煮制加工對(duì)黑豆中多酚類代謝產(chǎn)物的影響

于淼，王長(zhǎng)遠(yuǎn),2，王霞*

1(黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué) 食品學(xué)院，黑龍江 大慶，163319) 2(國(guó)家雜糧工程技術(shù)研究中心，黑龍江 大慶，163319)

黑豆是豆科植物大豆屬的黑色種子，又名黑大豆，在我國(guó)種植范圍廣、產(chǎn)量大[1]。研究表明黑色谷物的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值普遍高于其他同類淺色食品，相比其他雜糧全谷物豆類，黑豆中多酚類化合物含量高且種類豐富，富含的多酚與黃酮成分賦予了黑豆許多生理功能[2]。多酚類化合物對(duì)抗氧化、抗炎、抗癌、降血脂等慢性疾病起到了預(yù)防和調(diào)節(jié)的作用，具有良好的醫(yī)用價(jià)值[3-6]。黑豆被稱為“豆中之王”，常吃黑豆益于健康，日常人們多數(shù)將黑豆煮制加工成黑豆粥、黑豆飯、黑豆?jié){等進(jìn)行食用，而黑豆中多酚類化合物內(nèi)的酚羥基基團(tuán)在高溫條件下不穩(wěn)定，熱加工會(huì)對(duì)其功能性質(zhì)和生物利用度產(chǎn)生影響[7]。研究發(fā)現(xiàn)，煮制處理后大豆總酚和總黃酮含量均低于未加工處理狀態(tài)的大豆，且豆類種子經(jīng)過常壓煮制加工后，大概有26%～52%的多酚類化合物流失到豆湯中[8-9]。劉婷婷[10]研究發(fā)現(xiàn)黑大豆、黑小豆、紅小豆、綠豆、紅蕓豆、紫花蕓豆的總酚含量均在煮制后下降，喬麗華[11]的研究也同樣證實(shí)了黑豆中多酚類化合物的含量受溫度環(huán)境的影響產(chǎn)生了顯著差異。盡管如此，目前針對(duì)黑豆多酚類化合物的研究仍集中在含量和抗氧化活性的變化上，關(guān)于黑豆在加工前后多酚類化合物的組成仍不清晰，這影響著黑豆的營(yíng)養(yǎng)分析和功能評(píng)價(jià)。代謝組學(xué)技術(shù)依靠高通量、高靈敏度、檢測(cè)范圍廣的特點(diǎn)可以對(duì)生物樣品中的小分子代謝產(chǎn)物進(jìn)行定性和定量分析，在營(yíng)養(yǎng)科學(xué)和植物代謝研究方面被廣泛應(yīng)用[12-13]。

本研究對(duì)黑豆進(jìn)行煮制加工，比較煮制前后總酚含量和總黃酮含量的變化，基于超高效液相色譜-四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱質(zhì)譜(ultra performance liquid chromatography-quadrupole-electrostatic field orbitrap mass spectrometry，UHPLC-QE-MS)技術(shù)，應(yīng)用非靶向代謝組學(xué)方法，檢測(cè)煮制前后黑豆多酚類化合物的組成及含量，分析其差異性變化，為黑豆加工過程中化學(xué)物質(zhì)表征和功能成分研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黑豆產(chǎn)自黑龍江省，市售；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品、蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品，美國(guó)Sigma公司；DPPH、福林酚，上海源葉生物科技有限公司；甲醇(LC-MS級(jí))、乙腈(LC-MS級(jí))，CNW Technologies公司；乙酸銨(LC-MS級(jí))，SIGMA-ALDRICH公司；乙酸(LC-MS級(jí))，F(xiàn)isher Chemical公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MJ-10A高速萬能粉碎機(jī)、MB-WFS4029美的電飯煲，美的生活電器制造有限公司；Vanquish超高效液相、Q Exactive HFX高分辨質(zhì)譜、Heraeus Fresco17離心機(jī)，Thermo Fisher Scientific；BSA124S-CW天平，Sartorius；PS-60AL超聲儀，深圳市雷德邦電子有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 原料預(yù)處理

黑豆洗凈后于烘箱烘干，美的電飯煲中加入500 mL 去離子水，水沸騰后立即加入50 g黑豆，煮制40 min，將豆子取出瀝干水分，放入烘箱烘干至恒重。加工后的黑豆與新鮮黑豆分別使用粉碎機(jī)研磨成豆粉；過80目篩；使用石油醚進(jìn)行脫脂處理。完成后密封放入冰箱保存。

稱取3 g黑豆粉，加入45 mL 70%(體積分?jǐn)?shù))乙醇，超聲800 W提取30 min后離心(4 000 r/min)10 min，取上清液，沉淀按上述步驟再重復(fù)提取2次，合并3次 上清液，40 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，定容至10 mL備用。

1.3.3 黑豆活性成分的測(cè)定

(1)總酚的測(cè)定

根據(jù)Folin-Ciocalteu法稍作修改[14]繪制沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程：y=5.380 7x-0.007 5， 回歸系數(shù)R2=0.999 2。其中：y為吸光度；x為沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)液濃度，mg/mL。準(zhǔn)確吸取1 mL樣品溶液于25 mL的具塞試管中；分別加入福林酚試劑1 mL及質(zhì)量分?jǐn)?shù)為12%的碳酸鈉溶液2 mL并定容至刻度線，室溫25 ℃下避光反應(yīng)2 h；在765 nm波長(zhǎng)處測(cè)定樣品的吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算公式得出黑豆總酚的含量?？偡雍康挠?jì)算如公式(1)所示：

(1)

式中:ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得提取液總酚質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為稱取的黑豆粉質(zhì)量，g。

利用粒子群算法和模擬退火粒子群算法對(duì)設(shè)計(jì)的矩形LED陣列進(jìn)行尋優(yōu)，得到LED間最優(yōu)的距離分別為4.74 cm和2.29 cm。粒子群算法仿真結(jié)果如圖5所示，模擬退火粒子群算法仿真結(jié)果如圖6所示。

(2)總黃酮的測(cè)定

根據(jù)高麗威等[15]的方法稍作修改繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得線性回歸方程：y=0.630 5x+0.000 9，回歸系數(shù)R2=0.999 1。其中：y為吸光度；x為蘆丁標(biāo)準(zhǔn)液質(zhì)量濃度，mg/mL。準(zhǔn)確吸取樣品溶液2.0 mL放置于10 mL的容量瓶中；加3 mL體積分?jǐn)?shù)為70%的乙醇溶液，再加入5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的亞硝酸鈉溶液0.3 mL， 搖勻靜置6 min；加入100 g/L的硝酸鋁溶液0.3 mL，搖勻靜置6 min；加入40 g/L的氫氧化鈉溶液4 mL，再用70%的乙醇定容至刻度，搖勻靜置12 min； 在510 nm 下測(cè)定吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線和計(jì)算公式得出黑豆總黃酮的含量?？傸S酮含量的計(jì)算如公式(2)所示：

(2)

式中:ρ為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線算得提取液總黃酮質(zhì)量濃度，mg/mL；V為提取液體積，mL；N為稀釋倍數(shù)；M為稱取的黑豆粉質(zhì)量，g。

1.4 UHPLC-QE-MS分析

移取100 μL樣品至EP管中，加入400 μL提取液(甲醇，含同位素標(biāo)記內(nèi)標(biāo)混合物)，渦旋混勻30 s， 超聲10 min(冰水浴)，-40 ℃靜置1 h。然后將樣品4 ℃，12 000 r/min離心15 min，取上清液于進(jìn)樣瓶中上機(jī)檢測(cè)。

本研究使用Vanquish (Thermo Fisher Scientific)超高效液相色譜儀，通過Waters ACQUITY UPLC HSS T3 (2.1 mm×100 mm×1.8 μm)液相色譜柱對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行色譜分離。液相色譜A相為水相，含5 mmol/L 乙酸銨和5 mmol/L乙酸，B相為乙腈。樣品盤溫度：4 ℃，進(jìn)樣體積：3 μL。Thermo Q Exactive HFX質(zhì)譜儀條件為：質(zhì)譜電壓4.0 kV(正離子)、3.8 kV(負(fù)離子)；鞘氣流速30 arb；輔助氣流速10 arb；Full MS分辨率60 000；MS/MS分辨率7 500；離子傳輸管溫度350 ℃。

1.5 數(shù)據(jù)處理

原始數(shù)據(jù)經(jīng)ProteoWizard軟件轉(zhuǎn)成mzXML格式后，使用自主編寫的R程序包(內(nèi)核為XCMS)進(jìn)行峰識(shí)別、峰提取、峰對(duì)齊和積分等處理，然后與BiotreeDB(V2.1)自建二級(jí)質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)匹配進(jìn)行物質(zhì)注釋，算法打分的Cutoff值設(shè)為0.3。

2 結(jié)果與分析

2.1 黑豆總酚和總黃酮含量變化

表1為煮制對(duì)黑豆總酚、總黃酮含量的影響。由表1可以看出，煮制加工使黑豆總酚和總黃酮含量發(fā)生明顯下降，總酚含量下降59.06%，總黃酮含量下降64.74%。 煮制加工導(dǎo)致了黑豆中多酚類化合物的流失與降解，這與喬麗華[11]的研究結(jié)果相符。由于水分的存在，通常也會(huì)加劇熱處理的程度，加速多酚類物質(zhì)的氧化損失。

表1 新鮮黑豆與煮制黑豆總酚和總黃酮含量 單位：mg/g

2.2 代謝物定性結(jié)果

代謝物通過BiotreeDB數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行定性，代謝物定性結(jié)果如表2所示。新鮮黑豆(r)中共檢測(cè)出89個(gè) 多酚類化合物，煮制加工后的黑豆(p)中共檢測(cè)出86個(gè)多酚類化合物。2組樣品比較，同時(shí)存在的多酚類化合物有83個(gè)，新鮮黑豆獨(dú)有多酚類化合物6個(gè)，煮制加工黑豆獨(dú)有多酚類化合物3個(gè)。

表2 多酚類代謝物定性結(jié)果

續(xù)表2

由表2可知，2組樣品共定性出92個(gè)多酚類化合物，包括53個(gè)黃酮類化合物，其中22個(gè)為異黃酮類化合物、8個(gè)酚酸類化合物、7個(gè)酚類化合物、8個(gè)木脂素類化合物、6個(gè)香豆素類化合物、5個(gè)苯丙素類化合物、3個(gè)花青素類化合物以及2個(gè)芪類化合物。豆異黃酮、木犀草素、黃豆苷元、染料木苷、芹菜素-7-葡萄糖苷等多酚類化合物的檢出與XU等[16]和FENG等[17]的研究結(jié)果相吻合，并且朱怡霖等[18]的研究從橫山老黑豆多酚類化合物中分離出原兒茶酸、沒食子酸、染料木苷、大豆苷元等酚酸類化合物和異黃酮類化合物。這與本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)的黑豆中多酚類化合物的組成結(jié)果相似，但本實(shí)驗(yàn)更系統(tǒng)地定性出黑豆及煮制加工后黑豆的組成成分。從代謝物數(shù)量的方面來看，83個(gè)多酚類化合物共同存在于新鮮黑豆與煮制黑豆中，主要為黃酮類和酚類化合物，這些物質(zhì)在熱處理前后仍然存在，說明其對(duì)溫度變化具有一定的穩(wěn)定性。新鮮黑豆中獨(dú)有的多酚類代謝物數(shù)量略高于加工后的黑豆，2組黑豆樣品獨(dú)有的多酚類代謝物主要集中在黃酮類、酚類以及木脂素類化合物上。值得一提的是新鮮黑豆中多酚類代謝物含有的表兒茶素和苯酚在經(jīng)過常壓煮制后完全消失，這種情況的發(fā)生可能與表兒茶素在熱處理后易發(fā)生差向異構(gòu)化作用或變旋作用有關(guān)[19]，此種黃酮物質(zhì)具有諸多生理活性，如抗氧化、抗炎、保護(hù)神經(jīng)、抑菌等作用。而苯酚作為結(jié)構(gòu)最簡(jiǎn)單的酚類化合物最容易受到外界溫度升高的刺激，增加其酚羥基的電離，使其更容易分解流失于水中。除此之外，在加工后的黑豆中檢測(cè)到的咖啡醇也是新鮮黑豆中不含有的。由此說明，黑豆經(jīng)常壓煮制后，其多酚類代謝物的種類發(fā)生變化，而這種高變化也將影響著黑豆的生物活性和功能評(píng)價(jià)。

2.3 新鮮黑豆與煮制加工黑豆中酚類物質(zhì)差異性分析

2.3.1 主成分分析(principal component analysis，PCA)

對(duì)樣品進(jìn)行主成分分析，判別新鮮黑豆與煮制加工黑豆各組樣本之間和組內(nèi)樣本之間的變異度大小。圖1為兩樣品的PCA得分圖，R2X=0.942>0.5，說明擬合性較好，主成分1(PC1)的貢獻(xiàn)率為 77.5%，主成分2(PC2)的貢獻(xiàn)率為11.2%。此外，所有樣本點(diǎn)都處在95%的置信區(qū)間內(nèi)，且2組樣本在二維圖上表現(xiàn)出明顯的分離趨勢(shì)，同時(shí)煮制加工黑豆樣本點(diǎn)的距離要大于新鮮黑豆。PCA結(jié)果表明，煮制對(duì)黑豆多酚類化合物具有顯著影響。

圖1 r組與p組的PCA模型得分散點(diǎn)圖

2.3.2 正交偏最小二乘法-判別分析(orthogonal projections to latent structures- discriminant analysis，OPLS-DA)

PCA法雖然能夠有效地提取主要信息，但是對(duì)于相關(guān)性較小的變量不敏感，而OPLS-DA可以使組間區(qū)分最大化，有利于尋找差異代謝物。圖2為煮制前后黑豆的OPLS-DA得分圖。

圖2 r對(duì)p的OPLS-DA模型得分散點(diǎn)圖

根據(jù)OPLS-DA模型對(duì)92種多酚類化合物數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，煮制加工黑豆樣品分布在置信區(qū)間的左側(cè)，新鮮黑豆樣品分布在置信區(qū)間的右側(cè)，2組樣品的區(qū)分效果非常明顯。分布形態(tài)上看，存在一定差異，r樣本點(diǎn)離散程度要大于p樣本點(diǎn)，這可能與煮制加工會(huì)促進(jìn)黑豆多酚類化合物與自身蛋白質(zhì)、多糖等物質(zhì)的相互作用，導(dǎo)致其空間結(jié)構(gòu)與組分含量的變化有關(guān)。OPLS-DA得到2個(gè)主成分，主成分1的貢獻(xiàn)率為52%、主成分2的貢獻(xiàn)率為12.2%，R2X=0.642，R2Y=1、Q2=0.978，其中Q2>0.9 為出色的模型，相比于PCA模型效果更好。再次說明煮制加工對(duì)黑豆多酚類化合物具有顯著的影響。

2.4 差異代謝物的篩選

以O(shè)PLS-DA模型主成分的 VIP>1 且t檢驗(yàn)的P值<0.05為標(biāo)準(zhǔn)，篩選出黑豆在煮制前后的多酚類差異代謝物，結(jié)合數(shù)據(jù)庫(kù)通過保留時(shí)間等條件與庫(kù)中物質(zhì)進(jìn)行匹配，從而進(jìn)行兩黑豆樣本差異代謝物的定性，定性結(jié)果如表3所示。

表3 多酚類差異代謝物定性結(jié)果

差異代謝物是指加工前后同時(shí)存在的，但是含量上存在顯著差異的物質(zhì)。高溫?zé)崽幚頃?huì)導(dǎo)熱不穩(wěn)定的植物多酚類化合物發(fā)生降解或化學(xué)氧化形成醌類化合物[20]。煮制過程中由于水分的存在，通常會(huì)加劇熱處理程度，加速多酚類物質(zhì)的氧化損失。r與p代謝物對(duì)比，共篩選出47個(gè)多酚類差異代謝物，多數(shù)為黃酮類、異黃酮類及其衍生物、酚酸類化合物，還有少量的木脂素類、苯丙素類、花青素類化合物。由表2可知，在47個(gè)差異物質(zhì)中，r黑豆樣本中有31個(gè)多酚類代謝物的含量高于p，其中李屬素、異鼠李素、木犀草素、香樹素等黃酮類化合物含量顯著下降，說明溫度對(duì)黃酮類化合物的穩(wěn)定性和生物活性具有一定影響，影響程度與化合物的結(jié)構(gòu)有關(guān)，如羥基化程度和位置、取代基的存在[21]。沒食子酸、原兒茶酸、丁香酸、高香草酸作為黑豆中常見的酚酸類物質(zhì)在煮制后的損失同樣較為嚴(yán)重，相比之下沒食子酸受加工帶來的影響最小，梁亞靜[22]的研究得到了同樣的結(jié)果。p樣本中有16個(gè)多酚類代謝物的含量高于r，這些物質(zhì)包含異黃酮類及其異黃酮的衍生物和花青素類化合物，在煮制加工過程中它們的含量得到了提升，倍性變化在1.05～7.41倍。

6″-O-Malonylwistin、6″-O-乙酰染料木苷、6″-O-乙酰大豆苷、6″-O-乙酰甘氨酸等異黃酮類化合物的相對(duì)含量呈上升趨勢(shì)，表明熱處理能夠破壞黑豆黃酮類化合物與單糖或多糖部分之間的OH基團(tuán)(O-糖苷)，降解一部分乙酰基葡萄糖苷型類黃酮使之成為游離態(tài)，導(dǎo)致某些異黃酮類化合物含量的升高[23]，其次，適當(dāng)?shù)臒崽幚砜墒固崛÷瘦^低的結(jié)合態(tài)酚類化合物半溶出，以提高其含量[24]。矢車菊素3-(4-乙酰葡萄糖苷)、氯化錦葵色素-3-β-葡糖苷等花青素類化合物的含量變化趨勢(shì)并不一致，其原因可能是熱處理過程使能夠降解花青素類化合物的多酚氧化酶失去了活性，因此部分黑豆的花青素類化合物含量在受熱過程中有所增加[25]。柚皮素、高良姜素、甘草苷、富馬酸、Genistein 5-glucoside、二氫香豆素等多酚類化合物差異不顯著，表明其熱穩(wěn)定性強(qiáng)于其他酚類化合物，其原因可能是此類化合物中含有苯環(huán)及碳碳雙鍵等穩(wěn)定的化學(xué)結(jié)構(gòu)。其次，苯酚上的羥基與多糖上的氧原子間會(huì)形成氫鍵，這種相互作用可以形成葡聚糖凝膠，提高多酚類化合物的穩(wěn)定性[26]。黑豆在加工后65.9%的多酚類差異代謝物含量發(fā)生了下降，這與其總酚含量和總黃酮含量的下降存在密切聯(lián)系。綜上所述，煮制加工作為豆類食品最常用的一種傳統(tǒng)加工熟化方式，加工過程中部分多酚類化合物的含量呈現(xiàn)出顯著性的差異，適當(dāng)?shù)臒峒庸ひ部梢蕴岣吆诙故称返倪m口性和營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[27]。結(jié)果表明，煮制加工對(duì)黑豆中多酚類物質(zhì)的含量具有顯著影響。

2.5 差異代謝物的聚類分析

以上分析得到的差異代謝物在生物學(xué)上往往具有結(jié)果和功能的相似性和互補(bǔ)性，或者受同一代謝通路的正、負(fù)調(diào)控。因此選擇聚類分析將具有相近性質(zhì)的對(duì)象化為一類，而將較大性質(zhì)差異的對(duì)象歸到不同類[28]，結(jié)果如圖3所示。

圖3為黑豆經(jīng)煮制加工前后的差異組分層次聚類分析熱力圖，橫坐標(biāo)r和p分別代表新鮮黑豆樣本和煮制加工黑豆樣本，縱坐標(biāo)代表2種黑豆樣本對(duì)比的差異代謝物名稱，熱力圖的顏色代表了代謝物的豐度，紅色為高表達(dá)組分，藍(lán)色為低表達(dá)組分，顏色由藍(lán)到白再到紅代表著代謝物豐度逐漸升高。圖3可以分成上下2個(gè)區(qū)域，上半?yún)^(qū)域的原兒茶酸、(-)-表阿夫兒茶精、黃豆苷元、根皮苷、沒食子酸、丁香酸等此類酚酸類化合物與黃酮類化合物表達(dá)量明顯高于p樣 本；下半?yún)^(qū)域的富馬酸、地奧司明、白皮杉醇、豆苷、柚皮素等此類酚類化合物與異黃酮類化合物表達(dá)量明顯高于r樣本。根據(jù)觀察顏色變化差異得出木犀草苷、三葉苷、芹菜素-7-葡萄糖苷、辣椒素酯等物質(zhì)存在極顯著差異；沒食子酸、丁香酸、黃豆黃素、二氫香豆素、高香草酸等物質(zhì)存在差異顯著，這與表3結(jié)果相似。通過層次聚類分析可以看出，煮制加工對(duì)黑豆多酚類代謝物產(chǎn)生的影響顯著，黑豆中大部分多酚類物質(zhì)在經(jīng)過煮制加工后含量有所減少。這些差異代謝物是眾多代謝物中因煮制加工而導(dǎo)致的含量變化顯著的物質(zhì)，則差異代謝物對(duì)于黑豆功能性食品的開發(fā)與研究具有一定的參考意義。

圖3 r對(duì)p的層次聚類分析熱力圖

3 結(jié)論

本研究通過對(duì)黑豆煮制加工前后總酚、總黃酮的含量進(jìn)行比較，并基于UHPLC-QE-MS代謝組學(xué)平臺(tái)，較系統(tǒng)地明確了新鮮黑豆和煮制加工黑豆的多酚類化合物組成。通過顯著變化的多酚類化合物，為探索煮制對(duì)多酚類化合物的影響及代謝機(jī)制提供參考。研究表明，煮制加工對(duì)黑豆中多酚類化合物的數(shù)量、種類及含量均具有影響，其中含量上的差異最為顯著，且加工對(duì)黃酮類化合物影響最顯著。多酚類化合物作為具有多種生物功能活性的化學(xué)物質(zhì)，下一步可對(duì)其加工后的功能活性變化進(jìn)行研究，而且還可深入探討加工對(duì)黑豆中酚類物質(zhì)構(gòu)效關(guān)系的影響。