天麻酵素化過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)及抗氧化活性動(dòng)態(tài)變化

趙敏，王瑜，李立郎，安正斌，解春芝，林靈，楊小生，楊娟*

1(貴州大學(xué) 釀酒與食品工程學(xué)院，貴州 貴陽(yáng)，550025) 2(藥用植物功效與利用國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(貴州醫(yī)科大學(xué))，貴州 貴陽(yáng)，550014) 3(貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽(yáng)，550014) 4(徐州工程學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，江蘇 徐州，221018)

天麻是我國(guó)傳統(tǒng)的名貴中藥材，為蘭科天麻屬植物天麻(Gastrodiaelata)的干燥塊莖[1]，主產(chǎn)于貴州、四川、云南等地。天麻中含有天麻素、巴利森苷、對(duì)羥基苯甲醇等活性成分[2]，具有增強(qiáng)記憶、改善老年癡呆、抗衰老、鎮(zhèn)靜催眠等功效[3]。天麻的食用方式主要是將鮮天麻炮制成天麻粉，但其不利于人體吸收且天麻本身具有不良的“馬尿臭”氣味[4]，難以被消費(fèi)者接受。酵素是以動(dòng)植物、食用菌等為原料，添加或不添加輔料，經(jīng)微生物發(fā)酵制得的含有特定生物活性成分的產(chǎn)品[5]。大量研究表明，酵素具有抗氧化、降脂、解酒、促進(jìn)消化等[6]功效。因此，通過(guò)酵素化工藝處理是天麻深加工的一種途徑。隨著對(duì)天麻的食用安全性的深入研究，2020年貴州已將天麻作為新資源食品開(kāi)展了試點(diǎn)工作。因此，從食品的角度開(kāi)發(fā)天麻具有重要的應(yīng)用前景。而目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)天麻的研究主要關(guān)注于藥理作用，對(duì)于鮮天麻酵素化過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)和抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化研究少有報(bào)道。

因此，本研究以鮮天麻為研究對(duì)象，通過(guò)氨基酸自動(dòng)分析儀、固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜(solid phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)天麻酵素化過(guò)程中游離氨基酸和揮發(fā)性物質(zhì)變化進(jìn)行研究，同時(shí)采用試劑盒對(duì)酵素化過(guò)程中的總抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)、DPPH自由基清除能力與超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性進(jìn)行定量分析，以期初步明晰天麻酵素化過(guò)程中的風(fēng)味物質(zhì)及抗氧化活性成分動(dòng)態(tài)變化，為天麻的高值化利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

德江天麻，貴州省德江縣綠通天麻發(fā)展有限公司；發(fā)酵劑，貴州省中國(guó)科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室自制，優(yōu)勢(shì)菌株為酵母菌，乳酸菌，醋酸菌；纖維素酶，南寧龐博生物工程有限公司；磺基水楊酸，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；SOD活性、DPPH自由基清除能力、T-AOC檢測(cè)試劑盒，北京索萊寶科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HP6890/5975C氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)Agilent公司；固相微萃取裝置，美國(guó)Supelco公司；S433D型全自動(dòng)氨基酸分析儀，德國(guó)Sykam公司；YH-A20002型電子天平，瑞安市英衡電器有限公司；22010型攪拌機(jī)，佛山艾詩(shī)凱奇電氣有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 天麻的發(fā)酵工藝

新鮮天麻清洗干凈后打漿，裝入發(fā)酵壇內(nèi)按照其質(zhì)量比1∶1加入沸水(溫度>90 ℃)攪拌熟化，再添加10%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的白砂糖，攪拌使白砂糖完全溶化，待溫度降至50～60 ℃時(shí)，添加0.02%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的纖維素酶，待溫度降至30～40 ℃時(shí)，最后添加0.03%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的發(fā)酵劑，用保鮮膜密封發(fā)酵壇，在無(wú)氧條件下發(fā)酵10 d后，去掉保鮮膜換成紗布進(jìn)行有氧發(fā)酵，發(fā)酵到第30天，用牛皮紙封口貯藏陳釀，陳釀至60 d結(jié)束發(fā)酵。

樣品的取樣時(shí)間分別為：0 d(加發(fā)酵劑前)；7 d(發(fā)酵液開(kāi)始澄清)；10 d(無(wú)氧發(fā)酵結(jié)束)；20 d(形成菌膜)；30 d(菌膜穩(wěn)定，完成發(fā)酵)；60 d(貯藏陳釀階段)。每個(gè)階段取樣后，將樣品置于-80 ℃的超低溫冰箱內(nèi)保存待測(cè)。

1.3.2 游離氨基酸含量的測(cè)定

采用氨基酸自動(dòng)分析儀進(jìn)行檢測(cè)，準(zhǔn)確稱(chēng)取1.022 g 磺基水楊酸至100 mL容量瓶中并定容，配制成1%的磺基水楊酸溶液；取不同樣品1 mL分別加入9 mL磺基水楊酸溶液，振蕩均勻，10 000 r/min離心15 min，上清液經(jīng)0.22 μm水系濾膜過(guò)濾后上機(jī)檢測(cè)。

1.3.3 揮發(fā)性成分的測(cè)定

萃取方法：取樣品5 mL置于固相微萃取儀采樣瓶中，插入裝有2 cm-50/30 μm DVB/CAR/PDMS StableFlex纖維頭的手動(dòng)進(jìn)樣器，在60 ℃的平板加熱條件下頂空萃取60 min后，移出萃取頭并立即插入氣相色譜儀進(jìn)樣口(溫度250 ℃)中，熱解析進(jìn)樣。

氣相色譜條件：色譜柱為Agilent HP-5MS(60 m×0.25 mm，0.25 μm)彈性石英毛細(xì)管柱，初始溫度42 ℃ (保留2 min)，以3.5 ℃/min升溫至189 ℃，再以8 ℃/min升溫至310 ℃，運(yùn)行時(shí)間：67.13 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為高純He(99.999%)；柱前壓111 212.43 pa，載氣流量1.0 mL/min，分流比10∶1，溶劑延遲時(shí)間1 min。

質(zhì)譜條件：離子源為EI源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；發(fā)射電流34.6 μA； 倍增器電壓1 671 V；接口溫度280 ℃；質(zhì)量范圍29～500 amu。對(duì)總離子流圖中的各峰經(jīng)質(zhì)譜計(jì)算機(jī)數(shù)據(jù)系統(tǒng)檢索及核對(duì)Nist 17和Wiley 275標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖，確定X種揮發(fā)性化學(xué)成分，用峰面積歸一化法測(cè)定各化學(xué)成分的相對(duì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

1.3.4 抗氧化活性的測(cè)定

T-AOC、DPPH自由基清除能力、SOD活性均采用試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

T-AOC按公式(1)計(jì)算，以Fe2+終濃度為橫坐標(biāo)，以不同濃度Fe2+對(duì)應(yīng)的吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線為Y=5.104 8X+0.004 4，R2=0.999 8，線性較好，可用于后期實(shí)驗(yàn)。

(1)

式中：V1為反應(yīng)總體積，1.02 mL；V2為反應(yīng)中樣品體積，0.03 mL；X為標(biāo)準(zhǔn)曲線中的函數(shù)變量。

DPPH自由基清除率按公式(2)計(jì)算：

(2)

式中：A0、A1、A2分別為空白管、對(duì)照管和測(cè)定管于515 nm處測(cè)定的吸光值。

SOD活性按公式(3)～公式(6)計(jì)算：

ΔA1=A1-A2

(3)

ΔA0=A10-A20

(4)

(5)

(6)

式中：A1、A2、A10、A20分別為測(cè)定管、對(duì)照管、空白管1和空白管2于560 nm處測(cè)定的吸光值；F為樣品稀釋倍數(shù)。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

使用Excel 2018對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行錄用和計(jì)算，采用Data Analysis對(duì)氣質(zhì)聯(lián)用的峰面積進(jìn)行積分與提取，Origin 9.0軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 天麻酵素化過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)分析

2.1.1 天麻酵素化過(guò)程中游離氨基酸含量與組成分析

由表1可知，天麻酵素化過(guò)程中氨基酸的總含量(total content of amino acids，TAA)呈先下降后上升的趨勢(shì)，可能是發(fā)酵前期酵母菌利用葡萄糖和氨基酸進(jìn)行無(wú)氧發(fā)酵轉(zhuǎn)化為酒精以及氨基酸自身的氧化降解，導(dǎo)致氨基酸含量降低；發(fā)酵后期氨基酸含量上升，可能是微生物細(xì)胞中的氨基酸溶出造成[7]。必需氨基酸(essential amino acids，EAA)影響食物營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，聯(lián)合國(guó)糧農(nóng)組織和世界衛(wèi)生組織提出氨基酸以EAA/TAA約40.00%為佳[8]，天麻汁的EAA/TAA為18.26%，經(jīng)陳釀后天麻酵素中的EAA/TAA可達(dá)到50.76%，比天麻汁增加2.7倍，說(shuō)明天麻汁酵素化處理后營(yíng)養(yǎng)價(jià)值更高。

表1 天麻酵素化過(guò)程中氨基酸質(zhì)量變化

滋味活度值(taste activity value，TAV)[9]表示氨基酸含量與其味覺(jué)閾值比值。TAV>1時(shí)，則該氨基酸對(duì)樣品的滋味有貢獻(xiàn)，TAV與氨基酸滋味的貢獻(xiàn)呈正比，當(dāng)TAV<1時(shí)，該氨基酸對(duì)樣品的滋味沒(méi)有貢獻(xiàn)。由表2可知，天麻汁中絲氨酸(Ser)、甘氨酸(Gly)、丙氨酸(Ala)、組氨酸(His)、天冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、賴(lài)氨酸(Lys)、纈氨酸(Val)、精氨酸(Arg)的TAV均>1，說(shuō)明這9種氨基酸對(duì)天麻汁的滋味貢獻(xiàn)較大，其中谷氨酸(17.10)和精氨酸(4.88)的TAV最大，Glu可提供強(qiáng)烈的鮮味，Arg具有苦澀味[10]，天麻汁以鮮味和苦味為主，此時(shí)呈現(xiàn)一定的鮮甜味和苦澀味，滋味不佳。經(jīng)陳釀后，苦味氨基酸中精氨酸的TAV下降，甜味氨基酸中Ala和His的TAV上升，甜味和鮮味是天麻酵素的主要呈味氨基酸，此時(shí)鮮甜味濃郁、苦味淡薄，滋味更佳。

表2 天麻酵素化過(guò)程中游離氨基酸的TAV變化

2.1.2 天麻酵素化過(guò)程中揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析

由表3可知，天麻汁(發(fā)酵0 d)共檢出26種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類(lèi)5種，相對(duì)含量為8.30%；醛酮類(lèi)和酯類(lèi)均為4種，含量分別為6.40%、3.90%；烷烴類(lèi)種類(lèi)最多為8種，含量可達(dá)3.61%；萜烯類(lèi)種類(lèi)最少為1種，相對(duì)含量為2.81%；醚類(lèi)2種，醚類(lèi)含量最高為74.18%。醚類(lèi)在天麻汁中的含量最大，是天麻汁的主要揮發(fā)性物質(zhì)，醚類(lèi)一般具有煙熏、刺鼻、異味等氣味[11]，可能是造成天麻汁馬尿臭氣味、雜味的原因。

表3 天麻酵素化過(guò)程中揮發(fā)性成分的變化 單位：%(相對(duì)含量)

天麻酵素化過(guò)程中(發(fā)酵7～30 d)共檢測(cè)出46種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類(lèi)5種、醛酮類(lèi)和酚類(lèi)均為3種、酯類(lèi)最多為27種、烷烴類(lèi)4種、萜烯類(lèi)2種、酸類(lèi)1種。其中醇類(lèi)在酵素化過(guò)程中呈現(xiàn)先增加后減少的趨勢(shì)，在發(fā)酵20 d相對(duì)含量最高為89.61%。 醇類(lèi)主要來(lái)源于酵母菌等微生物酒精發(fā)酵，對(duì)食品的風(fēng)味有較大的影響，是助香劑也是形成其他風(fēng)味物質(zhì)的前體，少量高級(jí)醇可以使酒體醇甜，香氣豐滿[12]。如乙醇可以賦予食品蘋(píng)果甜香的風(fēng)味特征[13]。苯乙醇具有玫瑰花香和茉莉花香等多種風(fēng)味，給人以柔和愉悅的感覺(jué)[14]。酯類(lèi)物質(zhì)呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，發(fā)酵7 d時(shí)相對(duì)含量最高為18.84%，其中乙酸乙酯、山梨酸乙酯、9-十八酸乙酯、3-苯基丙酸乙酯、苯甲酸乙酯逐漸增加，乙酸異戊酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯先增加后下降。酯類(lèi)是發(fā)酵過(guò)程中酸跟醇發(fā)生反應(yīng)產(chǎn)生的，賦予天麻酵素獨(dú)特的香味[15]。如9-十八酸乙酯有淡淡的花味，辛酸乙酯具有類(lèi)似白蘭地的香氣[16]，苯甲酸乙酯具有濃烈的花香，并帶有水果的清香氣味，癸酸乙酯具有似葡萄的水果香氣[17]。因此，這些酯類(lèi)作為天麻酵素中酯類(lèi)物質(zhì)的骨架成分，對(duì)天麻酵素的品質(zhì)和香氣起著決定性作用。醛酮類(lèi)是由酵母菌代謝產(chǎn)生，風(fēng)味閾值較低，但是醛酮類(lèi)物質(zhì)的香氣能夠作用于感官使得天麻酵素的香氣提升。萜烯類(lèi)主要來(lái)源于植物原料，對(duì)天麻酵素的風(fēng)味具有改善作用。醚類(lèi)、烷烴類(lèi)在發(fā)酵過(guò)程中含量雖然較低，但是豐富了天麻酵素的風(fēng)味層面。與天麻汁相比，經(jīng)過(guò)微生物發(fā)酵后的天麻酵素花果香濃郁、口感柔和且未出現(xiàn)馬尿臭等不良風(fēng)味。說(shuō)明酵素化技術(shù)可以顯著改善天麻本身具有的不良風(fēng)味。

天麻酵素經(jīng)陳釀后(發(fā)酵60 d)共檢測(cè)出49種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，其中醇類(lèi)7種，相對(duì)含量最高可達(dá)66.86%；醛酮類(lèi)、萜烯類(lèi)、酸類(lèi)均為2種，相對(duì)含量分別為0.89%、 0.27%、0.20%；酚類(lèi)4種，相對(duì)含量為2.09%； 酯類(lèi)種類(lèi)最多為20種，相對(duì)含量可達(dá)28.10%， 其中乙酸乙酯的相對(duì)含量最高為11.80%；烷烴類(lèi)8種，相對(duì)含量為0.57%；醚類(lèi)1種，相對(duì)含量為0.44%。相比于發(fā)酵后的天麻酵素，經(jīng)陳釀后醇類(lèi)、醛酮類(lèi)、萜烯類(lèi)、醚類(lèi)含量降低，其中醇類(lèi)可以生成醛酮類(lèi)，而醛酮類(lèi)物質(zhì)與有機(jī)酸發(fā)生酯化反應(yīng)，生成大量酯類(lèi)[18]，酯類(lèi)的變化與尹小慶等[19]在研究小米辣鲊?yán)苯钒l(fā)酵過(guò)程中風(fēng)味物質(zhì)的變化一致。因此，經(jīng)陳釀后，酒精度適當(dāng)降低，芳香味更加突出。

2.2 天麻酵素化過(guò)程中抗氧化活性變化研究

2.2.1 天麻酵素化過(guò)程中T-AOC分析

T-AOC是評(píng)價(jià)樣品中的各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平的重要指標(biāo)[20]。如圖1所示，T-AOC的含量在發(fā)酵前期呈現(xiàn)下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵20 d達(dá)到最低為2.52 μmol/mL；發(fā)酵后期不斷上升，在陳釀階段達(dá)到最高為5.87 μmol/mL，相比于天麻汁上升了0.7倍。這可能是發(fā)酵前期樣品中含有較多的游離羧基與Fe2+形成螯合物，而減少自由基的形成；在發(fā)酵后期微生物酶解一些中性和酸性氨基酸，自由基含量增加[21]。

圖1 天麻酵素化過(guò)程中T-AOC的變化

2.2.2 天麻酵素化過(guò)程中DPPH自由基清除能力分析

DPPH自由基清除率廣泛運(yùn)用于測(cè)定自由基清除能力。由圖2可知，DPPH自由基清除率在整個(gè)酵素化過(guò)程中不斷上升，天麻汁的DPPH自由基清除率只有62.36%，陳釀階段樣品中DPPH自由基清除率最高可達(dá)99.37%，這可能是酵素化過(guò)程中，蛋白質(zhì)在水解酶的作用下水解導(dǎo)致一些具有抗氧化性的氨基酸殘基暴露，DPPH自由基清除率升高[22]。

圖2 天麻酵素化過(guò)程中DPPH的變化

2.2.3 天麻酵素化過(guò)程中SOD活性分析

圖3 天麻酵素化過(guò)程SOD活性的變化

3 結(jié)論與展望

在天麻酵素化過(guò)程中，總氨基酸的含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，陳釀結(jié)束后為1 971.79 mg/100g，天麻汁的EAA/TAA為18.26%，經(jīng)發(fā)酵陳釀后天麻酵素中的EAA/TAA達(dá)到50.76%，相比于天麻汁增加了2.7倍，在呈味氨基酸中，天麻汁以鮮味和苦味為主，經(jīng)陳釀后，天麻酵素以鮮味和甜味為主。天麻汁主要香氣物質(zhì)為醚類(lèi)，發(fā)酵期間，醇類(lèi)在發(fā)酵20 d 達(dá)到最大值為89.61%，醚類(lèi)物質(zhì)被微生物降解，馬尿臭味消失，其主要香氣物質(zhì)為醇類(lèi)和酯類(lèi)，陳釀階段，酯類(lèi)物質(zhì)的相對(duì)含量達(dá)到最高，說(shuō)明陳釀對(duì)香味的形成具有至關(guān)重要的作用。T-AOC、DPPH自由基清除能力與SOD活性在發(fā)酵過(guò)程中整體均呈現(xiàn)逐漸上升的趨勢(shì)，在陳釀結(jié)束后達(dá)到最大值，分別為5.87 μmol/mL、 99.37%與25.72 U/mL，其中SOD活性相比于天麻汁增加了25倍。

天麻是傳統(tǒng)的藥食同源類(lèi)藥物。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)天麻的研究主要關(guān)注于天麻的藥理作用，而對(duì)天麻酵素的開(kāi)發(fā)與研究的報(bào)道較少。因此，本論文初步探討了天麻在不同酵素化階段風(fēng)味物質(zhì)和抗氧化活性的動(dòng)態(tài)變化，后期將對(duì)天麻酵素中的功能性成分進(jìn)行研究，并結(jié)合改善小鼠睡眠實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步深入研究天麻發(fā)酵過(guò)程中的目標(biāo)代謝產(chǎn)物，明晰天麻酵素的藥理活性以及作用機(jī)制，為促進(jìn)天麻的發(fā)展提供理論支撐。