游離型質(zhì)粒在畢赤酵母中表達(dá)人溶菌酶的研究

劉曉宇，李晉，溫賽

(北京工商大學(xué) 輕工科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京，100048)

溶菌酶又稱胞壁質(zhì)酶，是一種普遍存在于植物、動物和微生物中具有殺菌活性的蛋白[1]。溶菌酶通過水解作用切斷N-乙酰胞壁酸與N-乙酰葡萄糖胺之間的β-1,4糖苷鍵[2], 破壞微生物細(xì)胞壁肽聚糖支架, 在內(nèi)部滲透壓的作用下使細(xì)胞脹裂, 引起細(xì)菌裂解, 從而起到防腐和殺菌作用[3]。革蘭氏陽性菌細(xì)胞壁主要成分是肽聚糖，革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁外層大部分是脂多糖，內(nèi)層才含有少量肽聚糖，因此溶菌酶對革蘭氏陽性菌的作用效果遠(yuǎn)大于革蘭氏陰性菌[4]。溶菌酶作為一種天然抗菌蛋白[5]，不會產(chǎn)生細(xì)菌耐藥性、對人體無毒副作用，同時還具有抗病毒[6]、抗炎癥[7]、抗腫瘤[8]、增強(qiáng)免疫力[9]等特性，溶菌酶現(xiàn)已成功應(yīng)用于食品防腐、化妝品、畜牧飼料以及醫(yī)藥[10-13]等領(lǐng)域。提高溶菌酶對革蘭氏陰性菌的作用，及其廣譜殺菌能力成為了目前的學(xué)術(shù)研究熱點[14]，圍繞溶菌酶的非胞壁質(zhì)酶活性進(jìn)行改造是開發(fā)新型廣譜溶菌酶的有效途徑之一[15]。

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)廣泛用于生產(chǎn)具有醫(yī)療或工業(yè)價值的重組蛋白，目前已有上千種蛋白在畢赤酵母系統(tǒng)中成功表達(dá)[16]。畢赤酵母具有甲醇誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動子AOX1，可嚴(yán)格調(diào)控外源基因的表達(dá)[17]。同時相較于原核表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)有高效的蛋白質(zhì)翻譯后修飾和加工的能力，可以使表達(dá)的重組蛋白具有較理想的生物活性。畢赤酵母中多采用整合型表達(dá)載體，酵母的染色體與已被轉(zhuǎn)入含有目的基因的載體發(fā)生同源重組，且有概率發(fā)生基因多拷貝，外源蛋白的表達(dá)量會隨著基因拷貝數(shù)的增加而增加[18]。

目前已經(jīng)在釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)中發(fā)現(xiàn)自主復(fù)制序列(ARS)可用于穿梭質(zhì)粒[19]。CAMATTARI等[20]從乳酸克魯維酵母(Kluyveromyceslactis)中分離并經(jīng)過人工優(yōu)化得到452 bp的panARS(自主復(fù)制序列)(下文簡寫為pARS)，基于pARS序列的游離型表達(dá)載體成功表達(dá)蛋白，與整合型克隆相比，游離型克隆表現(xiàn)出較低的克隆間變異和較高的克隆內(nèi)變異，這是一種有利于重組蛋白的表達(dá)和篩選獲得快速有效的游離型質(zhì)粒。本研究通過人工合成人溶菌酶基因序列與pARS基因序列，插入到pPICZαA表達(dá)載體中，構(gòu)建一種游離型表達(dá)人溶菌酶的畢赤酵母工程菌，為突變篩選新型廣譜人溶菌酶奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

畢赤酵母X33購自武漢淼靈生物科技有限公司；溶壁微球菌由本實驗室保存；One step ZTOPO-Blunt/TA載體、大腸桿菌TOP10購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司；pPICZαA載體由本實驗室保存；人溶菌酶hLYZ基因、酵母自主復(fù)制序列pARS、引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.2 試劑和酶

抗生素zeocin、抗His標(biāo)簽一抗、HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗、電致化學(xué)發(fā)光 (electrochemiluminescence，ECL)Plus超敏發(fā)光液，北京索萊寶科技有限公司；PrimeSTAR?HS(Premix)、XhoI、NotI、In-Fusion酶，寶生物工程(大連)有限公司；T4 DNA連接酶、PciⅠ，NEB(北京)有限公司；核酸分子量Marker，北京全式金生物技術(shù)有限公司；蛋白質(zhì)Marker，Thermo Fisher Scientific；質(zhì)粒小量提取試劑盒、膠回收試劑盒，Omega Bio-Tek公司；快速SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、5 ×蛋白上樣緩沖液、酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒，北京莊盟國際生物基因科技有限公司；二喹啉甲酸(bicinchoninic acid，BCA)法蛋白質(zhì)定量試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司公司；其他試劑均為市售分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

低鹽LB培養(yǎng)基(5.0 g/L氯化鈉、5.0 g/L酵母浸粉、10.0 g/L胰蛋白胨，1 mol/L NaOH調(diào)至pH 7.5)，YPD培養(yǎng)基(10.0 g/L酵母浸粉、20.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L葡萄糖)，YPDS培養(yǎng)基(10.0 g/L酵母浸粉、20.0 g/L蛋白胨、20.0 g/L葡萄糖、1 mol/L山梨醇)，BMGY培養(yǎng)基[10.0 g/L酵母浸粉、20.0 g/L蛋白胨、0.1 mol/L磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)、13.4 g/L 無氨基酵母氮源(yeast nitrogen base W/O amino acids，YNB)、10.0 g/L甘油、4.0×10-4g/L生物素]，BMMY培養(yǎng)基[10.0 g/L酵母浸粉、20.0 g/L蛋白胨、0.1 mol/L 磷酸鉀緩沖液(pH 6.0)、13.4 g/L YNB、5.0 g/L甲醇、4.0×10-4g/L生物素]。固體培養(yǎng)基在對應(yīng)液體培養(yǎng)基的基礎(chǔ)配方上加1.5%～2.0%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))的瓊脂。

1.1.4 儀器與設(shè)備

C1000 Touch PCR儀、PowerPac HC蛋白電泳儀、MicroPulser電穿孔儀，美國Bio-Rad公司；DYY-6C核酸電泳儀、WD-9403D紫外分析儀，北京市六一儀器廠；BioSpectrum?510 Imaging System紫外凝膠成像儀，美國UVP公司；CT15RE臺式微量冷凍離心機(jī)，日本日立公司；Centrifuge 5810R臺式高速離心機(jī)，德國Eppendorf公司；Milli-Q Reference超純水儀，德國默克公司；DL-CJ-2 N超凈工作臺，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；AG CH-4103振蕩培養(yǎng)箱，瑞士INFORS公司；Blue pard恒溫生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；UV-3200紫外可見分光光度計，上海美譜達(dá)儀器有限公司；FiveEasy PH計，瑞士Mettler Toledo公司；BSA223S分析天平，德國Sartorius公司；KTA pure蛋白純化儀，美國GE公司。

1.1.5 引物設(shè)計

根據(jù)人溶菌酶序列hLYZ設(shè)計引物F1和R1，在F1的5′端添加XhoI酶切位點，在R1的5′端添加NotI酶切位點、終止密碼子TAA及6×His標(biāo)簽。根據(jù)來源于乳酸克魯維酵母的自主復(fù)制序列pARS及pPICZαA載體上15 bp同源序列設(shè)計引物F2和R2，并在F2和R2的5′端均添加PciⅠ酶切位點。引物序列見表1。

表1 引物序列

1.2 實驗方法

1.2.1 表達(dá)載體pPICZαA-hLYZ-pARS的構(gòu)建

根據(jù)GenBank上發(fā)表的人溶菌酶基因序列及畢赤酵母密碼子偏愛性人工合成人溶菌酶基因。以pUC57-hLYZ為模板擴(kuò)增并回收片段，將目的片段與One step ZTOPO-Blunt/TA載體連接，構(gòu)建載體T-hLYZ。

以人工合成的pARS序列為模板擴(kuò)增并回收片段，將目的片段與經(jīng)過PciⅠ線性化后的pPICZαA質(zhì)粒通過In-Fusion酶進(jìn)行無縫連接，構(gòu)建載體pPICZαA-pARS。

利用XhoI和NotI對T-hLYZ和pPICZαA-pARS載體雙酶切，膠回收正確位置目的片段，T4 DNA連接酶16 ℃過夜連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pPICZαA-hLYZ-pARS，質(zhì)粒轉(zhuǎn)至大腸桿菌TOP10感受態(tài)，利用菌落PCR篩選陽性轉(zhuǎn)化子，擴(kuò)增質(zhì)粒測序正確后待轉(zhuǎn)化畢赤酵母。

1.2.2 重組載體的電轉(zhuǎn)化及畢赤酵母的篩選

將畢赤酵母X33單克隆經(jīng)搖瓶培養(yǎng)、冰浴、離心、1 mol/L山梨醇重懸處理后得到畢赤酵母X33感受態(tài)細(xì)胞。取10 μL重組游離型質(zhì)粒pPICZαA-hLYZ-pARS和10 μL經(jīng)SacI線性化處理的空載體pPICZαA，分別與80 μL畢赤酵母X33感受態(tài)混合，冰浴后將混合液轉(zhuǎn)移至0.2 cm預(yù)冷的電轉(zhuǎn)杯中電擊(1.5 kV，4～6 ms)，電擊結(jié)束后立即加入預(yù)冷的1 mol/L 山梨醇溶液并轉(zhuǎn)入離心管，30 ℃靜置培養(yǎng) 1 h 后加入500 μL YPD液體培養(yǎng)基靜置復(fù)蘇1 h。取200 μL復(fù)蘇液涂布于含zeocin(100 μg/mL)抗性的YPDS篩選平板上，30 ℃恒溫培養(yǎng)3～4 d直至長出單菌落，利用菌落PCR鑒定陽性轉(zhuǎn)化子，以轉(zhuǎn)化空載體pPICZαA的畢赤酵母作為負(fù)對照。

1.2.3 重組游離型畢赤酵母的表達(dá)

將成功轉(zhuǎn)化游離型重組質(zhì)粒pPICZαA-hLYZ-pARS的單克隆接種于30 mL BMGY培養(yǎng)基中，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=2～6(約16 h)，室溫下4 000 r/min離心10 min收集菌體，用100 mL BMMY培養(yǎng)基重懸至OD600=1左右，30 ℃、250 r/min振蕩培養(yǎng)，每隔12 h取樣0.5 mL，并補(bǔ)加甲醇至終體積分?jǐn)?shù)為0.5%，培養(yǎng)至72 h時，將菌液轉(zhuǎn)移至離心管中，4 000 r/min 離心10 min，分離上清液和菌體于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 重組人溶菌酶的鑒定

上清液樣品用甲醇-氯仿濃縮處理：V(上清液)∶V(甲醇)∶V(氯仿)∶V(超純水)=1∶4∶1∶4配制，劇烈振蕩后冰浴、離心，除去上層甲醇相與下層氯仿相，得到中間層蛋白，適量甲醇重懸后2次離心，除去殘留甲醇后室溫晾干，用適量尿素溶解蛋白得到上清濃縮液。

將上清液濃縮液與5×蛋白上樣緩沖液混合，煮沸后離心，取上清液進(jìn)行SDS-PAGE檢測。SDS-PAGE結(jié)束后，采用濕轉(zhuǎn)法100 V轉(zhuǎn)聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride，PVDF)膜，用含5%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))脫脂奶粉的TBST封閉2 h，抗His標(biāo)簽一抗(1∶5 000 稀釋)4 ℃孵育過夜，TBST洗膜3次、每次10 min，辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase, HRP)標(biāo)記羊抗鼠二抗(1∶4 000稀釋)室溫?fù)u動孵育1 h，TBST洗膜6次、每次5 min，配制新鮮ECL發(fā)光工作液孵育3 min于曝光儀下顯色拍照。

1.2.5 重組人溶菌酶的酶活性測定

利用比濁法對溶菌酶活性進(jìn)行測定[21]。挑取經(jīng)過2次劃線的溶壁微球菌單克隆，接種于LB液體培養(yǎng)基，振蕩培養(yǎng)18 h后，離心菌液并用磷酸鹽緩沖液(pH 6.2)洗滌菌體，重懸至OD450=0.8。準(zhǔn)確稱取2 mL 溶壁微球菌菌懸液置于1 cm比色皿中，將比色皿放入已預(yù)熱的紫外可見分光光度計中，迅速加入0.1 mL重組畢赤酵母發(fā)酵液，快速混勻并計時，記錄反應(yīng)15、75 s時OD450的讀數(shù)，酶活性計算如公式(1)所示：

(1)

式中：ΔOD450為75、15 s時的反應(yīng)液吸光度值的差值；樣品量為每0.1 mL標(biāo)準(zhǔn)酶液中含溶菌酶的體積。

1.2.6 重組人溶菌酶的濃縮與純化

離心重組畢赤酵母發(fā)酵72 h后的發(fā)酵液，60%飽和度硫酸銨沉淀酵母表達(dá)上清液(每100 mL上清液加入36.1 g固體硫酸銨)，一邊加硫酸銨一邊用磁力攪拌器緩慢攪拌，渾濁后于4 ℃靜置1 h以上，15 000 r/min 離心20 min，移去上清液，用適量超純水溶解蛋白沉淀。

濃縮后的蛋白溶液用0.22 μm濾膜過濾，將脫鹽柱(HiTrapTMDesalting 5 mL)與KTA蛋白純化儀相連，在脫鹽Buffer(0.15 mol/L NaCl，0.02 mol/L PBS，pH 7.0)2 mL/min條件下對蛋白溶液進(jìn)行脫鹽處理。

脫鹽后的樣品經(jīng)鎳親和層析柱(HisTrap HP 1 mL)洗脫得到純化的人溶菌酶。再次利用脫鹽柱對純化后的人溶菌酶處理以除去高濃度咪唑。

1.2.7 重組人溶菌酶的濃度測定

利用BCA蛋白質(zhì)定量試劑盒測定純化、脫鹽除咪唑后的人溶菌酶，根據(jù)已知濃度的牛血清白蛋白(bovine albumin ，BSA)用緩沖液稀釋不同濃度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過樣品在562 nm處的吸光值計算蛋白濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)載體pPICZαA-hLYZ-pARS的構(gòu)建與驗證

利用引物F1、R1通過PCR擴(kuò)增得到目的基因序列hLYZ，將PCR產(chǎn)物回收后與One step ZTOPO-Blunt/TA載體連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中，菌落PCR鑒定為陽性克隆后提取重組質(zhì)粒T-hLYZ。利用引物F2、R2通過PCR擴(kuò)增得到酵母自主復(fù)制序列pARS，將回收后的PCR產(chǎn)物與線性化后的pPICZαA質(zhì)粒通過In-Fusion酶無縫連接，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中，菌落PCR鑒定為陽性克隆后提取重組質(zhì)粒pPICZαA-pARS。

對克隆載體T-hLYZ和游離型畢赤酵母表達(dá)載體pPICZαA-pARS分別進(jìn)行XhoI和NotI雙酶切。將酶切產(chǎn)物進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳驗證，結(jié)果見圖1，回收正確條帶處目的基因片段與pPICZαA-pARS載體片段。利用T4 DNA連接酶過夜連接2個片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌TOP10中。經(jīng)菌落PCR驗證及DNA序列測序證明成功構(gòu)建游離型表達(dá)載體pPICZαA-hLYZ-pARS，經(jīng)華大基因測序，結(jié)果正確。構(gòu)建的表達(dá)載體圖譜如圖2所示。

M1、M2-核酸分子量marker；1～2-Xho I、Not I雙酶切T-hLYZ；3～4-Xho I、Not I雙酶切pPICZαA-pARS；

圖2 pPICZαA-hLYZ-pARS質(zhì)粒圖譜

2.2 重組載體在畢赤酵母X33的電轉(zhuǎn)化及篩選

重組表達(dá)載體pPICZαA-hLYZ-pARS電轉(zhuǎn)至畢赤酵母X33后以游離形態(tài)存在于酵母中。在含zeocin(100 μg/mL)的YPDS平板上篩選長勢較好的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR，得到的陽性轉(zhuǎn)化子接種于2 mL含zeocin的YPD中過夜培養(yǎng)，用酵母質(zhì)粒小量提取試劑盒提取游離質(zhì)粒后利用pPICZαA通用引物擴(kuò)增目的片段，由圖3的鑒定結(jié)果可證明基因被成功轉(zhuǎn)入畢赤酵母中且重組載體為游離型。

M-核酸分子量marker；1-轉(zhuǎn)入pPICZαA的X33菌落PCR；2～3-轉(zhuǎn)入pPICZαA-hLYZ-pARS的X33質(zhì)粒PCR

2.3 蛋白電泳及Western Blot檢測

取重組酵母72 h搖瓶誘導(dǎo)表達(dá)上清濃縮液做電泳鑒定，同時以轉(zhuǎn)入空載體pPICZαA畢赤酵母誘導(dǎo)上清濃縮液作為負(fù)對照，進(jìn)行SDS-PAGE分析。蛋白電泳結(jié)束后濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)PVDF膜，進(jìn)行Western Blot鑒定，結(jié)果如圖4所示。

M-蛋白分子量marker；1-空載體；2-pPICZαA-hLYZ-pARSa-SDS-PAGE圖；b-Western Blot圖

2.4 人溶菌酶的酶活性檢測

經(jīng)比濁法分別對重組酵母發(fā)酵0、12、24、36、48、60、72 h的上清液進(jìn)行酶活性測定，同時以轉(zhuǎn)入空載體的酵母發(fā)酵液作為負(fù)對照。經(jīng)過公式計算酶活性，結(jié)果如圖5所示，證明重組人溶菌酶具有生物活性，酶活性最高在發(fā)酵72 h，可達(dá)340 U/mL。

圖5 重組人溶菌酶的酶活性測定

2.5 人溶菌酶的純化、活性檢測及濃度測定

在0.6 mol/L咪唑條件下，重組人溶菌酶被洗脫出來，SDS-PAGE蛋白電泳結(jié)果如圖6所示，在14.7 kDa 左右有條帶，與人溶菌酶理論分子質(zhì)量大小一致。純化后的人溶菌酶經(jīng)比濁法測定后，酶活性可達(dá)到1 070 U/mL。利用BCA法，并以BSA為標(biāo)品繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，經(jīng)562 nm處樣品吸光度值計算所得人溶菌酶蛋白質(zhì)量濃度為0.954 mg/mL。

M-蛋白分子量marker；1-純化后的重組人溶菌酶

3 結(jié)論與討論

研究顯示，來自乳酸克魯維酵母的pARS序列可成功用于構(gòu)建畢赤酵母質(zhì)粒，CAMATTARI等[20]利用pARS序列構(gòu)建的游離質(zhì)粒能在畢赤酵母中自主復(fù)制，且穩(wěn)定性達(dá)到97%；谷洋[22]比較了5種ARSs(來自畢赤酵母的PARS1、PpARS2、mitoARS，來自釀酒酵母的ScARS和來自乳酸克魯維酵母的pARS)作為復(fù)制子時，對質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率、質(zhì)?？截悢?shù)及穩(wěn)定性的影響，其中pARS穩(wěn)定性和拷貝數(shù)最高。

人溶菌酶在畢赤酵母中表達(dá)多為整合型，很少利用游離型，這是因為游離型質(zhì)粒不能自主復(fù)制且極不穩(wěn)定，但整合型質(zhì)粒會以1%～10%的概率通過同源重組插入酵母染色體中產(chǎn)生多拷貝子，對突變文庫篩選產(chǎn)生干擾。添加自主復(fù)制序列的游離質(zhì)粒，改善了以往普遍游離質(zhì)粒的缺點，能夠在細(xì)胞中自主復(fù)制、穩(wěn)定傳代。本研究將乳酸克魯維酵母中的自主復(fù)制序列(pARS)與酵母整合型分泌表達(dá)載體pPICZαA連接，構(gòu)建得到游離型表達(dá)載體pPICZαA-pARS，電轉(zhuǎn)至畢赤酵母表達(dá)菌株X33中。經(jīng)甲醇誘導(dǎo)72 h，比濁法測得發(fā)酵上清液酶活性可達(dá)340 U/mL。發(fā)酵上清液濃縮純化后經(jīng)SDS-PAGE和Western Blot分析，在14.7 kDa有目的條帶。雖然游離型重組酵母表達(dá)人溶菌酶活性不如整合型高，但游離型重組載體適用于基因突變文庫的構(gòu)建和篩選，不受多拷貝子的影響，可以利用高通量篩選方法篩選出殺菌作用效果更加明顯的溶菌酶突變體，為改造開發(fā)新型廣譜人溶菌酶奠定了基礎(chǔ)。