非靶向代謝組技術(shù)研究飲料發(fā)酵前后物質(zhì)變化

張妍，趙昕琪，王天琪，王成，于冰，呂佳璐，張莉力，許云賀

(錦州醫(yī)科大學(xué) 食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧 錦州，121000)

隨著人們生活水平的提高，乳酸菌飲料受到了人們的關(guān)注。乳酸菌具有改善腸道菌群，降低膽固醇，增強(qiáng)人體免疫力的功效。乳酸菌發(fā)酵能改善食品的品質(zhì)、風(fēng)味。目前，市場上大多數(shù)乳酸菌飲料是以牛奶為基質(zhì)，但隨著乳糖不耐受人群的出現(xiàn)和素食主義者的增加，牛奶基質(zhì)的乳酸菌飲料已不能滿足市場需求。

乳酸菌發(fā)酵可以產(chǎn)生許多活性物質(zhì)，其益生功能已經(jīng)成為食品以及臨床醫(yī)學(xué)等領(lǐng)域研究的熱點。微生物可以將原料經(jīng)特定的代謝途徑轉(zhuǎn)化為易于人體吸收、利用的物質(zhì)。微生物生長代謝過程中激活活性成分，從而產(chǎn)生新的功效，提高營養(yǎng)價值，促進(jìn)機(jī)體的吸收和利用。玉米作為中國重要的糧食作物之一，主要用于淀粉的提取，玉米須、玉米皮很少被開發(fā)利用。隨著科技的進(jìn)步及產(chǎn)業(yè)化條件的成熟，玉米副產(chǎn)物的開發(fā)前景十分可觀。玉米須和玉米皮有降血壓、降血脂和降血糖等功效；玉米及其副產(chǎn)物發(fā)酵飲料作為玉米精深加工技術(shù)的一種應(yīng)用，采用微生物發(fā)酵和飲料加工技術(shù)，保留了原料自身天然活性物質(zhì)的同時，降低原料中淀粉、蛋白質(zhì)、不溶性纖維等大分子物質(zhì)，提高了飲料口感和穩(wěn)定性，是玉米及其副產(chǎn)物研發(fā)的新方向。

為了解玉米及其副產(chǎn)物發(fā)酵飲料的主要代謝成分，代謝通路及物質(zhì)積累的變化，本實驗以2種乳酸菌為發(fā)酵劑混合發(fā)酵的玉米及其副產(chǎn)物飲料為研究對象，利用非靶向代謝組技術(shù)對飲料發(fā)酵前后小分子量物質(zhì)變化進(jìn)行了對比分析，將比較得到的顯著性差異代謝物進(jìn)行KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)代謝通路富集分析。探究LactobacillusparacaseiL1和LactobacilluscaseiYQ336代謝特征及加工學(xué)原理，以期為玉米副產(chǎn)物發(fā)酵飲料加工工藝改良，滋味品質(zhì)提升和功能性成分富集等方面研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

L.paracaseiL1、L.caseiYQ336于錦州醫(yī)科大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院微生物實驗室保存，該菌株已保藏到中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC4163)[1]。

玉米粒、鮮胡蘿卜、玉米須、玉米皮等為原料，經(jīng)煮制，打碎，過濾，調(diào)配和滅菌工藝處理得到發(fā)酵前玉米副產(chǎn)物飲料(B組)，在發(fā)酵前的玉米副產(chǎn)物飲料中接種L.paracaseiL1和L.caseiYQ336，37 ℃發(fā)酵15 h后得到玉米副產(chǎn)物發(fā)酵飲料(A組)。

Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀，美國AB SCIEX公司；Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(Agilent)，美國安捷倫公司；ACQUITY BEH C18色譜柱 (100 mm×2.1 mm, 1.7 μm) ，上海希言科學(xué)儀器有限公司；乙腈、乙酸銨、甲醇、氨水 均為色譜純，美國BCL公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品信息

檢測樣本見表1。共2組待測樣本，每組6個平行，同時制備了控制樣本(quality control，QC)，用來平衡色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)及測定儀器狀態(tài)，評價系統(tǒng)的穩(wěn)定性[2]。

表1 樣品信息

1.2.2 代謝物提取

取樣品于4 ℃解凍，冷凍干燥后加入200 μL預(yù)冷水和800 μL預(yù)冷的V(甲醇)∶V(乙腈)=1∶1混合溶液，混勻，-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白，16 000×g、4 ℃ 離心20 min，取上清液。上清液在高速真空濃縮離心機(jī)揮干。質(zhì)譜檢測時加入100 μL的V(乙腈)∶V(水)=1∶1混合溶液進(jìn)行復(fù)溶，16 000×g、4 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析[3]。

1.2.3 色譜分離

將樣品放在4 ℃進(jìn)樣器中自動進(jìn)樣，采用Agilent1 290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)(ultra high performance liquid chromatography，UHPLC)，HILIC色譜柱對樣品進(jìn)行分離。進(jìn)樣量5 μL，柱溫25 ℃，流速0.3 mL/min；梯度洗脫程序見表2[4]。

表2 梯度洗脫表

1.2.4 質(zhì)譜采集

采用電噴霧電離對各個樣品進(jìn)行正負(fù)離子模式檢測。樣品經(jīng)UHPLC分離再用Triple-TOF 5600質(zhì)譜儀進(jìn)行質(zhì)譜分析。ESI源條件如下：離子源氣體1，60 psi；離子源氣體2，60 psi；氣簾氣壓力，30 psi；源溫度 600 ℃；m/z掃描范圍：60～1 200 u；產(chǎn)物離子掃描m/z范圍：25～1 000 u；掃描累積時間 0.15 s/光譜；產(chǎn)物離子掃描累積時間0.03 s/光譜。二級質(zhì)譜采用依賴型掃描采集獲得，并且采用高靈敏度模式，去簇電壓±60 V(正負(fù)兩種模式)，碰撞能量30 eV[5]。

1.3 統(tǒng)計分析

數(shù)據(jù)利用MSDIAL采集，再用程序XCMS進(jìn)行峰對齊、保留時間校正和提取峰面積。比對HMDB、MassBank 等公共數(shù)據(jù)庫。根據(jù)提取的物質(zhì)含量進(jìn)行篩選鑒定。使用SIMCA-P 14.1處理數(shù)據(jù)，經(jīng)Pareto scaling預(yù)處理后，進(jìn)行主成分分析(principal component analysis，PCA)、偏最小二乘法判別分析(partial least squares discriminant analysis，PLS-DA)和正交偏最小二乘法判別分析(orthogonal partial least squares discriminant analysis，OPLS-DA)等多元統(tǒng)計分析[6]。

2 結(jié)果與分析

2.1 飲料發(fā)酵前后色譜圖

所有飲料樣本均在UHPLC-MS平臺上分析,對QC樣本正、負(fù)離子質(zhì)譜總離子流圖(total ion current，TIC)進(jìn)行譜圖疊加比較[7]，見圖1和圖2。結(jié)果表明，各色譜峰的響應(yīng)強(qiáng)度和保留時間基本重疊，說明儀器誤差較小，數(shù)據(jù)可靠。

圖1 QC樣品正離子模式總離子流色譜圖

圖2 QC樣品負(fù)離子模式總離子流色譜圖

2.2 飲料發(fā)酵前后代謝物PCA

通過MSDIAL軟件提取代謝物離子峰[8]。將所有實驗樣本和QC樣本提取得到的峰，經(jīng)Pareto scaling處理后進(jìn)行PCA，經(jīng)7次循環(huán)交互驗證得到PCA模型如圖3所示，QC樣本較緊密聚集，說明實驗的重復(fù)性良好。

圖3 主成分分析圖

2.3 飲料發(fā)酵前后代謝物PLS-DA

將A組與B組數(shù)據(jù)處理后，得到PLS-DA得分圖。如圖4所示，飲料發(fā)酵前后的代謝產(chǎn)物明顯分離，表明各組之間存在顯著差異，全部樣品組都位于置信區(qū)間內(nèi)，建立比較組的PLS-DA模型，經(jīng)7次循環(huán)交互驗證得到的模型評價參數(shù)(R2Y，Q2),R2Y=0.999 和Q2=0.96均接近 1，表明模型越穩(wěn)定可靠。

圖4 飲料發(fā)酵前后的PLS-DA模型得分圖

2.4 飲料發(fā)酵前后代謝物的OPLS-DA

將A組與B組數(shù)據(jù)處理后，得到OPLS-DA得分圖。如圖5所示，飲料發(fā)酵前后的代謝產(chǎn)物明顯分離，表明各組之間存在顯著差異，全部樣品組都位于置信區(qū)間內(nèi)，同時參數(shù)R2Y=0.999，Q2=0.939均接近1，說明模型穩(wěn)定，數(shù)據(jù)可靠。結(jié)果顯示，截距Q2=-0.173 <0，表明OPLS-DA模型不存在過擬合。

a-模型得分圖；b-置換檢驗圖

2.5 飲料發(fā)酵前后的差異代謝物鑒定

根據(jù)OPLS-DA結(jié)果，變量影響投影(variable in-fluence on projection, VIP)值來衡量各代謝物的組間差異對各組樣本分類判別的影響強(qiáng)度[9]。本實驗中以VIP>1且P<0.05作為具有顯著性差異代謝物篩選條件。對發(fā)酵前后的飲料進(jìn)行比較，共檢測出顯著差異代謝物30類131種。主要包括氨基酸及其衍生物，有機(jī)酸及其衍生物，核苷酸，黃酮類，酯類等5類，分別占比為14.5%，18.3%，10.7%，9.9%，9.2%。

2.6 飲料發(fā)酵前后差異代謝豐度變化分析

以差異倍數(shù)(fold change, FC)>2或FC<0.5，且VIP>1，P< 0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)，圖6顯示了比較A組和B組的火山圖。圖中紅色點表示上調(diào)，綠色點表示下調(diào)。由圖6可以看出其中58種代謝物顯著上調(diào)，73種代謝物顯著下調(diào)。

圖6 飲料發(fā)酵前后的火山圖

2.7 主要差異代謝成分分析

比較發(fā)酵飲料前后樣品中代謝成分的差異倍數(shù)變化，以FC>70和FC<0.014且VIP>1，P<0.05為指標(biāo)，變化顯著的代謝物共篩選出14種如表3所示，其中提高的代謝物有7種，主要包括萘酚類衍生物1種，核苷酸1種，苯丙酸1種，氨基酸及其衍生物2種，黃酮類2種。降低的有7種，主要包括煙酰胺類1種，抗生素1種，有機(jī)酸2種，核苷酸2種，磷酸酰肌醇類1種。

表3 飲料發(fā)酵前后差異代謝物

2.8 代謝通路分析

通路富集分析可獲得63種差異代謝通路，其中27個通路存在顯著差異(P<0.05)。其中排在前10的代謝通路見圖7。差異代謝物數(shù)量富集最多的前5條通路分別是(1)纈氨酸，亮氨酸和異亮氨酸的生物合成(valine, leucine and isoleucine biosynthesis)，主要包括甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸的代謝等23種代謝成分;(2)酪氨酸代謝(tyrosine metabolism)，主要包括苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成，異喹啉生物堿生物合成等78種代謝成分；(3)雙組分系統(tǒng)(two-component system)，主要包括光合作用，肽聚糖生物合成，氧化磷酸化等53種代謝成分；(4)嘌呤代謝(purine metabolism)，主要包括磷酸戊糖途徑，丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代謝，硫胺素代謝，組氨酸代謝等95種代謝成分；(5)檸檬酸循環(huán)(citrate cycle)，主要包括氧化磷酸化，二羧酸代謝，脂肪酸生物合成等20種代謝成分。

圖7 顯著差異代謝物 KEGG富集圖

3 討論與結(jié)論

以2種乳酸菌為發(fā)酵劑混合發(fā)酵的玉米副產(chǎn)物飲料為研究對象，從發(fā)酵飲料中檢測出518種代謝產(chǎn)物，差異代謝物131種占總代謝物的25%。主要包括氨基酸及其衍生物、有機(jī)酸及其衍生物、核苷酸、黃酮類和酯類等5類，分別占比為14.5%、18.3%、10.7%、9.9%、9.2%。氨基酸是構(gòu)建細(xì)胞、修復(fù)組織的基礎(chǔ)材料，是機(jī)體生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)物質(zhì)，也是調(diào)節(jié)代謝，增加抵抗力所需物質(zhì)[10]，氨基酸缺乏會導(dǎo)致低血糖[11]。有機(jī)酸類似于抗生素具有殺菌和抑菌的特性[12]。核苷酸具有抗氧化作用，食物中缺乏核苷酸可損害肝臟、心臟、腸道和免疫系統(tǒng)[13]。黃酮類化合物具有抗腫瘤、抗炎、降血糖、抗菌、抗病毒活性[14]以及良好的抗氧化活性[15]。酯類化合物具有抗氧化、抗癌、降低膽固醇、減肥、降血糖血脂等多種生理功能[16]。

飲料發(fā)酵后顯著變化的主要有增加了13 548倍的1-羥基-2-萘甲酸，其具有抗病毒、降血壓、抗癌等功效[17]；增加了326倍異戊烯，異戊烯有多抗病菌、降血壓、抗真菌、抗氧化、抗艾滋病病毒、抗腫瘤等功效[18]；增加了208倍的表兒茶素，表兒茶素對心腦血管有防治作用，是金蕎麥抗菌、消炎、鎮(zhèn)咳的主要成分[19]，同時還有預(yù)防腫瘤和抗氧化作用[20]。

差異代謝物數(shù)量富集最多的前5條通路中，L-亮氨酸與L-異亮氨酸、L-纈氨酸均是必需氨基酸之一，也被稱為支鏈氨基酸，能促進(jìn)人體肌肉發(fā)育，增強(qiáng)肝臟免疫力，緩解疲勞，更容易降低肥胖者體重[21]。亮氨酸可對危重病人提供所需營養(yǎng)，也可調(diào)節(jié)哺乳動物骨骼肌蛋白質(zhì)的代謝。還可加速體內(nèi)脂肪氧化分解[22]。L-異亮氨酸能促進(jìn)人體新陳代謝，補(bǔ)充人體必需營養(yǎng)物質(zhì)。酪氨酸的代謝紊亂可引發(fā)多種遺傳性疾病，如尿黑酸癥[23]，纈氨酸可以治療營養(yǎng)不良癥[24]；對于大多數(shù)的原核生物和極少數(shù)的真核生物而言，雙組分系統(tǒng)在適應(yīng)環(huán)境等方面非常重要[25]。嘌呤代謝提供了大量重要生物合成所需的能量和輔助因子可作為癌細(xì)胞增殖的能量和底物[26]。嘌呤代謝異常能引發(fā)很多疾病如痛風(fēng)、免疫系統(tǒng)疾病、血液疾病、腎臟疾病等[27]。檸檬酸循環(huán)是生物體內(nèi)糖類、脂肪和蛋白質(zhì)等能量營養(yǎng)物質(zhì)氧化供能的共同途徑，還是生物體內(nèi)能量營養(yǎng)物質(zhì)生物氧化“逐步釋能”的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[28]。

本研究建立了基于超高效液相色譜-四極桿飛行時間質(zhì)譜技術(shù)的非靶向代謝組學(xué)方法[29]。對發(fā)酵前后代謝物進(jìn)行初步鑒定比較，該方法具有良好的重復(fù)性和精密度。確定了乳酸菌能夠促進(jìn)玉米及其副產(chǎn)物發(fā)酵飲料次級代謝的合成和積累，為乳酸菌用于玉米及其副產(chǎn)物飲料的發(fā)展提供理論參考。