真空預(yù)冷結(jié)合氮?dú)獍b對(duì)小白杏采后活性氧代謝的調(diào)節(jié)作用

田全明，魏佳，王曼，鄧豪，王霞偉，伊麗達(dá)娜·迪力夏提，楊海燕，吳斌*

1(新疆農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科學(xué)與藥學(xué)學(xué)院，新疆 烏魯木齊，830052) 2(新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工研究所，新疆 烏魯木齊，830091)

新疆杏品種資源豐富，2019年杏種植面積為108 800 hm2， 產(chǎn)量達(dá)到84.38萬t[1]。小白杏是南疆輪臺(tái)和庫(kù)車地區(qū)特有的品種，因其肉質(zhì)細(xì)嫩、風(fēng)味獨(dú)特、營(yíng)養(yǎng)豐富，深受廣大消費(fèi)者喜愛。由于小白杏采后機(jī)械損傷和呼吸作用較快，會(huì)迅速出現(xiàn)衰老、腐爛、脫水、組織軟化等現(xiàn)象，嚴(yán)重影響小白杏物流運(yùn)輸過程中的商品價(jià)值[2]。為提高小白杏的物流品質(zhì)，亟需尋找一種有效的保鮮包裝方式以防控小白杏果實(shí)在貯運(yùn)過程中的衰老。

通常在流通前采用預(yù)冷的方法，延長(zhǎng)其貨架期[3]。真空預(yù)冷能提高荷蘭豆葉綠素含量，較好地保持貯藏品質(zhì)[4]。在生菜中發(fā)現(xiàn)真空預(yù)冷能保持葉綠體和細(xì)胞的完整性，提高酚類物質(zhì)含量，增強(qiáng)抗氧化能力，延長(zhǎng)貯藏期[5]。王娟等[6]在黃花菜中的研究表明，真空預(yù)冷可以快速降溫，去除采后果蔬的田間熱和呼吸熱，抑制呼吸強(qiáng)度的升高，同時(shí)減少維生素C和可溶性固形物等營(yíng)養(yǎng)成分的消耗。真空預(yù)冷在葉菜類應(yīng)用廣泛，但關(guān)于真空預(yù)冷在果品上的研究報(bào)道較少，因此，采用真空預(yù)冷方式快速降低果品田間積熱值得深入研究。

N2熏蒸是一種在果蔬采后貯藏領(lǐng)域的氣體熏蒸保鮮方式。低氧環(huán)境可以降低果蔬內(nèi)部超氧陰離子自由基等多種活性自由基的含量[7]，降低膜脂過氧化程度，使果蔬細(xì)胞膜系統(tǒng)維持較好的選擇透過性[8]。90%(體積分?jǐn)?shù))以上的N2處理能推遲呼吸釋放高峰的出現(xiàn)，延緩果實(shí)可溶性固形物和抗壞血酸含量下降[9]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，杏果實(shí)經(jīng)N2處理后可顯著延緩果實(shí)硬度、可滴定酸含量、總酚含量下降速率，能較好地保持果實(shí)色澤，從而延長(zhǎng)鮮杏的貯藏時(shí)間[10]。目前，大多數(shù)的果品“個(gè)性化”包裝都是采用充氮?dú)獾姆绞剑L(zhǎng)時(shí)間冷鏈運(yùn)輸也會(huì)出現(xiàn)脹袋、酒化、異味等問題。短時(shí)間氮?dú)馓幚頃?huì)抑制果實(shí)衰老進(jìn)程，且氮?dú)獍b研究報(bào)道較少。真空預(yù)冷和N2處理雖然能延緩新鮮果蔬的成熟衰老進(jìn)程，改善貯藏品質(zhì)，但其在延緩杏果實(shí)衰老的問題上研究不夠深入。近年來，將真空預(yù)冷和氣調(diào)熏蒸保鮮技術(shù)結(jié)合的采后果蔬處理方式在國(guó)內(nèi)外受到了廣泛關(guān)注。因此，本研究擬采用真空預(yù)冷結(jié)合N2包裝的方法，對(duì)小白杏進(jìn)行采后處理，研究真空預(yù)冷結(jié)合N2處理方式對(duì)杏果實(shí)采后品質(zhì)及活性氧相關(guān)酶活性的影響，為真空預(yù)冷結(jié)合N2熏蒸處理方式在杏果實(shí)采后保鮮中的應(yīng)用提供理論依據(jù)和技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠熟期小白杏(總可溶性固形物≥12.18%)于2020年5月采自新疆庫(kù)車縣小白杏種植基地。挑選無病蟲害、無機(jī)械損傷，且大小、顏色、外觀一致的小白杏，利用真空預(yù)冷機(jī)將果心溫度預(yù)冷至4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

氫氧化鈉、磷酸氫二鉀、磷酸二氫鉀、冰醋酸、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；聚乙二醇-6000、聚乙烯吡咯烷酮、鹽酸羥胺、對(duì)氨基苯磺酸、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司。以上試劑均為分析純。

1.1.1 試驗(yàn)儀器

P902型電導(dǎo)率儀，上海佑科儀器儀表有限公司；UV-2600型紫外分光光度計(jì)，日本島津公司；A11型研磨機(jī)，廣州IKA實(shí)驗(yàn)室技術(shù)有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品處理

將氣調(diào)包裝機(jī)的氣調(diào)比例調(diào)到100% N2，通過O2和CO2檢測(cè)器測(cè)量確定保鮮盒中的O2濃度≤0.05% (體積分?jǐn)?shù))。將預(yù)冷后的果實(shí)放入保鮮盒中(每盒20個(gè))，進(jìn)行氣調(diào)包裝。用激光打孔機(jī)分別于2、4、6 h后打孔，貯于10 ℃恒溫箱中，每隔3 d測(cè)定各項(xiàng)生理指標(biāo)。杏果實(shí)用液氮凍樣后，放入-40 ℃冰箱貯存。真空預(yù)冷4 ℃、真空預(yù)冷4 ℃結(jié)合N2熏處理2 h分別表示為CK、N2。

1.3 指標(biāo)測(cè)定方法

1.3.1 硬度的測(cè)定

參考曹建康等[11]的方法，每盒隨機(jī)選擇15個(gè)杏果，圍繞果實(shí)的赤道部位，間隔等距離的3個(gè)位置，各削去果皮(厚約1 mm)，用GY-4型果實(shí)硬度計(jì)測(cè)定各個(gè)位置果肉的硬度，重復(fù)3次。最終結(jié)果以平均值計(jì)，單位為N。

1.3.2 呼吸強(qiáng)度的測(cè)定

采用Check Point 3便攜式頂空分析儀測(cè)定。

1.3.3 乙烯釋放量的測(cè)定

參照HU等[12]的方法，稱取5.0 g鮮杏放入到密封的玻璃器皿中，在(20±1) ℃條件下靜置2 h，抽取1.0 mL氣體進(jìn)行乙烯含量的測(cè)定。乙烯釋放量的單位為μL/(kg·h)。

1.3.4 維生素C含量的測(cè)定

稱取10.0 g果蔬樣品置于研缽中，加入少量20 g/L 的草酸溶液，在冰浴條件下研磨成勻漿，轉(zhuǎn)入到100 mL容量瓶中，用20 g/L的草酸溶液定容至刻度，搖勻、提取10 min后，過濾收集溶液備用。用移液管吸取10.0 mL濾液置于100 mL的三角瓶中，用已標(biāo)定的2,6-二氯酚靛酚溶液滴定至微紅，且15 s不褪色。同時(shí)，以10 mL 20 g/L的草酸溶液作為空白按同樣方法進(jìn)行滴定。重復(fù)3次。

1.3.5 細(xì)胞膜透性的測(cè)定

采用電導(dǎo)率儀法[13]進(jìn)行測(cè)定，電導(dǎo)率計(jì)算如公式(1)所示：

(1)

1.3.6 丙二醛含量的測(cè)定

丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量的測(cè)定參考曹建康等[11]的方法。稱取1.0 g果蔬樣品，加入5.0 mL 10%體積分?jǐn)?shù)三氯乙酸(trichloroacetic acid, TCA)溶液，研磨勻漿后，于4 ℃、10 000 r/min 離心20 min，收集上清液。取2.0 mL上清液(對(duì)照空白管中加入2.0 mL 10%TCA溶液代替提取液)，加入2.0 mL 0.67%(體積分?jǐn)?shù))硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid, TBA)，混合后在沸水浴中煮沸20 min， 取出冷卻后再次離心。分別測(cè)定上清液在450、532和600 nm處的吸光度值。重復(fù)3次。

1.3.7 超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率的測(cè)定

參照曹建康等[11]的方法，以1 min 1 g果蔬組織(鮮重)產(chǎn)生的超氧陰離子的物質(zhì)的量作為超氧陰離子的產(chǎn)生速率，表示為nmol/(min·g)。

1.3.8 H2O2含量的測(cè)定

參照VELIKOVA等[14]的方法，稍作修改。稱取1.0 g果蔬樣品，加入1 mL 0.1%(體積分?jǐn)?shù))TCA溶液進(jìn)行提取，于4 ℃、8 000 r/min 離心20 min，收集上清液。取0.5 mL上清液并加入1 mL KI溶液和0.5 mL 磷酸緩沖液。記錄390 nm處的吸光度值，將其表示為μmol/kg。

1.3.9 酶液的提取

參照ALI等[15]的方法，稍作修改。取5.0 g冷凍組織于5 mL磷酸鹽溶液(pH 5.5)中研磨勻漿，8 000 r/min 離心15 min，收集上清液，測(cè)定過氧化氫酶(catalase，CAT)、抗壞血酸過氧化物酶(ascorbate peroxidase，APX)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)活力。

1.3.10 POD活性的測(cè)定

POD活性的測(cè)定參照PARAFATI等[16]的方法，稍加修改。向試管中加入3 mL磷酸緩沖溶液(pH 7.8， 50 mmol/L)、220 μL 0.3%(體積分?jǐn)?shù))愈創(chuàng)木酚和20 μL粗酶液。加入0.3%(體積分?jǐn)?shù))過氧化氫溶液后立即在470 nm下測(cè)定2 min內(nèi)吸光度值的變化。1單位的POD酶活定義為1 min內(nèi)吸光度值增加0.01，其結(jié)果表示為U/g。

1.3.11 CAT活性的測(cè)定

CAT活性的測(cè)定參照曹建康等[11]的方法，稍作修改。向試管中加入100 μL粗酶和2.9 mL 20 mmol/L 過氧化氫溶液。15 s后記錄反應(yīng)體系在240 nm處的吸光值，作為初始值，然后每隔30 s記錄1次，連續(xù)測(cè)定6個(gè)數(shù)據(jù)，重復(fù)3次。以1 g克鮮重1 min 吸光度變化值減少0.01為1個(gè)過氧化氫酶活性單位，用U/g表示。

1.3.12 SOD活性的測(cè)定

SOD活性的測(cè)定參照參照曹建康等[11]的方法，以每分鐘每克果蔬組織(鮮重)的反應(yīng)體系對(duì)氮藍(lán)四唑(yingwenquancheng，NBT)光化還原的抑制為50%為1個(gè)超氧化物歧化酶活性單位，用U/g表示。

1.3.13 PPO活性的測(cè)定

PPO活性的測(cè)定參照PAN等[17]的方法，稍加修改。向試管中加入4 mL磷酸緩沖溶液(50 mmol/L)、0.1 mL 粗酶液、0.9 mL 鄰苯二酚(50 mmol/L)。以蒸餾水為參比空白，15 s后記錄在420 nm處的吸光值，作為初始值，然后每隔30 s記錄1次，連續(xù)測(cè)定6個(gè) 數(shù)據(jù)，重復(fù)3次。將單位PPO酶活性定義為在420 nm 每分鐘吸光度增加0.01單位，PPO活性表示為U/g。

1.3.14 APX活性的測(cè)定

APX活性的測(cè)定參照曹建康等[11]的方法，稍加修改。向試管中加入磷酸鉀緩沖液(50 mmol/L，pH 7.3)、 1 mmol/L還原型抗壞血酸、0.1 mmol/L乙二胺四乙酸、1 mmol/L過氧化氫溶液和0.1 mL上清液。1個(gè)酶活單位定義為在290 nm下混合液吸光度變化0.01，抗壞血酸過氧化物酶活性表示為U/g。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

使用GraphPad Prism 8.0軟件作圖，SPSS 20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析以及利用Duncan法來比較均值。P≤0.05 表示差異顯著，P≤0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 N2處理對(duì)小白杏硬度的影響

在貯藏期間，小白杏果實(shí)的硬度呈現(xiàn)出逐漸減小的變化趨勢(shì)(圖1)。貯藏至第6天，N2處理的硬度為6.65 N，高于對(duì)照組38.35%。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，經(jīng)真空預(yù)冷結(jié)合N2處理后的小白杏果實(shí)硬度顯著(P<0.05)高于對(duì)照組杏果實(shí)的硬度，說明N2處理能夠較好地保持小白杏的硬度。

圖1 N2處理對(duì)小白杏硬度的影響

2.2 N2處理對(duì)小白杏呼吸強(qiáng)度、乙烯釋放量的影響

呼吸作用是果蔬采后的重要生理活動(dòng)，其強(qiáng)度越大，果蔬內(nèi)部營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗越多，品質(zhì)下降越快[18]。由圖2-a可知鮮杏在貯藏過程中呼吸強(qiáng)度先上升后下降，其中N2能抑制小白杏果實(shí)的呼吸強(qiáng)度并能延緩呼吸高峰的出現(xiàn)。CK在第9天時(shí)達(dá)到呼吸高峰，最大值為81.61 mg/(kg·h)，N2處理組在第12天時(shí)達(dá)到呼吸高峰，最大值為65.37 mg/(kg·h)。與對(duì)照組相比，N2處理能顯著抑制小白杏的呼吸強(qiáng)度(P<0.05)。

在貯藏過程中杏果實(shí)的乙烯釋放量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，由圖2-b可知，CK組在貯藏第9天時(shí)達(dá)到乙烯釋放高峰，其中對(duì)照組乙烯釋放速率高于處理組。N2在貯藏第12天時(shí)達(dá)到乙烯高峰，對(duì)照組乙烯釋放量是N2處理組的1.15倍。因此，N2處理不僅能延緩杏果實(shí)乙烯高峰的出現(xiàn)還能顯著降低乙烯的釋放速率(P<0.05)。

a-呼吸強(qiáng)度；b-乙烯釋放量

2.3 N2處理對(duì)小白杏維生素C含量的影響

維生素C是果蔬重要的營(yíng)養(yǎng)成分之一，同時(shí)也是果實(shí)內(nèi)活性氧的重要抗氧化劑[19]，可有效地保護(hù)細(xì)胞組織免受損害從而延緩果蔬衰老的速度[20]。隨著呼吸作用和自身的氧化消耗，維生素C含量呈現(xiàn)出逐漸下降的趨勢(shì)(圖3)。貯藏至第15天，CK組與N2處理組的含量分別為10.40、12.07 mg/100g。在整個(gè)貯藏期間，處理組明顯高于對(duì)照組(P<0.05)。由此可知，N2處理可以有效保持小白杏果實(shí)的營(yíng)養(yǎng)成分。

圖3 N2處理對(duì)小白杏維生素C含量的影響

2.4 N2處理對(duì)小白杏細(xì)胞膜透性的影響

細(xì)胞膜透性在一定程度上反映了細(xì)胞受傷害和果品的衰老程度[21]。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，杏果實(shí)采后細(xì)胞膜透性持續(xù)上升(圖4)，而N2處理組杏果實(shí)的細(xì)胞膜透性顯著低于CK組(P<0.05)，貯藏至第18天時(shí)，細(xì)胞膜透性分別是74.71%、64.02%，與CK相比，N2處理在一定程度上降低了細(xì)胞膜透性，延緩了果實(shí)的衰老。因此，N2處理有利于保持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，從而抑制果實(shí)中細(xì)胞膜透性的增加。

圖4 N2處理對(duì)小白杏細(xì)胞膜透性的影響

2.5 N2處理對(duì)小白杏丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量的影響

MDA是膜脂過氧化作用的主要產(chǎn)物之一，能反映細(xì)胞膜脂過氧化程度，其含量的積累會(huì)對(duì)果蔬細(xì)胞造成氧化損傷[22]。由圖5可知，鮮杏在貯藏的前15 d， MDA含量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢(shì)，但N2處理組顯著低于CK對(duì)照組(P<0.05)。貯藏至15 d，真空預(yù)冷結(jié)合N2處理組杏果實(shí)的MDA含量是對(duì)照組的71.36%。所以，N2處理能顯著抑制MDA含量的積累(P<0.05)。

圖5 N2處理對(duì)小白杏MDA含量的影響

2.6 N2處理對(duì)小白杏超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率和過氧化氫含量的影響

超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率和過氧化氫含量呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)(圖6)。貯藏至12 d時(shí)，N2處理組、CK組超氧陰離子產(chǎn)生速率分別為27.78、37.02 nmol/(min·g)，過氧化氫含量分別為42.64、19.32 μmol/kg。在整個(gè)貯藏期間，N2處理組杏果實(shí)的超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率、過氧化氫含量顯著低于CK組(P<0.05)。

a-超氧陰離子自由基產(chǎn)生速率；b-過氧化氫含量

2.7 N2處理對(duì)小白杏活性氧代謝相關(guān)酶活性的影響

在整個(gè)貯藏期間，處理組和對(duì)照組POD的活性呈現(xiàn)出先上升后下降再上升的趨勢(shì)(圖7)。對(duì)照組與N2處理組酶活性分別在第9天、第12天達(dá)到最大值，分別為1.45、2.01 U/g。N2處理顯著(P<0.05)提高POD活性，在整個(gè)貯藏期間POD都相對(duì)穩(wěn)定，并處于較高的活性水平。

CAT、APX活性呈現(xiàn)逐漸減小的變化趨勢(shì)。由圖7可知，在整個(gè)貯藏期間N2處理組CAT、APX活性始終高于對(duì)照組，第9天時(shí)N2處理組CAT、APX活性分別是對(duì)照組的1.39倍、1.46倍，N2處理能夠延緩CAT、APX活性的降低。

SOD活性呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，由圖7可知，N2處理組的SOD活性始終高于對(duì)照組。對(duì)照組與N2處理組SOD活性分別于第9天、第12天達(dá)到最大值，分別為1.06、1.41 U/g。N2處理能夠延緩SOD活性高峰的出現(xiàn)。

貯藏0～12 d對(duì)照組果實(shí)多酚氧化酶活性逐漸升高，之后逐漸下降。如圖7所示，N2處理組中的多酚氧化酶酶活性在貯藏0～15 d呈上升趨勢(shì)，隨后呈下降趨勢(shì)。第15天時(shí)，處理組比對(duì)照組多酚氧化酶活性高24.03%。與N2處理組相比，對(duì)照組在整個(gè)貯藏時(shí)間內(nèi)均保持較高的酶活性。

a-POD；b-CAT；c-SOD；d-PPO；e-APX

3 討論

MDA含量是植物細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度的體現(xiàn)[23]，果實(shí)硬度逐漸下降，細(xì)胞膜透性增加，直接影響了果實(shí)的耐貯性和商品率[24]。本試驗(yàn)中對(duì)照組MDA含量隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)不斷升高且顯著高于處理組，說明貯藏期間細(xì)胞膜質(zhì)過氧化程度不斷升高，細(xì)胞膜受到的傷害逐漸加劇。在N2處理?xiàng)l件下，高抗氧化酶活對(duì)減輕膜脂過氧化有積極的作用，能有效減緩杏果實(shí)中MDA含量的積累和細(xì)胞膜透性的增加。

果蔬的品質(zhì)下降、貨架期縮短與H2O2密切相關(guān)，過氧化氫的增加會(huì)導(dǎo)致膜不飽和脂肪酸的過氧化反應(yīng)，從而產(chǎn)生更高的MDA[25]。在本文中N2處理能有效抑制小白杏貯藏期間MDA、H2O2含量的增加及超氧陰離子自由基生成速率。N2處理組中活性氧積累的減少與MDA含量的降低相一致，表明N2處理可能通過抑制活性氧的積累來防止膜過氧化。

杏果實(shí)的呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量是一系列酶相互作用的結(jié)果，N2處理通過抑制相關(guān)酶活性來降低杏果實(shí)的呼吸作用。杏果實(shí)在呼吸作用下產(chǎn)生大量呼吸積熱，促使小白杏內(nèi)部溫度升高，加速果實(shí)失水，導(dǎo)致品質(zhì)劣變。因此，N2處理能顯著(P<0.05)抑制小白杏果實(shí)在貯藏過程中呼吸強(qiáng)度的升高，較好地保持鮮杏品質(zhì)。在本研究中，POD活力的變化趨勢(shì)與果實(shí)呼吸強(qiáng)度變化趨勢(shì)一致，表明POD活力與呼吸強(qiáng)度、乙烯的生物合成以及細(xì)胞衰老密切相關(guān)。在桃[26]、藍(lán)莓[27]和甜櫻桃[28]的研究中發(fā)現(xiàn)，提高抗氧化能力能消除活性氧的過量產(chǎn)生，延緩果實(shí)衰老進(jìn)程。CAT、SOD和APX是活性氧清除的關(guān)鍵酶，能清除活性氧，防止活性氧的積累[29]。N2處理能促進(jìn)抗氧化酶SOD活力增加、延緩CAT、APX活力的降低、維持活性氧代謝平衡、抑制呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量、誘導(dǎo)抗氧化酶活力、抑制自由基的累積、維持細(xì)胞的穩(wěn)定，延緩小白杏果實(shí)采后衰老進(jìn)程。

4 結(jié)論

小白杏果實(shí)的衰老與活性氧代謝密切相關(guān)。真空預(yù)冷結(jié)合N2熏蒸通過提高PPO、POD、SOD、CAT、APX活性，延緩呼吸強(qiáng)度和乙烯釋放量，從而抑制果實(shí)硬度的下降和細(xì)胞膜透性的增加，延緩杏果實(shí)的衰老。因此，真空預(yù)冷結(jié)合N2處理技術(shù)作是一種安全有效、便于應(yīng)用的保鮮方式，可為小白杏采后保鮮貯藏及提高果實(shí)物流品質(zhì)提供理論和技術(shù)支持。