裝入保鮮袋，冰藏，2 h內(nèi)至實(shí)驗(yàn)室。

蔗糖、硫代巴比妥酸、山梨醇、氯化鉀、濃硫酸、二甲苯、5，5′-二硫代雙、三氯乙酸、蘇木精、伊紅、曲拉通(Tritonx-100)、鉬酸銨、硫酸亞鐵、無(wú)水乙醇、濃鹽酸、無(wú)水硫酸銅等，均為分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

FA2004 型電子天平，南京東邁科技儀器有限公司；ECLIPES 80i高級(jí)研究級(jí)顯微鏡，日本尼康株式會(huì)社；SG2 pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；D-130電動(dòng)勻漿機(jī)，維根技術(shù)(北京)有限公司；LRH-100CL 低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；GL-20B 高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 原料處理

金針菇洗凈、凍干、碾成粉末，用2%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))KOH溶液于100 ℃處理2.5 h，10 000 r/min離心15 min， 重復(fù)3次后蒸發(fā)濃縮上清液，在濃縮液中加乙酸中后加過(guò)量乙醇，使?jié)饪s液產(chǎn)生沉淀，將沉淀清洗、透析、過(guò)柱純化，得到FVP，分子質(zhì)量為106 kDa。

三文魚(yú)段運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室后，立即將其切成10 cm×5 cm×2 cm的魚(yú)片，然后將魚(yú)片隨機(jī)分成5組，分別在蒸餾水，0.09、0.12、0.15 mg/mL FVP以及4%蔗糖和4%山梨醇(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)混合液中浸漬10 min， 撈出后瀝干表面水分，裝入自封袋中。所有樣品先放到-60 ℃冰箱中快速降至中心溫度-18 ℃，然后再置于-18 ℃冰箱貯存，每隔15 d隨機(jī)取樣測(cè)定指標(biāo)，每組指標(biāo)做3個(gè)平行組。

1.2.2 肌原纖維蛋白提取

參照KATOH等[6]的方法進(jìn)行肌原纖維蛋白的提取，每個(gè)樣品取5 g剁碎的三文魚(yú)肉依次加入40 mL 不同蛋白提取液10 000 r/min均質(zhì)2 min，在4 ℃、 5 000 r/min離心15 min，除去離心上清液，取沉淀進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)，蛋白提取液依次為:40 mmol/L Tris-Maleat，0.16 mol/L KCl，1% Triton，pH 7.5; 40 mmol/L Tris-Maleat，0.16 mol/L KCl，pH 7.5，提取過(guò)程全程冰浴，提取完后用雙縮脲法測(cè)定蛋白濃度，配制成2 mg/mL 進(jìn)行后續(xù)指標(biāo)測(cè)定，置于4 ℃冰箱保存。

1.2.3 TBARS值

參考SALIH等[7]的方法測(cè)定TBARS值，略有改動(dòng)。取將三文魚(yú)肉剁碎，稱取5.00 g加入25 mL 20%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))三氯乙酸，均質(zhì)成勻漿，靜置2 h后10 000 r/min 離心15 min，然后將上清液用蒸餾水定容至50 mL，取5 mL混合液加入5 mL 0.02 mol/L 的硫代巴比妥酸溶液，沸水浴20 min。水浴后流水冷卻至澄清，在532 nm出測(cè)定吸光度。

1.2.4 總巰基含量

依據(jù) SIMPLICIO等[8]的方法測(cè)定總巰基含量，在波長(zhǎng)412 nm處測(cè)定吸光度。每毫升2 mg/mL的肌原纖維蛋白加入9 mL Tris-HCl緩沖液(8 mol/L尿素、10 mmol/L 二乙烯三胺、2%十二烷基硫酸鈉，pH 6.8)，然后根據(jù)5，5′-二硫代雙顯色結(jié)果計(jì)算巰基含量。

1.2.5 Ca2+-ATPase 活性

根據(jù) BENJAKUL等[9]的方法進(jìn)行測(cè)定三文魚(yú)Ca2+-ATPase 活性，結(jié)果以1 mg蛋白每分鐘生成無(wú)機(jī)磷量(μmol)來(lái)表示。

1.2.6 顯微鏡觀察

組織切片參考KAALE等[10]的方法，略作修改。將三文魚(yú)片切成4 cm×4 cm×3 mm小塊置于Carnoy試劑(乙醇與冰醋酸體積比3∶1)，-18 ℃固定24 h。依次使用70%、80%、90%、95%、100%(體積分?jǐn)?shù))乙醇脫水1 h，然后使用二甲苯透明45 min，65 ℃浸蠟2 h，用石蠟包埋后切成8 μm薄片，37 ℃烘片4 h，然后進(jìn)行脫蠟，用伊紅和蘇木精染色，使用光學(xué)顯微鏡尼康ECLIPES 80i觀察。

1.2.7 二級(jí)結(jié)構(gòu)

參考劉芳芳等[11]的方法，將蛋白樣品凍干，將干粉與溴化鉀以質(zhì)量比1∶100的比例研磨壓片，用傅里葉紅外光譜在400～4 000 cm-1范圍內(nèi)掃描測(cè)定吸光度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Origin Pro 9.1進(jìn)行圖像繪制，SPSS 23軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，具體使用單因素ANOVA中的Duncan模型，P<0.05表示數(shù)據(jù)間有顯著性差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 TBARS值

脂肪氧化會(huì)產(chǎn)生過(guò)氧化物，這些過(guò)氧化物隨后會(huì)降解成醛、酮等次級(jí)產(chǎn)物，這些化合物會(huì)加劇油脂的酸敗，并產(chǎn)生刺鼻的氣味[12]。硫代巴比妥酸法就是利用氧化終產(chǎn)物會(huì)與硫代巴比妥酸在高溫下生成紅色產(chǎn)物的原理測(cè)定脂肪氧化情況。魚(yú)類(lèi)凍藏過(guò)程中同樣會(huì)發(fā)生脂肪氧化，凍藏中生成的冰晶會(huì)破壞細(xì)胞，使之釋放出促進(jìn)氧化的物質(zhì)[13]。對(duì)于多脂魚(yú)來(lái)說(shuō)，脂肪氧化造成的品質(zhì)劣變比微生物的影響更大[14]。當(dāng)TBARS值>0.5 mg MDA/kg時(shí)，脂肪氧化產(chǎn)生的異味可被聞到[15]。如圖1所示，新鮮三文魚(yú)的TBARS值為(0.08±0.02) mg MDA/kg，凍藏過(guò)程中TBARS值不斷上升。其中，蒸餾水組TBARS值增加最快，在120 d達(dá)到0.585 mg MDA/kg，F(xiàn)VP組和商業(yè)抗凍劑均能有效抑制TBARS值的增長(zhǎng)(P<0.05)，0.15 mg/mL FVP抑制效果最好。FVP具有清除自由基的能力，即使多糖的添加量很少，也能達(dá)到抗氧化效果。凍藏過(guò)程中TBARS值的主要影響因素為氧氣，除了添加抗氧化劑外還可以選用氧氣阻隔性更好的包裝材料來(lái)抑制脂肪氧化。還有研究發(fā)現(xiàn)，反復(fù)凍融使細(xì)胞中的水分發(fā)生重結(jié)晶，產(chǎn)生大冰晶破壞細(xì)胞膜，從而加速肉類(lèi)脂肪氧化[16]。因此，在凍藏過(guò)程中控制凍藏溫度穩(wěn)定也是保持肉類(lèi)品質(zhì)的方法。

圖1 FVP對(duì)凍藏三文魚(yú)片TBARS值的影響

2.2 總巰基含量

總巰基包括活性巰基和隱藏巰基，是穩(wěn)定蛋白空間結(jié)構(gòu)，反映蛋白氧化程度的重要指標(biāo)。其中，活性巰基又可分為在肌球蛋白頭部的SH1、SH2和位于輕鏈酶解肌球蛋白中的SHa[17]。蛋白冷凍變性會(huì)造成蛋白空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，隱藏巰基暴露，蛋白發(fā)生交聯(lián)產(chǎn)生二硫鍵[18]，從而使巰基含量進(jìn)一步下降，其中，活性巰基更容易被氧化成二硫鍵。此外，高溫貯藏也會(huì)使巰基含量下降[19]。各組三文魚(yú)總巰基含量的變化如圖2所示。在前30 d，巰基含量下降幅度較大，而后下降趨勢(shì)變緩，到貯存末期，蒸餾水、0.09、0.12、 0.15 mg/mL FVP，4%蔗糖+4%山梨醇處理組的總巰基含量分別為初始值的21.3%、27.4%、29.8%、34.7%、31.4%。三文魚(yú)蛋白在貯藏前期巰基下降最快可能是因?yàn)樵谇捌诩词沟鞍桌鋬鲎冃猿潭容^小，但暴露在蛋白分子外部的巰基已被氧化[20]。到貯藏后期，蛋白變性和脂肪氧化產(chǎn)生的自由基可能是巰基含量進(jìn)一步下降的主要原因。FVP和商業(yè)抗凍劑處理組的巰基含量始終高于蒸餾水組可能是因?yàn)镕VP雖然濃度較低，但是其抗氧化作用抑制了巰基的氧化，而商業(yè)抗凍劑中較高濃度的蔗糖和山梨醇在三文魚(yú)片表面形成了一層糖膜，有一定阻隔氧氣的作用。

圖2 FVP對(duì)凍藏三文魚(yú)片總巰基含量變化影響

2.3 Ca2+-ATPase 活性

Ca2+-ATPase 活性常用單位時(shí)間內(nèi)肌球蛋白中的ATP酶被Ca2+賦活后催化ATP水解產(chǎn)生的無(wú)機(jī)磷含量來(lái)判斷[μmol/(mg·min)]。Ca2+-ATPase活性來(lái)源于肌球蛋白頭部。因此，可根據(jù)Ca2+-ATPase活性的下降程度來(lái)大致判斷肌原纖維蛋白變性情況。關(guān)于凍藏過(guò)程中Ca2+-ATPase活性下降的原因可能是肌球蛋白中的活性巰基氧化成二硫鍵，使得蛋白分子發(fā)生交聯(lián)，肌球蛋白頭部與ATP的接觸減少[21]。此外，Ca2+-ATPase 活性還與蛋白分子中的氫鍵、二硫鍵以及疏水相互作用相關(guān)[22]。由圖3可知，前15 d，凍藏三文魚(yú)Ca2+-ATPase活性下降最明顯，降幅依次為34.1%、31.1%、24.5%、23.9%、26.9%，后期下降速度放緩。總體而言，F(xiàn)VP和商業(yè)抗凍劑都達(dá)到了抑制Ca2+-ATPase活性下降的作用(P<0.05)，貯藏末期各組Ca2+-ATPase活性依次為0.091、0.118、0.135、 0.182、0.166 μmol/(mg·min)。Ca2+-ATPase活性的變化過(guò)程與總巰基的變化相似，此結(jié)果與曹淑敏等[23]的研究結(jié)果一致。巰基中的SH1和SH2和Ca2+-ATPase都位于肌球蛋白頭部，蛋白變性過(guò)程中，肌球蛋白頭部更容易受到影響[23]。關(guān)于FVP抑制Ca2+-ATPase活性下降的原因可能是多糖含有大量羥基，這些羥基可以和蛋白中的水分子以氫鍵的形式結(jié)合，抑制了凍藏過(guò)程中結(jié)合水向自由水轉(zhuǎn)化，減少蛋白因結(jié)合水流失而脫水聚集變性。

圖3 FVP對(duì)凍藏三文魚(yú)片Ca2+-ATPase 活性的影響

2.4 冰晶生長(zhǎng)情況

凍藏是目前水產(chǎn)品的主要保藏方式，但由于凍藏設(shè)備的限制，在長(zhǎng)時(shí)間的凍藏過(guò)程中難免會(huì)產(chǎn)生溫度波動(dòng)，促進(jìn)水產(chǎn)品中的冰發(fā)生重結(jié)晶而造成冰晶數(shù)量減少，體積增大，細(xì)胞內(nèi)溶液因細(xì)胞外溶液冷凍濃縮而發(fā)生遷移，而使肌纖維發(fā)生脫水，冰晶體有更大的成長(zhǎng)空間[24]。這不僅會(huì)對(duì)細(xì)胞造成機(jī)械損傷，還會(huì)在水產(chǎn)品解凍后增大汁液流失率，從而造成水產(chǎn)品營(yíng)養(yǎng)流失，減少水產(chǎn)品保質(zhì)期。

由圖4可知未經(jīng)冷凍的新鮮三文魚(yú)組織呈致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，排列緊密，組織結(jié)構(gòu)清晰。凍藏120 d后，組織形狀發(fā)生了變化，肌纖維均有不同程度的破裂。三文魚(yú)組織使用固定劑固定后，被蘇木精和伊紅試劑染色，未被染上顏色的部分為凍藏時(shí)在組織中的冰晶。圖4中可以看到蒸餾水組的組織凍藏120 d后生成的冰晶較大，冰晶形狀不規(guī)整，組織被分成較小的塊狀。其余凍藏120 d的實(shí)驗(yàn)組生成的冰晶較小，并且可明顯在圖中看到冰晶的形狀較規(guī)則、圓潤(rùn)，對(duì)組織的破壞也較小。其中0.15 mg/mL 的FVP處理組生成的冰晶最為細(xì)小、致密，抑制重結(jié)晶效果最好。糖類(lèi)含有大量羥基，可將水分子束縛在蛋白表面，抑制冰晶生長(zhǎng)[25]。羥基數(shù)目越多，糖的抗凍效果越好。FVP作為大分子多糖還可能形成玻璃態(tài)體系，在玻璃態(tài)體系下，組織中的水達(dá)到最大凍結(jié)濃縮狀態(tài)，此時(shí)水分子的遷移速度大大降低，可以有效避免蛋白之間聚集變性[26]以及冰的重結(jié)晶。

圖4 FVP對(duì)凍藏三文魚(yú)片冰晶大小的影響

2.5 紅外光譜分析

紅外光譜圖中波數(shù)為1 600～1 700 cm-1(酰胺Ⅰ帶)的區(qū)間常用來(lái)分析蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)變化[27]，確定蛋白各種二級(jí)結(jié)構(gòu)的相對(duì)含量。一般來(lái)說(shuō)，β-折疊在1 600～1 640 cm-1附近有較強(qiáng)的吸收峰，無(wú)規(guī)卷曲的吸收峰出現(xiàn)在1 640～1 650 cm-1附近，α-螺旋在1 650～1 660 cm-1附近有弱吸收峰，β-轉(zhuǎn)角在1 660～1 700 cm-1附近。α-螺旋和β-折疊是二級(jí)結(jié)構(gòu)主要組成部分，兩者分別依賴分子內(nèi)氫鍵和分子間氫鍵形成[28]。本實(shí)驗(yàn)中，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)以光譜圖二次求導(dǎo)后的吸收峰面積變化來(lái)表示蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，占比為峰面積比。

由圖5可知，凍藏120 d后，與新鮮三文魚(yú)相比，β-折疊比例下降，其余含量均有所上升。FVP處理的3個(gè)組β-折疊含量升高，β-轉(zhuǎn)角含量降低，無(wú)規(guī)卷曲含量略有降低，α-螺旋含量升高較少。4%蔗糖和4%山梨醇處理組β-折疊含量降低，無(wú)規(guī)卷曲含量略降，β-轉(zhuǎn)角含量略升，α-螺旋含量增加比例小于蒸餾水組，大于FVP處理組。不同抗凍保護(hù)劑對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響各有不同。凍藏過(guò)程中，蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量是波動(dòng)變化的，低溫有利于α-螺旋的含量增加，與大分子糖相比，小分子糖處理會(huì)促進(jìn)α-螺旋的形成[29]。不同抗凍保護(hù)劑對(duì)蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的影響各有不同。與無(wú)規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角相比，α-螺旋和β-折疊是相對(duì)比較穩(wěn)定、有序的結(jié)構(gòu)，新鮮三文魚(yú)α-螺旋和β-折疊的總占比為70%左右，凍藏后蒸餾水組降低到約55%，F(xiàn)VP處理的魚(yú)片α-螺旋和β-折疊總和均保持在77%以上，因此FVP可能會(huì)使蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)逐漸由無(wú)序向有序轉(zhuǎn)變。

圖5 FVP對(duì)凍藏三文魚(yú)片蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)分布的影響

3 結(jié)論與討論

魚(yú)肉的含水量高達(dá)70%～80%。魚(yú)體水分含量高，水分活性強(qiáng)，這是魚(yú)肉在常溫貯藏下比禽畜肉更容易受到微生物污染而腐敗變質(zhì)的重要原因。而在凍藏中，這2個(gè)因素也會(huì)造成魚(yú)體內(nèi)產(chǎn)生大量冰晶，造成組織機(jī)械損傷。評(píng)價(jià)凍藏魚(yú)品質(zhì)的指標(biāo)，如巰基、TBARS值、Ca2+ATPase活性、持水性、冰晶等，往往是相互聯(lián)系的，即一個(gè)指標(biāo)的變化可能會(huì)造成其他指標(biāo)變化。冰晶的重結(jié)晶是指小冰晶升華形成的蒸氣聚集到大冰晶周?chē)?，凝聚成更大的冰晶，以及組織內(nèi)未凍結(jié)部分的水遷移到大冰晶周?chē)龠M(jìn)其生長(zhǎng)。FVP可以清除自由基，抑制TBARS值的上升和巰基被氧化，阻斷脂肪氧化產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物對(duì)蛋白的破壞。同時(shí)，F(xiàn)VP通過(guò)羥基結(jié)構(gòu)和形成玻璃態(tài)固定水分子抑制水分子遷移，減少蛋白質(zhì)脫水聚集變性。同時(shí)，水分子遷移被抑制還可以減緩冰重結(jié)晶，生成小冰晶可以減少細(xì)胞完整性被破壞，減少魚(yú)肉營(yíng)養(yǎng)成分流失。在本研究中，0.09、0.12、0.15 mg/mL 的FVP均對(duì)抑制蛋白冷凍變性和脂肪氧化等起到了較好的效果，在此濃度范圍內(nèi)，0.15 mg/mL的FVP效果最佳。